Name: in vitro wedge slice preparation for mimicking in vivo neuronal circuit connectivity
Uploaded: 2020-08-18T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about In Vitro Wedge Slice Preparation for Mimicking In Vivo Neuronal Circuit Connectivity at JoVE.com

מחקר זה נתמך על ידי תוכנית המחקר התוך-מזוראלי של NIH, NIDCD, Z01 DC000091 (CJCW).

כל ההליכים הניסיוניים אושרו על ידי המכון הלאומי להפרעות נוירולוגיות ושבץ / המכון הלאומי לחירשות והפרעות תקשורת אחרות טיפול בבעלי חיים וועדת שימוש.
1. הכנות ניסיוניות
הערה: פרטים לגבי הכנת פרוסה כולל תמיסת חיתוך, חיתוך טמפרטורה, טמפרטורת דגירה פרוסה וערכון (וכו...

הליך החיתוך המתואר כאן כננה פרוסת טריז הוא רב עוצמה לשמירה על מעגלים עצביים presynaptic שלם, אבל עם הנגישות של ניסויים פרוסת המוח לניתוח של תפקוד עצבי. יש לנקוט בזהירות רבה במספר צעדים ראשוניים על מנת למקסם את התועלת של ההכנה לניתוח מעגלים. יש לאשר את ממדי הטריז באמצעות בדיקה היסטולוגית, שהיא חל?...

