Name: in vitro wedge slice preparation for mimicking in vivo neuronal circuit connectivity
Uploaded: 2020-08-18T14:00:00
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इस शोध को एनआईएच, एनआईडीसीडी, जेड01 DC000091 (CJCW) के इंट्राम्यूरल रिसर्च प्रोग्राम ने सपोर्ट किया ।

सभी प्रायोगिक प्रक्रियाओं को राष्ट्रीय न्यूरोलॉजिकल विकार संस्थान और स्ट्रोक/राष्ट्रीय बधिरता और अन्य संचार विकारों पशु देखभाल और उपयोग समिति पर संस्थान द्वारा अनुमोदित किया गया था ।
1. प्...

यहां वर्णित टुकड़ा करने की प्रक्रिया को बरकरार प्रेसिनैप्टिक न्यूरोनल सर्किटरी बनाए रखने के लिए शक्तिशाली है, लेकिन न्यूरोनल फ़ंक्शन के विश्लेषण के लिए मस्तिष्क टुकड़ा प्रयोग की पहुंच के साथ। सर्क?...

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Experimental Preparations</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar, powder</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP1423500</td>
			<td>4% agar block used to stabilize brain tissue during vibratome sectioning</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AlexaFluor Hydrazide 488</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A10436</td>
			<td>Fluorophore used in internal solution to confirm successful MOC neuron patch</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Analytical Balance</td>
			<td>Geneses Scientific (Intramalls)</td>
			<td>AV114</td>
			<td>Weighing chemicals</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Double edged razor blade</td>
			<td>Ted Pella</td>
			<td>121-6</td>
			<td>Vibratome cutting blade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kynurenic acid (5g)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>K3375-5G</td>
			<td>Slicing ACSF additive used to reduce neuron activity during dissection and slicing in order to improve tissue health for patch clamping</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH Meter</td>
			<td>Fisher Scientific (Intramalls)</td>
			<td>13-620-451</td>
			<td>Solution pH tester</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic petri dishes 100mm dia X 20mm</td>
			<td>Fisher Scientific (Intramalls)</td>
			<td>12-556-002</td>
			<td>4% Agar Prep</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stirring Hotplate</td>
			<td>Fisher Scientific (Intramalls)</td>
			<td>11-500-150</td>
			<td>Heating for 4% Agar preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissection and Slicing</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biocytin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>B4261-250MG</td>
			<td>Chemical used for axonal tracing (conjugated to Streptavidin 488)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting Microscope</td>
			<td>Amscope</td>
			<td>SM-1BN</td>
			<td>For precision dissection during brain removal</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #5 Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11252-20</td>
			<td>Fine forceps dissection tool</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Economy tweezers #3</td>
			<td>WPI</td>
			<td>501976</td>
			<td>Forceps dissection tool</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Petri Dish 150mm dia x 15mm H</td>
			<td>Fisher Scientific (Intramalls)</td>
			<td>08-747E</td>
			<td>Dissection dish</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Interface paper (203 X 254mm PCTE Membrane 10um)</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td>1220823</td>
			<td>Slice incubation/biocytin application</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica VT1200S Vibratome</td>
			<td>Leica</td>
			<td>1491200S001</td>
			<td>Vibratome for wedge slice sectioning</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mayo scissors</td>
			<td>Roboz</td>
			<td>RS-6872</td>
			<td>Dissection tool</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Single-edged carbon steel blades</td>
			<td>Fisher Scientific (Intramalls)</td>
			<td>12-640</td>
			<td>Razor blade for dissection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Specimen disc, orienting</td>
			<td>Leica</td>
			<td>14048142068</td>
			<td>Specialized vibratome stage for reproducible tilting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spoonula</td>
			<td>FisherSci</td>
			<td>14-375-10</td>
			<td>Dissection tool</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Super Glue</td>
			<td>Newegg</td>
			<td>15187</td>
