Name: in vitro wedge slice preparation for mimicking in vivo neuronal circuit connectivity
Uploaded: 2020-08-18T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about In Vitro Wedge Slice Preparation for Mimicking In Vivo Neuronal Circuit Connectivity at JoVE.com

Diese Forschung wurde durch das Intramural Research Program des NIH, NIDCD, Z01 DC000091 (CJCW) unterstützt.

Alle experimentellen Verfahren wurden vom National Institute of Neurological Disorders and Stroke/National Institute on Deafness and Other Communication Disorders Animal Care and Use Committee genehmigt.
1. Experimentelle Präparate
HINWEIS: Details zur Scheibenvorbereitung einschließlich Schneidlösung, Schnitttemperatur, Inkubationstemperatur und Apparat (etc.) sind spezifisch für die Inkubation des Gehirns, die in diesem Experiment durchgeführt wird. Slice-Inkub...

Das hier beschriebene Schneidverfahren, das als Keilscheibe bezeichnet wird, ist mächtig für die Aufrechterhaltung intakter präsynaptischer neuronaler Schaltkreise, aber mit der Zugänglichkeit von Gehirnscheibenexperimenten zur Analyse der neuronalen Funktion. In mehreren ersten Schritten muss große Vorsicht geboten sein, um den Nutzen der Vorbereitung für die Schaltungsanalyse zu maximieren. Die Abmessungen des Keils sollten durch histologische Untersuchung bestätigt werden, die integral für die Bestätigung ist...