תצפית על פעילות של מעגלים עצביים מבוצעת באופן אידיאלי עם תשומות חושיות ומשוב מקוריים, וקישוריות שלמה בין אזורי המוח, ב vivo. עם זאת, ביצוע ניסויים הנותנים רזולוציה של תא יחיד של תפקוד מעגל עצבי עדיין מוגבל על ידי אתגרים טכניים במוח שלם. בעוד ב-vivo אלקטרופיזיולוגיה חוץ תאית או שיטות הדמיה multiphoton יכול לשמש לחקירת פעילות במערכות עצבים שלמות, לפרש כיצד תשומות שונות לשלב או מדידה תשומות סינפטיות subthreshold נשאר קשה. בהקלטות vivo תא שלם להתגבר על מגבלות אלה, אבל הם מאתגרים לבצע, אפילו באזורים במוח אשר נגישים בקלות. אתגרים טכניים של ניסויים ברזולוציה של תא יחיד מוגברים עוד יותר באוכלוסיות נוירון מסוימות הממוקמות עמוק במוח, או באוכלוסיות מפוזרות מרחבית הדורשות כלים גנטיים כדי לאתר תאים ב-vivo (למשל, ביטוי גנטי של channelrhodopsin בשילוב עם הקלטת optrode) או זיהוי היסטוכימי פוסט הוק לאחר תיוג אתר הקלטה (למשל עם סמנים ספציפיים לנוירוטרנסמיט). להיות ממוקם באופן מפוזר ליד פני השטח החנונים של גזע המוח, נוירונים olivocochlear מדיאלי (MOC) סובלים מהמגבלות לעיל1, מה שהופך אותם קשהמאוד לגשת לניסויים vivo.
פרוסות מוח (~ 100-500 μm עובי) שימשו זמן רב כדי ללמוד מעגלים במוח, כולל מעגלים גזע המוח השמיעתי, בשל ההפרדה הפיזית של נוירונים מחוברים הכלוליםבתוך אותה פרוסה 2,3,4,5,6,7,8,9. ניסויים באמצעות פרוסות עבות הרבה יותר (>1 מ"מ) הועסקו במעבדות אחרות כדי להבין כיצד תשומות דו-צדדיות משתלבות באזורים של קומפלקס אוליברי מעולה (SOC) כולל זיתמעולה מדיאלי 10,11. פרוסות אלה הוכנו כך כי האקסונים של עצב השמיעה (AN) נשאר שלם בתוך הפרוסה היו מגורה חשמלית ליזום שחרור מוליך עצבי סינפטי ב CN, מחקה פעילות של נוירונים שמיעתיים סדר ראשון כפי שהם יגיבו לקול. אחד החיסרון העיקרי של פרוסות עבות אלה הוא ניראות של נוירונים עבור הקלטות אלקטרופיזיולוגיות תיקון-מהדק ("תיקון"). תיקון הופך קשה יותר ויותר כמו האקסונים הרבים באזור זה הופכים מילינציה עם גיל12,13 ,14,15,מהשהופךאת הרקמה צפופה אופטית וסמיך נוירונים אפילו בפרוסת מוח טיפוסית, דקה. המטרה שלנו היא ליצור בהכנות מבחנה הדומות יותר לקישוריות המעגל של הקלטות vivo, אבל עם תפוקה גבוהה ויכולות הקלטה ברזולוציה גבוהה של אלקטרופיזיולוגיה מדבקה מונחית חזותית לפרוסות מוח.
המעבדה שלנו חוקרת את הפיזיולוגיה של תאי העצב של מערכת אפרטשמיעתית, כולל נוירונים MOC. נוירונים כולינרגית אלה מספקים משוב אדיש לשבלול על ידי לווסת את הפעילות של תאי שיער בחוץ (OHCs)16,17,18,19,20. מחקרים קודמים הראו כי אפנון זה ממלא תפקיד בהשיגשליטה בשבלול 21,22,23,24,25,26 והגנהמפני טראומה אקוסטית 27,28,29,30,31,32,33. בעכברים, נוירונים MOC ממוקמים באופן מפוזר בגרעין הפתח של גוף הטרפז (VNTB) בגזע המוחהשמיעתי 1. הקבוצה שלנו השתמשה בקו העכבר ChAT-IRES-Cre חצה עם קו העכבר כתב tdTomato למקד נוירונים MOC בפרוסות גזע המוח תחת תאורה אפיפלואורסצנטית. הראינו כי נוירונים MOC לקבל קלט מעכב אפיל מן הגרעין המדיואלי ipsilateral של גוף טרפז (MNTB), אשר נרגש, בתורו, על ידי אקסונים מתאים סבוך כדורי (GBC) בגרעין השבלול הניטרי (CN)34, 35,36,37,38. בנוסף, נוירונים MOC סביר לקבל קלט מעורר שלהם מתאי T-stellate ב CN39 ההתפלהההתפלה ,40,41. יחד, מחקרים אלה מראים נוירונים MOC לקבל הן תשומות מעוררות ומעכבות נגזר מאותה (קונטרה חוץ) אוזן. עם זאת, הנוירונים presynaptic, ואת האקסונים שלהם מתכנסים על נוירונים MOC, הם לא ממש קרובים זה לזה כדי להיות שלמים לחלוטין בהכנה פרוסת קורונל טיפוסית. כדי לחקור כיצד שילוב של תשומות סינפטיות לנוירונים MOC משפיע על דפוסי ירי פוטנציאליים הפעולה שלהם, עם דגש על עיכוב שתואר לאחרונה, פיתחנו הכנה שבה אנו יכולים לעורר את אפרטנטים מגוונים לנוירונים MOC מאוזן אחת בדרך הפיזיולוגית ביותר מציאותית האפשרית, אבל עם היתרונות הטכניים של ניסויי פרוסת מוח במבחנה.
פרוסת הטריז היא הכנת פרוסה עבה שונה שנועדה לחקירה של שילוב מעגלים בנוירונים MOC (ממוכמת בדמות 1A). בצד העבה של הפרוסה, הטריז מכיל את האקסונים הקותעים של עצב השמיעה (בשם "שורש עצב שמיעתי" להלן) כשהם נכנסים לגזע המוח מהפריפריה ולסינאפסה ב-CN. שורש העצב השמיעתי יכול להיות מגורה חשמלית כדי לעורר שחרור מוליך עצבי והפעלה סינפטית של תאים של CN42שלםלחלוטין,43,44,45,46. תבנית גירוי זו כוללת מספר יתרונות לניתוח מעגלים. ראשית, במקום לגרות ישירות את האקסונים T-stellate ו GBC המספקים קלט אדיש לנוירונים MOC, אנו לעורר את AN כדי לאפשר הפעלה של מעגלים פנימיים בשפע ב CN. מעגלים אלה לווסת את התפוקה של נוירונים CN ליעדים שלהם ברחבי המוח, כולל נוירונים MOC46,47,48,49,50,51. שנית, ההפעלה polysynaptic של מעגלים אפילים מן AN דרך CN במעלה הזרם של נוירונים MOC מאפשר תזמון הפעלה טבעי יותר עבור פלסטיות להתרחש בסינפסות אלה כפי שהם היו vivo במהלך גירוי שמיעתי. שלישית, אנחנו יכולים לשנות את דפוסי הגירוי שלנו כדי לחקות פעילות AN. לבסוף, הן תחזיות מונוארות מעוררות ומעכבות לנוירונים MOC הם שלמים פרוסת טריז, ואת השילוב שלהם ניתן למדוד בנוירון MOC עם הדיוק של אלקטרופיזיולוגיה טלאי-מהדק. ככלל, ערכת הפעלה זו מספקת מעגל שלם יותר לנוירונים MOC בהשוואה הכנה פרוסת מוח טיפוסית. פרוסת טריז גזע המוח זה יכול לשמש גם כדי לחקור אזורים שמיעתיים אחרים אשר מקבלים קלט מעכב מ-MNTB ipsilateral כולל זית מעולה לחוץ, גרעין אוליברימעולה וזית מעולהמדיאלי 10,11,52,53,54,55,56. מעבר להכנה הספציפית שלנו, ניתן להשתמש בשיטת חיתוך זו או לשנות כדי להעריך מערכות אחרות עם היתרונות של שמירה על קישוריות של תשומות ארוכות טווח ושיפור החזותיה של נוירונים עבור מגוון רחב של אלקטרופיזיולוגיה ברזולוציה חד-תאית או טכניקות הדמיה.