			<td>Used for glueing tissue to vibratome stage</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vannas Spring Scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>91500-09</td>
			<td>Dissection tool</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electrophysiology</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>A1R Upright Confocal Microscope</td>
			<td>Nikon Instruments</td>
			<td></td>
			<td>Electrophysiology and imaging microscope, can be any microscope compatible with electrophysiology</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electrode Borosilicate glass w/ Filament OD 1.5mm, ID 1.1mm, 10 cm long</td>
			<td>Sutter Instrument</td>
			<td>BF150-110-10</td>
			<td>Patch clamping pipette glass</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electrode Filler MicroFil</td>
			<td>WPI</td>
			<td>CMF20G</td>
			<td>Patch electrode pipette filler</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>In-line solution heater</td>
			<td>Warner Instruments (GSAdvantage)</td>
			<td>SH-27B</td>
			<td>Slice perfusion system heater</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multi-Micromanipulator Systems</td>
			<td>Sutter Intruments</td>
			<td>MPC-200 with MP285</td>
			<td>Micromanipulators for patch clamp and stimulation electrode placement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P-1000 horizontal pipette puller for glass micropipettes</td>
			<td>Sutter instruments</td>
			<td>FG-P1000</td>
			<td>Patch clamp pipetter puller</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Patch-clamp amplifier and Software</td>
			<td>HEKA</td>
			<td>EPC-10 / Patchmaster Next</td>
			<td>Can be any amplifier/software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recording Chamber</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>RC26G</td>
			<td>Slice &#34;bath&#34; during recording</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recording Chamber Harp</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>640253</td>
			<td>Stablizes slice during electrophysiology recording</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slice Incubation Chamber</td>
			<td>Custom Build</td>
			<td></td>
			<td>Heated, oxygenated holding chamber for slices during recovery after slicing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stimulus isolation unit</td>
			<td>A.M.P.I.</td>
			<td>Iso-Flex</td>
			<td>Stimulus isolation unit for electrophysiology</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe 60CC</td>
			<td>Fischer Scientific (Intramalls)</td>
			<td>14-820-11</td>
			<td>Electrophysiology perfusion fluid handling</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Temperature controller</td>
			<td>Warner Instruments (GSAdvantage)</td>
			<td>TC-324C</td>
			<td>Slice perfusion system temperature controller</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tubing 1/8 OD 1/16 ID</td>
			<td>Fischer Scientific (Intramalls)</td>
			<td>14-171-129</td>
			<td>Electrophysiology perfusion fluid handling</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tugsten concentric bipolar microelectrode</td>
			<td>WPI</td>
			<td>TM33CCINS</td>
			<td>Stimulating electrode for electrophysiology</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Histology</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24 well Plate</td>
			<td>Fisher Scientific (Intramalls)</td>
			<td>12-556006</td>
			<td>Histology slice collection and immunostaining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 Streptavidin</td>
			<td>Jackson Immuno labs</td>
			<td>016-540-084</td>
			<td>Secondary antibody for biocytin visualization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning Orbital Shaker</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>CLS6780FP</td>
			<td>Shaker for immunohistochemistry agitation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cresyl Violet Acetate</td>
			<td>Sigma Aldrich (Intramalls)</td>
			<td>C5042-10G</td>
			<td>Cellular stain for histology</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable Microtome Blades</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>22-210-052</td>
			<td>Sliding microtome blade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter-syringe Nalgene 4mm Cellulose Acetate 0.2um</td>
			<td>Fisher Scientific (Intramalls)</td>
			<td>09-740-34A</td>