Die Beobachtung der Aktivität neuronaler Schaltkreise wird idealerweise mit nativen sensorischen Eingaben und Rückkopplungen sowie einer intakten Konnektivität zwischen Hirnregionen in vivo durchgeführt. Die Durchführung von Experimenten, die eine einzellige Auflösung der funktionalen Schaltkreise geben, ist jedoch immer noch durch technische Herausforderungen im intakten Gehirn begrenzt. Während in vivo extrazelluläre Elektrophysiologie oder Multiphotonen-Bildgebungsverfahren zur Untersuchung von Aktivitäten in intakten Nervensystemen eingesetzt werden können, bleibt die Interpretation, wie verschiedene Eingänge integrieren oder die subschwelligen synaptischen Eingänge zu messen, schwierig. In vivo Vollzellaufnahmen überwinden diese Einschränkungen, sind aber selbst in Leicht zugänglichen Hirnregionen anspruchsvoll. Technische Herausforderungen von Einzelzell-Auflösungsexperimenten werden in bestimmten Neuronenpopulationen, die sich tief im Gehirn befinden, oder in räumlich diffusen Populationen, die entweder genetische Werkzeuge zur Lokalisierung von Zellen in vivo (z. B. genetische Expression von Channelrhodopsin gepaart mit Optrode-Aufzeichnung) oder post-hoc-histochemische Identifizierung nach der Erfassung von Standortkennzeichnungen (z. B. mit neurotransmissionsspezifischen Markern) weiter verstärkt. Die medialen Olivocochlear-Neuronen, die sich diffus in der Nähe der ventralen Oberfläche des Hirnstamms befinden, leiden unter den oben genannten Einschränkungen1, was den Zugang zu In-vivo-Experimenten extrem erschwert.
Gehirn-Scheiben (100-500 m Dicke) sind seit langem verwendet worden, um Gehirn-Schaltungen zu studieren, einschließlich auditive Hirnstamm Schaltung, wegen der physischen Segregation der verbundenen Neuronen, die in der gleichen Scheibeenthaltensind 2,3,4,5,6,7,8,9. Experimente mit viel dickeren Scheiben (>1 mm) wurden in anderen Labors eingesetzt, um zu verstehen, wie sich bilaterale Inputs in Bereichen des überlegenen Olivary-Komplexes (SOC) integrieren, einschließlich der medialen überlegenen Olive10,11. Diese Scheiben wurden so hergestellt, dass Axone des Hörnervs (AN) innerhalb der Scheibe intakt blieben und elektrisch stimuliert wurden, um synaptische Neurotransmitter-Freisetzung in der CN zu initiieren, die Aktivität von Hörneuronen erster Ordnung imitiert, wie sie auf Schall reagieren würden. Ein großer Nachteil dieser dicken Scheiben ist die Sichtbarkeit von Neuronen für elektrophysiologische Aufnahmen mit Patch-Clamp ("Patching"). Patching wird immer schwieriger, da die zahlreichen Axone in diesem Bereich mit12,13,14,15Myelinatiert werden, wodurch das Gewebe auch in einer typischen, dünnen Hirnscheibe optisch dicht und verdunkelt wird. Unser Ziel ist es, In-vitro-Präparate zu entwickeln, die eher der Schaltungskonnektivität von In-vivo-Aufnahmen ähneln, aber mit den hochdurchsatz- und hochauflösenden Aufnahmefähigkeiten der visuell geführten Patch-Clamp-Elektrophysiologie in Hirnscheiben.
Unser Labor untersucht die Physiologie von Neuronen des auditiven efferenten Systems, einschließlich MOC-Neuronen. Diese cholinergen Neuronen liefern efferent Essrücke an die Cochlea durch Modulation der Aktivität der äußeren Haarzellen (OHCs)16,17,18,19,20. Frühere Studien haben gezeigt, dass diese Modulation eine Rolle bei der Gain-Kontrolle in der Cochlea21,22,23,24,25,26 und Schutz vor akustischen Trauma27,28,29,30,31,32,33. Bei Mäusen befinden sich MOC-Neuronen diffus im ventralen Kern des Trapezkörpers (VNTB) im auditiven Hirnstamm1. Unsere Gruppe hat die ChAT-IRES-Cre Mauslinie verwendet, die mit der tdTomato Reporter-Mauslinie gekreuzt wurde, um MOC-Neuronen in Hirnstammscheiben unter epifluoreszierender Beleuchtung anzuvisieren. Wir zeigten, dass MOC-Neuronen einen afferent hemmenden Input aus dem ipsilateralen Medialkern des Trapezkörpers (MNTB) erhalten, der wiederum durch Axone aus kugelförmigen Buschzellen (GBC) im kontralateralen Cochlea-Kern (CN)34,35,36,37,38angeregt wird. Zusätzlich erhalten MOC-Neuronen wahrscheinlich ihren exzitatorischen Input von T-Stellatzellen im kontralateralen CN39,40,41. Zusammengenommen zeigen diese Studien, dass MOC-Neuronen sowohl erregende als auch hemmende Eingaben erhalten, die vom gleichen (kontralateralen) Ohr abgeleitet werden. Jedoch, die präsynaptischen Neuronen, und ihre Axone konvergieren auf MOC Neuronen, sind nicht ganz nah genug aneinander, um vollständig intakt in einem typischen koronalen Scheibenpräparat zu sein. Um zu untersuchen, wie die Integration von synaptischen Inputs in MOC-Neuronen ihre Wirkungspotenziale beeinflusst, mit einem Fokus auf neu beschriebene Hemmung, entwickelten wir ein Präparat, bei dem wir die verschiedenen Afferents zu MOC-Neuronen von einem Ohr aus auf physiologisch realistische Weise stimulieren konnten, aber mit den technischen Vorteilen von In-vitro-Gehirnscheibenexperimenten.
Die Keilscheibe ist ein modifiziertes dickes Scheibenpräparat, das für die Untersuchung der Schaltungsintegration in MOC-Neuronen entwickelt wurde (schematisiert in Abbildung 1A). Auf der dicken Seite der Scheibe enthält der Keil die abgetrennten Axone des Hörnervs (nachfolgend "auditorische Nervenwurzel" genannt), wenn sie aus der Peripherie in das Hirnstamm gelangen und in der KN Synapsen synapsisch. Die auditive Nervenwurzel kann elektrisch stimuliert werden, um Neurotransmitter-Freisetzung und synaptische Aktivierung von Zellen der vollständig intakten CN42,43,44,45,46zu evozieren. Dieses Stimulationsformat hat mehrere Vorteile für die Schaltungsanalyse. Erstens stimulieren wir die AN, anstatt die Initiativ- und GBC-Axone, die einen affeten Input in die MOC-Neuronen liefern, direkt zu stimulieren, um die Aktivierung von intrinsischen Schaltkreisen zu ermöglichen, die in der CN reichlich