פרוטוקול זה דורש שימוש בשלב או בפלטפורמה של vibratome שניתן להטות כ- 15°. כאן אנו משתמשים בשלב מגנטי זמין מסחרית של שני חלקים שבו ה"במה" הוא דיסק מתכת עם תחתית מעוקלת הממוקמת ב"בסיס במה" מגנטי קעור. לאחר מכן ניתן להזיז את השלב כדי להתאים את זווית הפרוסה. עיגולים קונצנטריים בבסיס הבמה משמשים להערכת הזווית באופן רפרודוקטיבי. בסיס הבמה והשלב ממוקמים בתא החיתוך, שם ניתן גם לסובב את בסיס הבמה המגנטית.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Experimental Preparations</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar, powder</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP1423500</td>
			<td>4% agar block used to stabilize brain tissue during vibratome sectioning</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AlexaFluor Hydrazide 488</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A10436</td>
			<td>Fluorophore used in internal solution to confirm successful MOC neuron patch</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Analytical Balance</td>
			<td>Geneses Scientific (Intramalls)</td>
			<td>AV114</td>
			<td>Weighing chemicals</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Double edged razor blade</td>
			<td>Ted Pella</td>
			<td>121-6</td>
			<td>Vibratome cutting blade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kynurenic acid (5g)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>K3375-5G</td>
			<td>Slicing ACSF additive used to reduce neuron activity during dissection and slicing in order to improve tissue health for patch clamping</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH Meter</td>
			<td>Fisher Scientific (Intramalls)</td>
			<td>13-620-451</td>
			<td>Solution pH tester</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic petri dishes 100mm dia X 20mm</td>
			<td>Fisher Scientific (Intramalls)</td>
			<td>12-556-002</td>
			<td>4% Agar Prep</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stirring Hotplate</td>
			<td>Fisher Scientific (Intramalls)</td>
			<td>11-500-150</td>
			<td>Heating for 4% Agar preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissection and Slicing</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biocytin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>B4261-250MG</td>
			<td>Chemical used for axonal tracing (conjugated to Streptavidin 488)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting Microscope</td>
			<td>Amscope</td>
			<td>SM-1BN</td>
			<td>For precision dissection during brain removal</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #5 Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11252-20</td>
			<td>Fine forceps dissection tool</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Economy tweezers #3</td>
			<td>WPI</td>
			<td>501976</td>
			<td>Forceps dissection tool</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Petri Dish 150mm dia x 15mm H</td>
			<td>Fisher Scientific (Intramalls)</td>
			<td>08-747E</td>
			<td>Dissection dish</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Interface paper (203 X 254mm PCTE Membrane 10um)</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td>1220823</td>
			<td>Slice incubation/biocytin application</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica VT1200S Vibratome</td>
			<td>Leica</td>
			<td>1491200S001</td>
			<td>Vibratome for wedge slice sectioning</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mayo scissors</td>
			<td>Roboz</td>
			<td>RS-6872</td>
			<td>Dissection tool</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Single-edged carbon steel blades</td>
			<td>Fisher Scientific (Intramalls)</td>
			<td>12-640</td>
			<td>Razor blade for dissection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Specimen disc, orienting</td>
			<td>Leica</td>
			<td>14048142068</td>
			<td>Specialized vibratome stage for reproducible tilting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spoonula</td>
			<td>FisherSci</td>
			<td>14-375-10</td>
			<td>Dissection tool</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Super Glue</td>
			<td>Newegg</td>
			<td>15187</td>
			<td>Used for glueing tissue to vibratome stage</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vannas Spring Scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>91500-09</td>
			<td>Dissection tool</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electrophysiology</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>A1R Upright Confocal Microscope</td>
			<td>Nikon Instruments</td>
			<td></td>
			<td>Electrophysiology and imaging microscope, can be any microscope compatible with electrophysiology</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electrode Borosilicate glass w/ Filament OD 1.5mm, ID 1.1mm, 10 cm long</td>
			<td>Sutter Instrument</td>
			<td>BF150-110-10</td>
			<td>Patch clamping pipette glass</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electrode Filler MicroFil</td>