			<td>Syringe filter for filling recording pipettes with internal solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluoromount-G Slide Mounting Medium</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>OB100-01</td>
			<td>Immunohistochemistry fluorescence mounting medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glass slide staining dish with rack</td>
			<td>Fisher Scientific (Intramalls)</td>
			<td>08-812</td>
			<td>Cresyl Violet staining chamber</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microm HM450 Sliding Microtome</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>910020</td>
			<td>Freezing microtome for histology</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Cover Glasses: Rectangles 50mm X 24mm</td>
			<td>Fisher Scientific (Intramalls)</td>
			<td>12-543D</td>
			<td>Histochemistry slide cover glass</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Permount mounting medium</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>SP15-100</td>
			<td>Cresyl violet section mounting medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superfrost Slides</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>22-034980</td>
			<td>Histology slides</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vitro wedge slice preparation for mimicking in vivo neuronal circuit connectivity

इन विट्रो स्लाइस इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी तकनीक सटीक इलेक्ट्रिकल और लौकिक संकल्प के साथ एकल-कोशिका गतिविधि को मापती है। मस्तिष्क स्लाइस पैच-क्लैंपिंग या इमेजिंग के लिए न्यूरॉन्स को ठीक से कल्पना करने और एक्सेस करने के लिए अपेक्षाकृत पतला होना चाहिए, और मस्तिष्क सर्किटरी की विट्रो परीक्षा केवल तीव्र स्लाइस में शारीरिक रूप से मौजूद होने तक ही सीमित है। प्रेसिनैप्टिक नाभिक के एक बड़े हिस्से को संरक्षित करते हुए इन विट्रो स्लाइस प्रयोग के लाभों को बनाए रखने के लिए, हमने एक उपन्यास स्लाइस तैयारी विकसित की। यह "वेज स्लाइस" पैच-क्लैंप इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी रिकॉर्डिंग के लिए डिज़ाइन किया गया था ताकि ब्रेनस्टेम में मध्यम ओलिवोकोक्लियर (एमओसी) न्यूरॉन्स के लिए विविध मोनारल, ध्वनि-चालित इनपुट की विशेषता हो। इन न्यूरॉन्स को कॉन्ट्रालेट्रल कान और इसी कॉकलियर न्यूक्लियस (सीएन) में उत्तेजनाओं द्वारा सक्रिय न्यूरॉन्स से उनकी प्राथमिक अफ़ोड़क उत्तेजक और निरोधात्मक जानकारी प्राप्त होती है। एक विषम मस्तिष्क टुकड़ा डिजाइन किया गया था जो एक गोलार्द्ध के पार्श्व किनारे पर रोस्ट्रो-कौडल डोमेन में सबसे मोटा है और फिर विपरीत गोलार्द्ध के पार्श्व किनारे की ओर पतला होता है। इस टुकड़े में मोटी तरफ, श्रवण तंत्रिका पक्ष मस्तिष्क को श्रवण उत्तेजनाओं के बारे में जानकारी प्रदान करता है, आंतरिक सीएन सर्किटरी, और दोनों डिंपिटिक उत्तेजक और ट्राइसिनैप्टिक निरोधात्मक अफरेंशक रास्ते जो कॉन्ट्रालेटरल एमओसी न्यूरॉन्स पर एकाग्र होते हैं। रिकॉर्डिंग स्लाइस के पतले पक्ष पर MOC न्यूरॉन्स से की जाती है, जहां उन्हें विशिष्ट पैच-क्लैंप प्रयोगों के लिए डीआईसी ऑप्टिक्स का उपयोग करके कल्पना की जाती है। श्रवण तंत्रिका की प्रत्यक्ष उत्तेजना के रूप में यह श्रवण ब्रेनस्टेम में प्रवेश करती है, आंतरिक सीएन सर्किट गतिविधि और सिनैप्टिक प्लास्टिसिटी के लिए अनुमति देने के लिए MOC न्यूरॉन्स के ऊपर synapses पर होने के लिए किया जाता है । इस तकनीक के साथ, कोई भी स्लाइस के भीतर जितना संभव हो उतना बारीकी से वीवो सर्किट सक्रियण में नकल कर सकता है। यह वेज स्लाइस तैयारी अन्य मस्तिष्क सर्किट पर लागू होती है जहां सर्किट विश्लेषण इन विट्रो स्लाइस फिजियोलॉजी के तकनीकी फायदों के संयोजन में अपस्ट्रीम कनेक्टिविटी और लंबी दूरी के आदानों के संरक्षण से लाभान्वित होंगे।

वेज स्लाइस की हिस्टोलॉजिकल परीक्षा श्रवण ब्रेनस्टेम न्यूरॉन समारोह की हमारी जांच के लिए, कील टुकड़ा तैयारी रिकॉर्डिंग के लिए लक्षित MOC न्यूरॉन्स के लिए श्रवण तंत्रिका जड़ और CN contralateral को नियंत्र?...

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In Vitro Wedge Slice Preparation for Mimicking In Vivo Neuronal Circuit Connectivity

न्यूरॉन्स के लिए विविध सिनैप्टिक आदानों का एकीकरण सबसे अच्छा एक तैयारी है कि प्राकृतिक समय और सर्किट प्लास्टिसिटी के लिए सभी पूर्व सिनैप्टिक नाभिक को बरकरार रखता है में मापा जाता है, लेकिन मस्तिष्क स्लाइस आम तौर पर कई कनेक्शन तोड़ । हमने विट्रो प्रयोग क्षमता को बनाए रखते हुए वीवो सर्किट गतिविधि में नकल करने के लिए एक संशोधित मस्तिष्क टुकड़ा विकसित किया।

विवो न्यूरोनल सर्किट कनेक्टिविटी में नकल करने के लिए इन विट्रो वेज स्लाइस तैयारी

In vitro slice electrophysiology techniques measure single-cell activity with precise electrical and temporal resolution. Brain slices must be relatively ...