vorhanden sind. Diese Schaltkreise modulieren die Ausgabe von CN-Neuronen zu ihren Zielen im gesamten Gehirn, einschließlich MOC-Neuronen46,47,48,49,50,51. Zweitens ermöglicht die polysynaptische Aktivierung von affemittenten Schaltkreisen vom AN über die CN vor dem CN von MOC-Neuronen ein natürlicheres Aktivierungs-Timing und eine Plastizität an diesen Synapsen, wie sie es in vivo während der auditiven Stimulation tun würden. Drittens können wir unsere Stimulationsmuster variieren, um AN-Aktivität nachzuahmen. Schließlich sind sowohl erregende als auch hemmende monaurale Projektionen auf MOC-Neuronen in der Keilscheibe intakt, und ihre Integration kann an einem MOC-Neuron mit der Präzision der Patch-Clamp-Elektrophysiologie gemessen werden. Insgesamt bietet dieses Aktivierungsschema einen intakteren Kreislauf zu den MOC-Neuronen im Vergleich zu einer typischen Gehirnscheibenpräparation. Diese Hirnstamm-Keilscheibe kann auch verwendet werden, um andere gehörive Bereiche zu untersuchen, die hemmende Inputs von ipsilateralem MNTB erhalten, einschließlich der lateralen überlegenen Olive, des überlegenen Olivary-Kerns und der medialen Superior Olive10,11,52,53,54,55,56. Über unsere spezifische Präparation hinaus kann diese Schneidemethode verwendet oder modifiziert werden, um andere Systeme zu bewerten, mit den Vorteilen der Aufrechterhaltung der Konnektivität von Langzeiteingaben und der Verbesserung der Visualisierung von Neuronen für eine Vielzahl von einzelligen Elektrophysiologie- oder Bildgebungstechniken.
Dieses Protokoll erfordert die Verwendung einer Vibram-Stufe oder Plattform, die ca. 15° geneigt werden kann. Hier verwenden wir eine handelsübliche 2-teilige magnetische Bühne, bei der die "Bühne" eine Metallscheibe mit einem gekrümmten Boden in einer konkaven magnetischen "Bühnenbasis" ist. Die Bühne kann dann verschoben werden, um den Schnittwinkel anzupassen. Konzentrische Kreise auf der Bühnenbasis werden verwendet, um den Winkel reproduzierbar abzuschätzen. Die Bühnen- und Bühnenbasis befindet sich in der Schneidkammer, wo auch die magnetische Bühnenbasis gedreht werden kann.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Experimental Preparations</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar, powder</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP1423500</td>
			<td>4% agar block used to stabilize brain tissue during vibratome sectioning</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AlexaFluor Hydrazide 488</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A10436</td>
			<td>Fluorophore used in internal solution to confirm successful MOC neuron patch</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Analytical Balance</td>
			<td>Geneses Scientific (Intramalls)</td>
			<td>AV114</td>
			<td>Weighing chemicals</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Double edged razor blade</td>
			<td>Ted Pella</td>
			<td>121-6</td>
			<td>Vibratome cutting blade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kynurenic acid (5g)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>K3375-5G</td>
			<td>Slicing ACSF additive used to reduce neuron activity during dissection and slicing in order to improve tissue health for patch clamping</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH Meter</td>
			<td>Fisher Scientific (Intramalls)</td>
			<td>13-620-451</td>
			<td>Solution pH tester</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic petri dishes 100mm dia X 20mm</td>
			<td>Fisher Scientific (Intramalls)</td>
			<td>12-556-002</td>
			<td>4% Agar Prep</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stirring Hotplate</td>
			<td>Fisher Scientific (Intramalls)</td>
			<td>11-500-150</td>
			<td>Heating for 4% Agar preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissection and Slicing</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biocytin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>B4261-250MG</td>
			<td>Chemical used for axonal tracing (conjugated to Streptavidin 488)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting Microscope</td>
			<td>Amscope</td>
			<td>SM-1BN</td>
			<td>For precision dissection during brain removal</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #5 Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11252-20</td>
			<td>Fine forceps dissection tool</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Economy tweezers #3</td>
			<td>WPI</td>
			<td>501976</td>
			<td>Forceps dissection tool</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Petri Dish 150mm dia x 15mm H</td>
			<td>Fisher Scientific (Intramalls)</td>
			<td>08-747E</td>
			<td>Dissection dish</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Interface paper (203 X 254mm PCTE Membrane 10um)</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td>1220823</td>
			<td>Slice incubation/biocytin application</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica VT1200S Vibratome</td>
			<td>Leica</td>
			<td>1491200S001</td>
			<td>Vibratome for wedge slice sectioning</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mayo scissors</td>
			<td>Roboz</td>
			<td>RS-6872</td>
			<td>Dissection tool</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Single-edged carbon steel blades</td>
			<td>Fisher Scientific (Intramalls)</td>
			<td>12-640</td>
			<td>Razor blade for dissection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Specimen disc, orienting</td>
			<td>Leica</td>
			<td>14048142068</td>
			<td>Specialized vibratome stage for reproducible tilting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spoonula</td>
			<td>FisherSci</td>
			<td>14-375-10</td>
			<td>Dissection tool</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Super Glue</td>