			<td>WPI</td>
			<td>CMF20G</td>
			<td>Patch electrode pipette filler</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>In-line solution heater</td>
			<td>Warner Instruments (GSAdvantage)</td>
			<td>SH-27B</td>
			<td>Slice perfusion system heater</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multi-Micromanipulator Systems</td>
			<td>Sutter Intruments</td>
			<td>MPC-200 with MP285</td>
			<td>Micromanipulators for patch clamp and stimulation electrode placement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P-1000 horizontal pipette puller for glass micropipettes</td>
			<td>Sutter instruments</td>
			<td>FG-P1000</td>
			<td>Patch clamp pipetter puller</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Patch-clamp amplifier and Software</td>
			<td>HEKA</td>
			<td>EPC-10 / Patchmaster Next</td>
			<td>Can be any amplifier/software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recording Chamber</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>RC26G</td>
			<td>Slice &#34;bath&#34; during recording</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recording Chamber Harp</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>640253</td>
			<td>Stablizes slice during electrophysiology recording</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slice Incubation Chamber</td>
			<td>Custom Build</td>
			<td></td>
			<td>Heated, oxygenated holding chamber for slices during recovery after slicing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stimulus isolation unit</td>
			<td>A.M.P.I.</td>
			<td>Iso-Flex</td>
			<td>Stimulus isolation unit for electrophysiology</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe 60CC</td>
			<td>Fischer Scientific (Intramalls)</td>
			<td>14-820-11</td>
			<td>Electrophysiology perfusion fluid handling</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Temperature controller</td>
			<td>Warner Instruments (GSAdvantage)</td>
			<td>TC-324C</td>
			<td>Slice perfusion system temperature controller</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tubing 1/8 OD 1/16 ID</td>
			<td>Fischer Scientific (Intramalls)</td>
			<td>14-171-129</td>
			<td>Electrophysiology perfusion fluid handling</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tugsten concentric bipolar microelectrode</td>
			<td>WPI</td>
			<td>TM33CCINS</td>
			<td>Stimulating electrode for electrophysiology</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Histology</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24 well Plate</td>
			<td>Fisher Scientific (Intramalls)</td>
			<td>12-556006</td>
			<td>Histology slice collection and immunostaining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 Streptavidin</td>
			<td>Jackson Immuno labs</td>
			<td>016-540-084</td>
			<td>Secondary antibody for biocytin visualization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning Orbital Shaker</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>CLS6780FP</td>
			<td>Shaker for immunohistochemistry agitation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cresyl Violet Acetate</td>
			<td>Sigma Aldrich (Intramalls)</td>
			<td>C5042-10G</td>
			<td>Cellular stain for histology</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable Microtome Blades</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>22-210-052</td>
			<td>Sliding microtome blade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter-syringe Nalgene 4mm Cellulose Acetate 0.2um</td>
			<td>Fisher Scientific (Intramalls)</td>
			<td>09-740-34A</td>
			<td>Syringe filter for filling recording pipettes with internal solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluoromount-G Slide Mounting Medium</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>OB100-01</td>
			<td>Immunohistochemistry fluorescence mounting medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glass slide staining dish with rack</td>
			<td>Fisher Scientific (Intramalls)</td>
			<td>08-812</td>
			<td>Cresyl Violet staining chamber</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microm HM450 Sliding Microtome</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>910020</td>
			<td>Freezing microtome for histology</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Cover Glasses: Rectangles 50mm X 24mm</td>
			<td>Fisher Scientific (Intramalls)</td>
			<td>12-543D</td>
			<td>Histochemistry slide cover glass</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Permount mounting medium</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>SP15-100</td>
			<td>Cresyl violet section mounting medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superfrost Slides</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>22-034980</td>
			<td>Histology slides</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vitro wedge slice preparation for mimicking in vivo neuronal circuit connectivity