मस्तिष्क टुकड़ा प्रयोग उच्च विद्युत और लौकिक संकल्प के साथ न्यूरोनल फ़ंक्शन से पूछताछ की अनुमति देते हैं, लेकिन ये स्लाइस आमतौर पर कई प्रेसिनैप्टिक कनेक्शन तोड़ देते हैं। एक कील के आकार का टुकड़ा अधिक बरकरार प्रेसिनैप्टिक सर्किटरी रखता है। यह संशोधित मस्तिष्क टुकड़ा विवो-जैसे न्यूरोनल सर्किट में अधिक पूर्ण रखता है, जबकि इन विट्रो प्रयोग के लाभ प्रदान करता है, जैसे नेत्रहीन निर्देशित पैच क्लैंप रिकॉर्डिंग, फार्माकोलॉजी और गतिविधि इमेजिंग।सर्किट के भीतर न्यूरॉन्स के एटलस स्थानों के आधार पर सटीक वेज कटा हुआ ज्यामिति का अनुमान लगाया जा सकता है, लेकिन प्रेसिनैप्टिक स्कीमा और एक्सॉन की अखंडता हिस्टोरोलॉजी का उपयोग करके निर्धारित की जानी चाहिए। नाक से गर्दन के पीछे तक खोपड़ी के मिडलाइन पर त्वचा को काटने के लिए एक रेजर ब्लेड का उपयोग करके शुरू करें। खोपड़ी को बेनकाब करने और खोपड़ी के आधार पर शुरू करने और नाक की ओर जारी रखने के लिए त्वचा को वापस छीलें, मिडलाइन के माध्यम से खोपड़ी में चीरा लगाने के लिए छोटी कैंची का उपयोग करें।लैम्ब्डा सीवन में, मस्तिष्क को बेनकाब करने के लिए खोपड़ी को वापस छीलने के लिए दोनों तरफ कान की ओर मध्यरेखा से खोपड़ी में कटौती करें। रोस्ट्रल एंड से शुरू, ऑप्टिक नसों को कटे होने की अनुमति देने के लिए धीरे-धीरे खोपड़ी से मस्तिष्क को उठाने के लिए एक छोटी प्रयोगशाला स्पैटुला का उपयोग करें। धीरे से मस्तिष्क को पीछे की ओर काम करना जारी रखें, वेंट्रल सतह को उजागर करें और उन्हें काटने के लिए ब्रेनस्टेम की वेंट्रल सतह के पास ट्राइजेमिनल नसों को ध्यान से चुटकी लेने के लिए ठीक संदंश का उपयोग करें।तैयारी को ठंडे टुकड़ा करने की क्रिया के घोल से भरे ग्लास पेट्री डिश में रखें और डिश को विच्छेदन माइक्रोस्कोप के नीचे रखें। वेस्टीबुलोकोचलियर नसों को बेनकाब करने के लिए चेहरे की नसों को ब्रेनस्टेम के करीब ट्रिम करें। सुझावों को फोरमिना में धकेलने के लिए ठीक संदंश का उपयोग करें जहां वेस्टीबुलोकोचलियर तंत्रिका जहां तक संभव हो खोपड़ी से बाहर निकलती है।दोनों तरफ की नसों को तोड़ने के लिए चुटकी, ब्रेनस्टेम से जुड़ी तंत्रिका जड़ को छोड़ दें। ट्रैपेजॉइड शरीर के पास ब्रेनस्टेम की वेंट्रल सतह से मेनिंग्स और वैक्यूलेचर को हटा दें। फिर शेष कपाल नसों और संयोजी ऊतक चुटकी मस्तिष्क पूरी तरह से खोपड़ी से मुक्त करने के लिए, शेष रीढ़ की हड्डी को संरक्षित करने के लिए ध्यान दे, यदि संभव हो तो ।