			<td>Newegg</td>
			<td>15187</td>
			<td>Used for glueing tissue to vibratome stage</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vannas Spring Scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>91500-09</td>
			<td>Dissection tool</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electrophysiology</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>A1R Upright Confocal Microscope</td>
			<td>Nikon Instruments</td>
			<td></td>
			<td>Electrophysiology and imaging microscope, can be any microscope compatible with electrophysiology</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electrode Borosilicate glass w/ Filament OD 1.5mm, ID 1.1mm, 10 cm long</td>
			<td>Sutter Instrument</td>
			<td>BF150-110-10</td>
			<td>Patch clamping pipette glass</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electrode Filler MicroFil</td>
			<td>WPI</td>
			<td>CMF20G</td>
			<td>Patch electrode pipette filler</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>In-line solution heater</td>
			<td>Warner Instruments (GSAdvantage)</td>
			<td>SH-27B</td>
			<td>Slice perfusion system heater</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multi-Micromanipulator Systems</td>
			<td>Sutter Intruments</td>
			<td>MPC-200 with MP285</td>
			<td>Micromanipulators for patch clamp and stimulation electrode placement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P-1000 horizontal pipette puller for glass micropipettes</td>
			<td>Sutter instruments</td>
			<td>FG-P1000</td>
			<td>Patch clamp pipetter puller</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Patch-clamp amplifier and Software</td>
			<td>HEKA</td>
			<td>EPC-10 / Patchmaster Next</td>
			<td>Can be any amplifier/software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recording Chamber</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>RC26G</td>
			<td>Slice &#34;bath&#34; during recording</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recording Chamber Harp</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>640253</td>
			<td>Stablizes slice during electrophysiology recording</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slice Incubation Chamber</td>
			<td>Custom Build</td>
			<td></td>
			<td>Heated, oxygenated holding chamber for slices during recovery after slicing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stimulus isolation unit</td>
			<td>A.M.P.I.</td>
			<td>Iso-Flex</td>
			<td>Stimulus isolation unit for electrophysiology</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe 60CC</td>
			<td>Fischer Scientific (Intramalls)</td>
			<td>14-820-11</td>
			<td>Electrophysiology perfusion fluid handling</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Temperature controller</td>
			<td>Warner Instruments (GSAdvantage)</td>
			<td>TC-324C</td>
			<td>Slice perfusion system temperature controller</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tubing 1/8 OD 1/16 ID</td>
			<td>Fischer Scientific (Intramalls)</td>
			<td>14-171-129</td>
			<td>Electrophysiology perfusion fluid handling</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tugsten concentric bipolar microelectrode</td>
			<td>WPI</td>
			<td>TM33CCINS</td>
			<td>Stimulating electrode for electrophysiology</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Histology</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24 well Plate</td>
			<td>Fisher Scientific (Intramalls)</td>
			<td>12-556006</td>
			<td>Histology slice collection and immunostaining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 Streptavidin</td>
			<td>Jackson Immuno labs</td>
			<td>016-540-084</td>
			<td>Secondary antibody for biocytin visualization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning Orbital Shaker</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>CLS6780FP</td>
			<td>Shaker for immunohistochemistry agitation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cresyl Violet Acetate</td>
			<td>Sigma Aldrich (Intramalls)</td>
			<td>C5042-10G</td>
			<td>Cellular stain for histology</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable Microtome Blades</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>22-210-052</td>
			<td>Sliding microtome blade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter-syringe Nalgene 4mm Cellulose Acetate 0.2um</td>
			<td>Fisher Scientific (Intramalls)</td>
			<td>09-740-34A</td>
			<td>Syringe filter for filling recording pipettes with internal solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluoromount-G Slide Mounting Medium</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>OB100-01</td>
			<td>Immunohistochemistry fluorescence mounting medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glass slide staining dish with rack</td>
			<td>Fisher Scientific (Intramalls)</td>
			<td>08-812</td>
			<td>Cresyl Violet staining chamber</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microm HM450 Sliding Microtome</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>910020</td>
			<td>Freezing microtome for histology</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Cover Glasses: Rectangles 50mm X 24mm</td>
			<td>Fisher Scientific (Intramalls)</td>
			<td>12-543D</td>
			<td>Histochemistry slide cover glass</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Permount mounting medium</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>SP15-100</td>
			<td>Cresyl violet section mounting medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superfrost Slides</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>22-034980</td>
			<td>Histology slides</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vitro wedge slice preparation for mimicking in vivo neuronal circuit connectivity