במבחנה פרוסה אלקטרופיזיולוגיה טכניקות למדוד פעילות חד תאית עם רזולוציה חשמלית וזמנית מדויקת. פרוסות המוח חייבות להיות דקות יחסית כדי לדמיין כראוי ולגשת נוירונים עבור תיקון-הידוק או הדמיה, ובדיקת מבחנה של מעגלים במוח מוגבל רק מה שקיים פיזית בפרוסה חריפה. כדי לשמור על היתרונות של ניסויי פרוסת מבחנה תוך שמירה על חלק גדול יותר של גרעין פרסינאפטי, פיתחנו הכנת פרוסה חדשנית. "פרוסת טריז" זו תוכננה עבור הקלטות אלקטרופיזיולוגיה טלאי-מהדק לאפיין את התשומות המנוארות, מונחות קול, לנוירונים אוליבוקוליאר (MOC) בגזע המוח. נוירונים אלה מקבלים את תשומות מעוררות ומעכבות העיקריות שלהם מנויונים המופעלים על ידי גירויים באוזן ההתפלה וגרעין השבלול המתאים (CN). פרוסת מוח אסימטרית תוכננה שהיא העבה ביותר בתחום הרוזטרו-סיבתי בקצה הצדדי של חצי כדור אחד ולאחר מכן מדללת לכיוון הקצה הצדדי של חצי הכדור הנגדי. פרוסה זו מכילה, בצד העבה, את שורש העצב השמיעתי המעביר מידע על גירויים שמיעתיים למוח, המעגלים הפנימיים של CN, וגם את המסלולים המעכבים הדיסינפטיים והטריסינופטיים המתכנסים על נוירונים MOC נגדי. ההקלטה מבוצעת מנויונים MOC בצד הדק של הפרוסה, שם הם מדמיינים באמצעות אופטיקה DIC לניסויים טיפוסיים תיקון-מהדק. גירוי ישיר של עצב השמיעה מבוצע כאשר הוא נכנס לגזע המוח השמיעתי, המאפשר פעילות מעגל CN פנימית פלסטיות סינפטית להתרחש בסינופסות במעלה הזרם של נוירונים MOC. עם טכניקה זו, ניתן לחקות את הפעלת מעגל vivo קרוב ככל האפשר בתוך הפרוסה. הכנת פרוסת טריז זו ישימה למעגלים אחרים במוח שבהם ניתוחי מעגלים ייהנו משימור קישוריות במעלה הזרם וכניסות ארוכות טווח, בשילוב עם היתרונות הטכניים של פיזיולוגיה של פרוסה חוץ-חוץית.