चरण में स्थिरता के लिए मस्तिष्क की सतह तैयार करने के लिए मस्तिष्क वेंट्रल साइड को ऊपर रखें और मस्तिष्क के ऊतकों को स्थिर करने के लिए रीढ़ की हड्डी को धीरे से स्थिर करने के लिए एक कुंद उपकरण का उपयोग करें। डिश के नीचे करने के लिए मस्तिष्क के माध्यम से एक लगभग 20 डिग्री कोण पर खुला संदंश डालें ताकि युक्तियां ऑप्टिक चिम करने के लिए मस्तिष्क कौडल की पृष्ठीय सतह से बाहर निकलें और संदंश के साथ कटौती करने के लिए एक रेजर ब्लेड का उपयोग करें । इसके बाद, 4% एगर का एक घन सेंटीमीटर ब्लॉक तैयार करें और चरण पर एक आयत में गोंद की एक छोटी बूंद फैलाएं।मस्तिष्क को ध्यान से उठाने के लिए संदंश का उपयोग करें और धीरे-धीरे एक पेपर तौलिया के किनारे के साथ अतिरिक्त तरल को डब करें। फिर अवरुद्ध सतह को गोंद पर रखें ताकि वेंट्रल सतह टुकड़ा करने की क्रिया के दौरान ब्लेड की दिशा का सामना कर रही हो और एक समर्थन के रूप में पृष्ठीय सतह के खिलाफ धीरे-धीरे आगर ब्लॉक को धक्का दे। मोटी तरफ कॉकलियर तंत्रिका जड़ और मध्य तर ओलिवोकोक्लियर न्यूरॉन्स और पतली तरफ ट्रैपेज़ोइड शरीर के मध्यीय नाभिक के साथ कील स्लाइस प्राप्त करने के लिए, चुंबकीय डिस्क को संलग्न मस्तिष्क के साथ चरण धारक पर रखें और धारक को ब्लेड की ओर उन्मुख मस्तिष्क की वेंट्रल सतह के साथ कंपन के टुकड़ा करने वाले कक्ष में रखें।बर्फ ठंड टुकड़ा करने की क्रिया समाधान के साथ चैंबर भरें और कार्बोजन बुलबुला समाधान में ब्लेड कम। स्लाइस सममित हैं सुनिश्चित करने के लिए ब्याज के क्षेत्र में कट स्लाइस कौडल। फिर चरण को लगभग 15 डिग्री एक तरफ शिफ्ट करें।जब तक श्रवण तंत्रिका जड़ एक तरफ सतह के करीब न हो जाए तब तक ध्यान से टुकड़ा करना जारी रखें और चेहरे की तंत्रिका को स्लाइस के दूसरी तरफ की सतह पर देखा जा सकता है। चरण 15 डिग्री को मूल स्थिति में वापस स्थानांतरित करें और ब्लेड को ऊतक से दूर ले जाएं। मंच आधार 90 डिग्री स्पिन इतना है कि पतली तरफ के पार्श्व किनारे ब्लेड का सामना करना पड़ रहा है और धीरे से ऊतक के किनारे के करीब ब्लेड लाने से पहले ब्लेड कई सौ माइक्रोन कम।ब्लेड के साथ स्लाइस के पतले किनारे की वांछित मोटाई के लिए ब्लेड को थोड़ा कम कर दिया। ब्लेड को ऊतक से वापस ले जाएं और स्टेज बेस को वापस स्पिन करें ताकि वेंट्रल सतह चरण आधार का सामना कर सके। वेज स्लाइस की रोस्ट्रल सतह को नामित करने के लिए एक कट बनाएं और स्लाइस को इंटरफ़ेस पेपर कौडल सतह के एक वर्ग सेंटीमीटर टुकड़े में स्थानांतरित करें।चेहरे की तंत्रिका रोस्ट्रल सतह पर स्लाइस के दोनों गोलार्द्धों पर दिखाई नी चाहिए। फिर स्लाइस को 30 मिनट के लिए ठीक करने के लिए 35 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेशन कक्ष में ले जाएं। इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी विश्लेषण के लिए कील टुकड़ा स्थापित करने के लिए नमूना एक रिकॉर्डिंग कक्ष में जगह है कि लगातार ३५ डिग्री सेल्सियस ACSF के साथ perfused किया जा रहा है और टुकड़ा स्थिर ।