In-vitro-Scheibenelektrophysiologie-Techniken messen die einzellige Aktivität mit präziser elektrischer und zeitlicher Auflösung. Gehirnscheiben müssen relativ dünn sein, um Neuronen für Patch-Clamping oder Bildgebung richtig zu visualisieren und zugreifen, und die In-vitro-Untersuchung der Gehirnschaltung ist auf das beschränkt, was physisch in der akuten Scheibe vorhanden ist. Um die Vorteile von In-vitro-Scheibenexperimenten bei gleichzeitiger Erhaltung eines größeren Anteils präsynaptischer Kerne zu erhalten, haben wir eine neuartige Scheibenzubereitung entwickelt. Diese "Keilscheibe" wurde für Patch-Clamp-Elektrophysiologie-Aufnahmen entwickelt, um die vielfältigen monauralen, schallgetriebenen Eingänge zu medialen Olivocochlearen (MOC)-Neuronen im Hirnstamm zu charakterisieren. Diese Neuronen erhalten ihre primären afferenten erregenden und hemmenden Eingänge von Neuronen, die durch Reize im kontralateralen Ohr und entsprechenden Cochlea-Kern (CN) aktiviert werden. Es wurde eine asymmetrische Hirnscheibe entwickelt, die am dicksten in der rostro-kaudalen Domäne am seitlichen Rand einer Hemisphäre ist und dann zum seitlichen Rand der gegenüberliegenden Hemisphäre dünnt. Diese Scheibe enthält auf der dicken Seite die auditive Nervenwurzel, die Informationen über auditive Reize an das Gehirn, die intrinsische CN-Schaltung und sowohl die disynaptischen exzitattischen als auch trisynaptischen hemmenden affetiveren Bahnen, die auf kontralateralen MOC-Neuronen konvergieren, transportiert. Die Aufnahme erfolgt von MOC-Neuronen auf der dünnen Seite der Scheibe, wo sie mit DIC-Optik für typische Patch-Clamp-Experimente visualisiert werden. Die direkte Stimulation des Hörnervs wird beim Eintritt in den auditiven Hirnstamm durchgeführt, wodurch die intrinsische CN-Kreisaktivität und die synaptische Plastizität an Synapsen vor den MOC-Neuronen auftreten können. Mit dieser Technik kann man die In-vivo-Schaltungsaktivierung so nah wie möglich innerhalb der Scheibe imitieren. Diese Keilscheibenpräparation ist auf andere Gehirnkreise anwendbar, bei denen Schaltungsanalysen von der Erhaltung der vorgelagerten Konnektivität und der langfristigen Eingänge in Kombination mit den technischen Vorteilen der In-vitro-Slice-Physiologie profitieren würden.