בדיקה היסטולוגית של פרוסת טריז לחקירה שלנו של תפקוד נוירון גזע המוח השמיעתי, הכנת פרוסת טריז תוכנן להכיל את שורש העצב השמיעתי ו CN נגדי לנוירונים MOC המיועדים להקלטות (פרוסה לדוגמה המוצגת איור 1B). בדיקה היסטולוגית ראשונית של ההכנה חשובה כדי לאשר כי הפרוסה מכילה את ?...

Watch this Scientific Journal Video about In Vitro Wedge Slice Preparation for Mimicking In Vivo Neuronal Circuit Connectivity at JoVE.com

In Vitro Wedge Slice Preparation for Mimicking In Vivo Neuronal Circuit Connectivity

שילוב של תשומות סינפטיות מגוונות לנוירונים נמדד בצורה הטובה ביותר בהכנה שמשמרת את כל הגרעין הטרום-סינפטי לתזמון טבעי ול פלסטיות מעגל, אבל פרוסות מוח בדרך כלל מנתקות חיבורים רבים. פיתחנו פרוסת מוח שונה כדי לחקות פעילות מעגל vivo תוך שמירה על יכולת ניסויים במבחנה.

במבחנה טריז פרוסה הכנה עבור חיקוי בקישוריות מעגל עצבי Vivo

In vitro slice electrophysiology techniques measure single-cell activity with precise electrical and temporal resolution. Brain slices must be relatively ...