Histologische Untersuchung der Keilscheibe Für unsere Untersuchung der auditiven Hirnstamm-Neuron-Funktion wurde das Keilscheibenpräparat entwickelt, um die auditive Nervenwurzel und CN kontralateral zu den MOC-Neuronen zu enthalten, die für Aufnahmen bestimmt sind (Beispielscheibe in Abbildung 1B). Eine erste histologische Untersuchung der Zubereitung ist wichtig, um zu bestätigen, dass die Scheibe die für die Schaltungsaktivierung notwendigen Kerne enthält und das...

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In Vitro Wedge Slice Preparation for Mimicking In Vivo Neuronal Circuit Connectivity

Die Integration verschiedener synaptischer Inputs in Neuronen wird am besten in einer Zubereitung gemessen, die alle präsynaptischen Kerne für natürliches Timing und Schaltplastizität bewahrt, aber Gehirnscheiben trennen in der Regel viele Verbindungen. Wir entwickelten eine modifizierte Gehirnscheibe, um die In-vivo-Schaltungsaktivität nachzuahmen und gleichzeitig die In-vitro-Experimentierfähigkeit aufrechtzuerhalten.

In Vitro Wedge Slice Vorbereitung für Diemimitieren In Vivo Neuronal Circuit Connectivity

In vitro slice electrophysiology techniques measure single-cell activity with precise electrical and temporal resolution. Brain slices must be relatively ...