ניסויים בפרוסות מוח מאפשרים חקירה של תפקוד עצבי ברזולוציה חשמלית ותכופת גבוהה, אך פרוסות אלה בדרך כלל מנתקות קשרים פרה-סינפטיים רבים. פרוסה בצורת טריז שומרת על מעגלים פרה-סינפטיים שלמים יותר. פרוסת מוח מותאמת זו שומרת על מעגל עצבי מלא יותר דמוי vivo תוך מתן היתרונות של ניסויים במבחנה, כגון הקלטות מהדק תיקון מונחה חזותית, פרמקולוגיה והדמיית פעילות.ניתן להעריך גיאומטריה פרוסה טריז מדויקת בהתבסס על מיקומי האטלס של הנוירונים בתוך המעגל, אך יש לקבוע את שלמות השרטוטים והאקסונים הקדם-סינפטיים באמצעות היסטולוגיה. התחל על ידי שימוש בסכין גילוח כדי לחתוך את העור במרכז הגולגולת מהאף עד החלק האחורי של הצוואר. לקלף בחזרה את העור כדי לחשוף את הגולגולת ולהתחיל בבסיס הגולגולת ולהמשיך לכיוון האף, להשתמש במספריים קטנים כדי להפוך חתך בגולגולת דרך קו האמצע.בתפר lambda, לעשות חתכים בגולגולת מקו האמצע לצדדים לכיוון האוזן משני הצדדים כדי לקלף בחזרה את הגולגולת כדי לחשוף את המוח. החל בקצה rostral, להשתמש מרית מעבדה קטנה בעדינות להרים את המוח מהגולגולת כדי לאפשר עצבי הראייה להיות מנותק. המשך לעבוד בעדינות את המוח לאחור, חושף את פני השטח הגחוני ולהשתמש מטלפים עדין כדי לצבוט בזהירות את העצבים trigeminal ליד פני השטח הגחוני של גזע המוח כדי לחתוך אותם.מניחים את ההכנה בצלחת פטרי זכוכית מלאה בתתח חיתוך קר ומ מניחים את המנה תחת מיקרוסקופ נתוח. חותכים את עצבי הפנים קרוב לגזע המוח כדי לחשוף את העצבים פרוביודולוקוקלאר. השתמש מדחפים עדין לדחוף את הטיפים לתוך foramina שבו העצב vestibulocochlear יוצא הגולגולת ככל האפשר.צובטים כדי לנתק את העצבים משני הצדדים, משאירים את שורש העצב מחובר לגזע המוח. הסר את קרום המוח ואת כלי הדם מפני השטח הגחוני של גזע המוח ליד הגוף הטרפז. ואז לצבוט את העצבים הגולגולתיים הנותרים ואת רקמת החיבור כדי לשחרר את המוח לחלוטין מן הגולגולת, דואג לשמור על חוט השדרה הנותר, אם אפשר.כדי להכין את פני השטח של המוח עבור מתקן לשלב למקם את הצד הגחוני במוח למעלה ולהשתמש בכלי קהה בעדינות לשתק את חוט השדרה כדי לייצב את רקמת המוח. הכנס ממטרים פתוחים בזווית של כ -20 מעלות דרך המוח לתחתית המנה, כך שהטיפים יוצאים מפני השטח הגביים של המוח caudal אל chiasm אופטי ולהשתמש סכין גילוח לחתוך לאורך המדפים. לאחר מכן, הכינו גוש סנטימטר מעוקב אחד של 4% אגר והפיצו טיפת דבק קטנה למלבן על הבמה.השתמש מדפים כדי להרים בזהירות את המוח בעדינות לטבול את הנוזל העודף עם קצה של מגבת נייר. לאחר מכן מניחים את המשטח החסום על הדבק כך שמשטח הגחון יעמוד לכיוון הלהב במהלך החיתוך ודוחים את גוש הגר בעדינות על פני הגב כתמיכה. כדי לרכוש פרוסות טריז עם שורש עצבי השרוך בצד העבה והנוירונים האוליבוקוכלאריים המדיאליים והגרעין המדיאלי של הגוף הטרפז בצד הדק, מניחים את הדיסק המגנטי עם המוח המחובר על מחזיק הבמה וממקמים את המחזיק בתא החותך של רטט עם פני השטח הגחוני של המוח המכוונים לכיוון הלהב.ממלאים את התא בתסכולת חיתוך קר כקרח ומורידים את הלהב לתופת בועות קרבוגן. חותכים פרוסות caudal לאזור העניין כדי לוודא את הפרוסות הם סימטריים. ואז להעביר את הבמה כ 15 מעלות לצד אחד.המשך לחתוך בזהירות עד ששורש עצב השמיעה קרוב לפני השטח בצד אחד ועצב הפנים ניתן לראות על פני השטח של הצד השני של הפרוסה. הסט את השלב 15 מעלות בחזרה למיקום המקורי והזז את הלהב הרחק מהרקמה. סובב את בסיס הבמה ב-90 מעלות כך שהקצה הצדדי של הצד הדק פונה אל הלהב ומנמיך את הלהב כמה מאות מיקרון לפני שהוא מקרב באיטיות את הלהב לקצה הרקמה.עם הלהב נסוג מעט להוריד את הלהב לעובי הרצוי של הקצה הדק של הפרוסה. להזיז את הלהב בחזרה מן הרקמה ולסובב את בסיס הבמה בחזרה, כך משטח הגחון פונה לבסיס הבמה. לעשות חתך כדי לייעד את פני השטח rostral של פרוסת טריז ולהעביר את הפרוסה לפיסת סנטימטר מרובע אחד של משטח צרוב נייר ממשק למטה.עצב הפנים צריך להיות גלוי על שתי ההמיספרות של הפרוסה על פני השטח rostral. ואז להעביר את הפרוסה לתא הדגירה 35 מעלות צלזיוס להתאושש במשך 30 דקות. כדי להגדיר את פרוסת טריז לניתוח electrophysiology למקם את המדגם לתוך תא הקלטה כי הוא להיות מנוון ברציפות עם 35 מעלות צלזיוס ACSF ולייצב את הפרוסה.באמצעות אופטיקה DIC, להתמקד שורש עצב השמיעה בצד העבה של הפרוסה ולהשתמש micromanipulator להעביר את האלקטרודה מגרה טונגסטן דו קוטבית לשורש העצב השמיעתי בעדינות לתוך פני השטח של הרקמה. הזז את שדה התצוגה לגרעין הגחוני של גוף הטרפז בצד הדק ובחר נוירון olivocochlear המדיאלי כיעד לאלקטרופיזיולוגיה של מהדק טלאי תחת אפיפלואורסצנטיות באמצעות מסנן פליטת ננומטר 561. מלא פיפטה הקלטה עם הפתרון הפנימי המתאים לניסוי המוצע תחת תיקון אופטיקה DIC ולהקליט מן הנוירון olivocochlear המדיאלי בתצורת התא כולו.התאם את משרעת הגירוי החשמלי של שורש עצב השמיעה כדי להשיג אירועים פוסט-סינפטיים עקביים בנוירון האוליבוקוכלארי המדיאלי. לאחר מכן הפעל פרוטוקולי גירוי מתאימים כדי להתבונן בזרמים סינפטיים מעוררים בנוירונים אוליבוקוכלאריים מדיאליים. הכנת פרוסת טריז זו נועדה להכיל את שורש עצב השמיעה ואת גרעין הברגים בניגוד לנוירונים המדיאליים olivocochlear המיועדים להקלטות.בפרוסת טריז מוכתמת קרשיל סגולה זו, גרעין המשפך נמצא כמעט במלואו. ושורש עצב השמיעה נצפה נכנס לגרעין התיש. בנוסף, פרוסת טריז מכיל נוירונים של הגרעין המדיאלי של ipsilateral הגוף הטרפז לנוירונים olivocochlear המדיאלי שממנו מבוצעות הקלטות.כדי לאשר את הקישוריות העצבית בתוך פרוסת טריז תשומות presynaptic מגורים בשתי דרכים. ראשית, סטריה אקוסטית הגחונית בקו האמצע מגורה חשמלית, הפעלת T-stellate אקסונים ישירות ואת הגרעין המדיאלי של נוירוני הגוף הטרפז באמצעות גירוי אקסון תאים סבוך כדורי וכתוצאה מכך זרמים פוסט-סינפטיים הנמדדים בנוירון אוליבוקוכר המדיאלי. שורש עצב השמיעה מגורה לאחר מכן כדי להפעיל את כל מעגלי המוח העולים monaural ולעורר תגובות postsynaptic.השוואה של מידות ההשהיה של הזרם הפוסט-סינפטי הראשון שעורר עם גירוי ישיר של הסטריה האקוסטית הגחונית עם אלה שעוררו גירוי עצבי שמיעתי חושפת השהיה ארוכה יותר באופן משמעותי באירוע הגירוי העצבי השמיעתי, מה שמעיד על העיכוב הסינפטי הנובע מהסינאפסה הנוסף של גרעין שבכה המופעל במהלך גירוי עצבי שמיעתי. השימוש בציוני דרך אנטומיים ותמרון זהיר של שלב הדיסק המגנטי הם קריטיים ליצירת פרוסות טריז עם מעגלים עצביים שלמים ותגובות סינפטיות אמינות. טכניקת חיתוך זו מספקת פלטפורמה לשימוש בכלים נוספים לאלקטרופיזיולוגיה חוץ-חוץ-תאית, כולל הדמיה של סידן או מתח, אופטוגנטיקה, אי-ניתור נוירוטרנסמיטר, ופרמקולוגיה תאית וחוץ-תאית.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