Gehirnscheibenexperimente ermöglichen das Verhören der neuronalen Funktion mit hoher elektrischer und zeitlicher Auflösung, aber diese Scheiben trennen in der Regel viele präsynaptische Verbindungen. Eine keilförmige Scheibe hält eine intaktere präsynaptische Schaltung aufrecht. Diese modifizierte Gehirnscheibe unterhält einen vollständigeren in vivo-ähnlichen neuronalen Kreislauf und bietet gleichzeitig die Vorteile von In-vitro-Experimenten, wie z. B. visuell geführte Patch-Klemmenaufzeichnungen, Pharmakologie und Aktivitäts-Bildgebung.Genaue Keilschnittgeometrie kann anhand der Atlaspositionen der Neuronen innerhalb des Schaltkreises geschätzt werden, aber die Integrität der präsynaptischen Schemata und Axone sollte mithilfe der Histologie bestimmt werden. Beginnen Sie mit einer Rasierklinge, um die Haut an der Mittellinie des Schädels von der Nase bis zum Nacken zu schneiden. Schälen Sie die Haut zurück, um den Schädel freizulegen und beginnend an der Basis des Schädels und weiter in Richtung der Nase, verwenden Sie eine kleine Schere, um einen Schnitt in den Schädel durch die Mittellinie zu machen.An der Lambda-Nähte, machen Schnitte im Schädel von der Mittellinie seitlich in Richtung des Ohres auf beiden Seiten, um den Schädel zurück zu schälen, um das Gehirn zu belichten. Beginnend am rostralen Ende, verwenden Sie einen kleinen Laborspachtel, um das Gehirn sanft aus dem Schädel zu heben, damit die Sehnerven abgetrennt werden können. Fahren Sie fort, das Gehirn sanft nach hinten zu arbeiten, die ventrale Oberfläche freizulegen und feine Zangen zu verwenden, um die trigeminalen Nerven in der Nähe der ventralen Oberfläche des Hirnstamms vorsichtig zu kneifen, um sie zu schneiden.Legen Sie die Zubereitung in eine glasierte Petrischale, die mit kalter Schneidlösung gefüllt ist, und legen Sie die Schale unter ein Seziermikroskop. Trimmen Sie die Gesichtsnerven in der Nähe des Hirnstamms, um die Vestibulocochlea-Nerven freizulegen. Verwenden Sie feine Zange, um die Spitzen in die Foramina zu schieben, wo der Vestibulocochlea-Nerv den Schädel so weit wie möglich verlässt.Pinch, um die Nerven auf beiden Seiten zu trennen, so dass die Nervenwurzel am Hirnstamm befestigt. Entfernen Sie die Hirnhaut und Vaskulatur von der ventralen Oberfläche des Hirnstamms in der Nähe des Trapezkörpers. Dann kneifen Sie die verbleibenden Hirnnerven und Bindegewebe, um das Gehirn vollständig aus dem Schädel zu befreien, wobei Sie darauf achten, das verbleibende Rückenmark zu erhalten, wenn möglich.Um die Oberfläche des Gehirns für die Fixture auf die Bühne vorzubereiten, stellen Sie die Hirnventralseite nach oben und verwenden Sie ein stumpfes Werkzeug, um das Rückenmark sanft zu immobilisieren, um das Gehirngewebe zu stabilisieren. Setzen Sie offene Zangen in einem etwa 20-Grad-Winkel durch das Gehirn an den Boden der Schale, so dass die Spitzen verlassen die dorsale Oberfläche des Gehirns kaudal zum optischen Chiasm und verwenden Sie eine Rasierklinge entlang der Zange zu schneiden. Als nächstes bereiten Sie einen einen Kubikzentimeter Block von 4%Agar vor und verteilen einen kleinen Tropfen Kleber in ein Rechteck auf der Bühne.Verwenden Sie Zangen, um das Gehirn vorsichtig zu heben und sanft die überschüssige Flüssigkeit mit dem Rand eines Papiertuchs zu tappen. Legen Sie dann die blockierte Oberfläche auf den Kleber, so dass die ventrale Oberfläche während des Schneidens in Richtung der Klinge gerichtet ist und den Agarblock als Stütze sanft gegen die rückende Oberfläche drückt. Um Keilscheiben mit der Cochlea-Nervenwurzel auf der dicken Seite und den medialen Olivocochlearen und dem medialen Kern des Trapezkörpers auf der dünnen Seite zu erwerben, legen Sie die Magnetscheibe mit dem angeschlossenen Gehirn auf den Bühnenhalter und legen Sie den Halter in die Schnittkammer eines Vibratome mit der ventralen Oberfläche des Gehirns, die auf die Klinge ausgerichtet ist.Füllen Sie die Kammer mit eiskalter Schneidlösung und senken Sie die Klinge in die Carbogenblasenlösung. Schneiden Sie Slices kaudal in den Bereich von Interesse, um sicherzustellen, dass die Scheiben symmetrisch sind. Dann verschieben Sie die Bühne etwa 15 Grad auf eine Seite.Schneiden Sie vorsichtig weiter, bis die Hörnerbwurzel auf der einen Seite nahe an der Oberfläche ist und der Gesichtsnerv an der Oberfläche der anderen Seite der Scheibe zu sehen ist. Verschieben Sie die Bühne um 15 Grad zurück in die ursprüngliche Position und bewegen Sie die Klinge vom Gewebe weg. Drehen Sie die Bühnenbasis um 90 Grad, so dass die seitliche Kante der dünnen Seite der Klinge zugewandt ist, und senken Sie die Klinge mehrere hundert Mikrometer, bevor sie die Klinge langsam nahe an den Rand des Gewebes bringt.Mit der Klinge etwas tiefer zurückgezogen die Klinge auf die gewünschte Dicke der dünnen Kante der Scheibe. Bewegen Sie die Klinge vom Gewebe zurück und drehen Sie die Bühnenbasis zurück, sodass die ventrale Oberfläche der Bühnenbasis zuzeigt. Machen Sie einen Schnitt, um die rostrale Oberfläche der Keilscheibe zu bestimmen und übertragen Sie die Scheibe auf ein Quadrat zentimetergroßes Stück Interface-Papier-Caudle-Oberfläche nach unten.Der Gesichtsnerv sollte auf beiden Hemisphären der Scheibe auf der rostralen Oberfläche sichtbar sein. Dann bewegen Sie die Scheibe auf eine 35 Grad Celsius Inkubationskammer, um für 30 Minuten zu erholen. Um die Keilscheibe für die Elektrophysiologieanalyse einzurichten, legen Sie die Probe in eine Aufnahmekammer, die kontinuierlich mit 35 Grad Celsius ACSF durchlässig wird, und stabilisieren Sie die Scheibe.Mit DIC-Optik, konzentrieren Sie sich auf die auditive Nervenwurzel auf der dicken Seite der Scheibe und verwenden Sie einen Mikromanipulator, um die bipolare Wolfram stimulierende Elektrode auf die auditive Nervenwurzel und sanft in die Oberfläche des Gewebes zu bewegen. Bewegen Sie das Sichtfeld auf den ventralen Kern des Trapezkörpers auf der dünnen Seite und wählen Sie ein mediales Olivocochlear-Neuron als Ziel für die Patchklemmenelektrophysiologie unter Epifluoreszenz mit einem 561 Nanometer-Emissionsfilter. Füllen Sie eine Aufnahmepipette mit der entsprechenden internen Lösung für das vorgeschlagene Experiment und unter DIC-Optik Patch und Aufnahme aus dem medialen Olivocochlear Neuron in der Ganzzellkonfiguration.Passen Sie die elektrische Stimulationsamplitude der auditiven Nervenwurzel an, um konsistente postsynaptische Ereignisse im medialen Olivocochlear-Neuron zu erhalten. Führen Sie dann geeignete Stimulationsprotokolle aus, um evozierte synaptische Ströme in medialen Olivocochlearen-Neuronen zu beobachten. Dieses Keilscheibenpräparat ist so konzipiert, dass es die auditive Nervenwurzel und den Cochlea-Kern kontralateral zu den medialen Olivocochlearen-Neuronen enthält, die für Aufnahmen bestimmt sind.In dieser kresylviolett gefärbten resektionierten Keilscheibe ist der Cochlea-Kern in fast seiner vollen rostral-kaudalen Ausdehnung vorhanden. Und die auditive Nervenwurzel wird beim Eindringen in den Cochlea-Kern beobachtet. Darüber hinaus enthält die Keilscheibe Neuronen des medialen Kerns des Trapezkörpers ipsilateral zu den medialen Olivocochlearen-Neuronen, aus denen Aufnahmen gemacht werden.Um die neuronale Konnektivität innerhalb eines Keilscheiben präsynaptischen Inputs zu bestätigen, werden auf zwei Arten stimuliert. Zunächst wird die ventrale akustische Strie an der Mittellinie elektrisch stimuliert, die Direktaktivierung von T-Stellat-Axonen und des medialen Zellkerns der Trapezkörperneuronen mittels kugelförmiger Buschzell-Axonstimulation und resultieren zu postsynaptischen Strömen, die am medialen Olivocochlear-Neuron gemessen werden. Die auditive Nervenwurzel wird dann stimuliert, um die gesamte monaural aufsteigende Hirnstammschaltung zu aktivieren und postsynaptische Reaktionen zu evozieren.Der Vergleich der beginnenden Latenzmessungen des ersten postsynaptischen Stroms, der mit direkter Stimulation der ventralen akustischen Stria mit denen evoziert wird, die mit auditiver Nervenstimulation evoziert werden, zeigt eine signifikant längere Latenz im auditiven Nervenstimulationsereignis, was auf die synaptische Verzögerung hindeutet, die sich aus der zusätzlichen Cochlea-Nucleus-Synapse ergibt, die während der auditiven Nervenstimulation aktiviert wird. Die Verwendung anatomischer Landmarken und das sorgfältige Manövrieren der magnetischen Scheibenstufe sind entscheidend für die Erstellung von Keilscheiben mit intakten neuronalen Schaltkreisen und zuverlässigevozierten postsynaptischen Reaktionen. Diese Schneidetechnik bietet eine Plattform für den Einsatz zusätzlicher in vitro elektrophysiologischer Werkzeuge, einschließlich Kalzium- oder Spannungsbildgebung, Optogenetik, Neurotransmitter-Unkaging und sowohl intrazelluläre als auch extrazelluläre Pharmakologie.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

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Forschung

Neurowissenschaften

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Functional Neuroimaging Using Ultrasonic Blood-brain Barrier Disruption and Manganese-enhanced MRI

Funktionelle Bildgebung mit Ultraschall-Blut-Hirnschranke Störung und Mangan-MRT

Although mice are the dominant model system for studying the genetic and molecular underpinnings of neuroscience, functional neuroimaging in mice remains ...

Dual Electrophysiological Recordings of Synaptically-evoked Astroglial and Neuronal Responses in Acute Hippocampal Slices

Dual-Elektrophysiologische Recordings synaptisch-evozierte astrogliale und neuronale Antworten in Acute Hippocampusschnitte

Astrocytes form together with neurons tripartite synapses, where they integrate and modulate neuronal activity. Indeed, astrocytes sense neuronal inputs ...

In vivo Neuronal Calcium Imaging in C. elegans

In vivo Neuronal Calcium Imaging in C. elegans

In vivo Neuronale Calcium Imaging in C. elegans

The nematode worm C. elegans is an ideal model organism  for relatively simple, low cost neuronal imaging in vivo. Its small transparent body and simple, ...

Fast Micro-iontophoresis of Glutamate and GABA: A Useful Tool to Investigate Synaptic Integration

Schnelle Micro-Iontophorese von Glutamat und GABA: Ein nützliches Tool, um Synaptic Integration Untersuchen

One of the fundamental interests in neuroscience is to understand the integration of excitatory and inhibitory inputs along the very complex structure of ...

Genetic Manipulation of Cerebellar Granule Neurons In Vitro and In Vivo to Study Neuronal Morphology and Migration

Genetic Manipulation of Cerebellar Granule Neurons In Vitro and In Vivo to Study Neuronal Morphology and Migration

Genetische Manipulation von Kleinhirnkörnerzellen<em&gt; In-vitro-</em&gt; Und<em&gt; In Vivo</em&gt;, Um neuronale Morphologie und Migration Studieren

Developmental events in the brain including neuronal morphogenesis and migration are highly orchestrated processes. In vitro and in vivo analyses allow ...

Brain Slice Biotinylation: An Ex Vivo Approach to Measure Region-specific Plasma Membrane Protein Trafficking in Adult Neurons

Brain Slice Biotinylation: An Ex Vivo Approach to Measure Region-specific Plasma Membrane Protein Trafficking in Adult Neurons

Hirnschnitt Biotinylierung: Eine<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Ansatz zur Region spezifische Plasma Membrane Protein Handel Erwachsene Neuronen messen

Regulated endocytic trafficking is the central mechanism facilitating a variety of neuromodulatory events, by dynamically controlling receptor, ion ...

Inducing Plasticity of Astrocytic Receptors by Manipulation of Neuronal Firing Rates

Induktion von Plastizität Astrozytäre Rezeptoren durch Manipulation der neuronalen Feuerraten

Close to two decades of research has established that astrocytes in situ and in vivo express numerous G protein-coupled receptors (GPCRs) that can be ...

In Utero Electroporation Approaches to Study the Excitability of Neuronal Subpopulations and Single-cell Connectivity

In Utero Electroporation Approaches to Study the Excitability of Neuronal Subpopulations and Single-cell Connectivity

In Utero Ansätze Elektroporation die Erregbarkeit neuronaler Subpopulationen und Einzelzell - Konnektivität zu studieren

The nervous system is composed of an enormous range of distinct neuronal types. These neuronal subpopulations are characterized by, among other features, ...