The Organotypic Hippocampal Slice Culture Model for Examining Neuronal Injury

תרבות Organotypic בהיפוקמפוס Slice דגם לבחינת פגיעה עצבית

Organotypic hippocampal slice culture is an in vitro method to examine mechanisms of neuronal injury in which the basic architecture and composition of ...

Organotypic Slice Cultures of Embryonic Ventral Midbrain: A System to Study Dopaminergic Neuronal Development in vitro

Organotypic Slice Cultures of Embryonic Ventral Midbrain: A System to Study Dopaminergic Neuronal Development in vitro

פורסים תרבויות Organotypic של המוח התיכון הגחון עובריים: מערכת מחקר ופיתוח עצבי דופאמין במבחנה</em

The  mouse is an excellent model organism to study mammalian brain development due  to the abundance of molecular and genetic data. However, the ...

Functional Neuroimaging Using Ultrasonic Blood-brain Barrier Disruption and Manganese-enhanced MRI

הדמייה תפקודית באמצעות שיבוש Ultrasonic הדם למוח הגדר מנגן משופרת MRI

Although mice are the dominant model system for studying the genetic and molecular underpinnings of neuroscience, functional neuroimaging in mice remains ...

Dual Electrophysiological Recordings of Synaptically-evoked Astroglial and Neuronal Responses in Acute Hippocampal Slices

קלטות אלקטרו כפולות של תגובות Astroglial ועצביות עוררו-synaptically בפרוסות ביפוקמפוס חריפות

Astrocytes form together with neurons tripartite synapses, where they integrate and modulate neuronal activity. Indeed, astrocytes sense neuronal inputs ...

In vivo Neuronal Calcium Imaging in C. elegans

In vivo Neuronal Calcium Imaging in C. elegans

בהדמיה עצבית סיד vivo ב C. elegans

The nematode worm C. elegans is an ideal model organism  for relatively simple, low cost neuronal imaging in vivo. Its small transparent body and simple, ...

Fast Micro-iontophoresis of Glutamate and GABA: A Useful Tool to Investigate Synaptic Integration

מיקרו-Iontophoresis מהיר של גלוטמט וגאבא: כלי שימושי לחקירת האינטגרציה סינפטית

One of the fundamental interests in neuroscience is to understand the integration of excitatory and inhibitory inputs along the very complex structure of ...

Genetic Manipulation of Cerebellar Granule Neurons In Vitro and In Vivo to Study Neuronal Morphology and Migration

Genetic Manipulation of Cerebellar Granule Neurons In Vitro and In Vivo to Study Neuronal Morphology and Migration

מניפולציה גנטית של Cerebellar גרגיר נוירונים<em&gt; במבחנה</em&gt; ו<em&gt; בVivo</em&gt; ללמוד עצבי מורפולוגיה וגירה

Developmental events in the brain including neuronal morphogenesis and migration are highly orchestrated processes. In vitro and in vivo analyses allow ...

Brain Slice Biotinylation: An Ex Vivo Approach to Measure Region-specific Plasma Membrane Protein Trafficking in Adult Neurons

Brain Slice Biotinylation: An Ex Vivo Approach to Measure Region-specific Plasma Membrane Protein Trafficking in Adult Neurons

המוח פרוס Biotinylation:<em&gt; Ex Vivo</em&gt; גישה למדוד סחר חלבון פלזמה ממברנה אזור ספציפי בתאי עצב בוגרים

Regulated endocytic trafficking is the central mechanism facilitating a variety of neuromodulatory events, by dynamically controlling receptor, ion ...

Inducing Plasticity of Astrocytic Receptors by Manipulation of Neuronal Firing Rates

גרימת פלסטיות של astrocytic רצפטורים על ידי מניפולציה של מחירים ירי עצביים

Close to two decades of research has established that astrocytes in situ and in vivo express numerous G protein-coupled receptors (GPCRs) that can be ...

In Utero Electroporation Approaches to Study the Excitability of Neuronal Subpopulations and Single-cell Connectivity

In Utero Electroporation Approaches to Study the Excitability of Neuronal Subpopulations and Single-cell Connectivity

ברחם Electroporation גישות לחקר רגישות של העצבית subpopulations וקישוריות תא יחיד

The nervous system is composed of an enormous range of distinct neuronal types. These neuronal subpopulations are characterized by, among other features, ...