डीआईसी प्रकाशिकी का उपयोग करके, स्लाइस के मोटे पक्ष पर श्रवण तंत्रिका जड़ पर ध्यान केंद्रित करें और एक माइक्रोमैनिपलेटर का उपयोग करें ताकि द्विध्रुवी टंगस्टन उत्तेजक इलेक्ट्रोड को श्रवण तंत्रिका जड़ में ले जाया जा सके और धीरे-धीरे ऊतक की सतह में जा सके। देखने के क्षेत्र को पतली तरफ ट्रैपेज़ाइड शरीर के वेंट्रल नाभिक में ले जाएं और 561 नैनोमीटर उत्सर्जन फिल्टर का उपयोग करके एपिफ्लोरेसेंस के तहत पैच क्लैंप इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी के लक्ष्य के रूप में एक मध्यवर्ती ओलिवोकोक्लियर न्यूरॉन का चयन करें। प्रस्तावित प्रयोग के लिए उपयुक्त आंतरिक समाधान के साथ और डीआईसी ऑप्टिक्स पैच के तहत और पूरे सेल विन्यास में मध्यम ओलिवोकोक्लीयर न्यूरॉन से रिकॉर्ड के साथ एक रिकॉर्डिंग पिपेट भरें।मध्यीय ओलिवोकोचलियर न्यूरॉन में लगातार पोस्टसिनैप्टिक घटनाओं को प्राप्त करने के लिए श्रवण तंत्रिका जड़ के विद्युत उत्तेजना आयाम को समायोजित करें। फिर मध्यीय ओलिवोकोचलियर न्यूरॉन्स में पैदा की गई सिनैप्टिक धाराओं का निरीक्षण करने के लिए उचित उत्तेजना प्रोटोकॉल चलाएं। इस वेज स्लाइस तैयारी को रिकॉर्डिंग के लिए लक्षित मध्यीय ओलिवोकोकलियर न्यूरॉन्स के लिए श्रवण तंत्रिका जड़ और कॉकलियर नाभिक कॉन्ट्रालेट्रल को शामिल करने के लिए डिज़ाइन किया गया है।इस क्रेसिल वायलेट दाग वेज स्लाइस में कॉकलियर नाभिक लगभग अपने पूर्ण रोस्ट्रल-कौडल सीमा में मौजूद है। और श्रवण तंत्रिका जड़ कॉकलियर नाभिक में प्रवेश करते हुए देखा जाता है। इसके अलावा, वेज स्लाइस में ट्रैपेज़ाइड शरीर के मध्यीय नाभिक के न्यूरॉन्स होते हैं जो मध्यकालीन ओलिवोकोचलियर न्यूरॉन्स से होते हैं जिनसे रिकॉर्डिंग की जाती है।एक वेज स्लाइस प्रेसिनैप्टिक इनपुट के भीतर न्यूरोनल कनेक्टिविटी की पुष्टि करने के लिए दो तरीकों से उत्तेजित होते हैं। सबसे पहले, मिडलाइन पर वेंट्रल ध्वनिक स्ट्राइट विद्युत रूप से उत्तेजित होता है, टी-स्टेलेट एक्सॉन को सीधे सक्रिय करता है और गोलाकार जंगली कोशिका एक्सॉन उत्तेजना के माध्यम से ट्रैपेज़ाइड शरीर न्यूरॉन्स के मध्यीय नाभिक और परिणामस्वरूप पोस्टसिनैप्टिक धाराएं होती हैं जिन्हें मध्यवंशीय न्यूरॉन पर मापा जाता है। श्रवण तंत्रिका जड़ तो पूरे मोनार्ल आरोही ब्रेनस्टेम सर्किटरी को सक्रिय करने और पोस्टसाइनाप्टिक प्रतिक्रियाओं को पैदा करने के लिए प्रेरित किया जाता है।श्रवण तंत्रिका उत्तेजना के साथ पैदा किए गए वेंट्रल ध्वनिक स्ट्राइटा की सीधी उत्तेजना के साथ पैदा किए गए पहले पोस्टसिनैप्टिक वर्तमान के शुरुआत विलंबता उपायों की तुलना श्रवण तंत्रिका उत्तेजना घटना में काफी लंबी विलंबता का पता चलता है, जो श्रवण तंत्रिका उत्तेजना के दौरान सक्रिय अतिरिक्त कॉकलियर नाभिक सिंप्स के परिणामस्वरूप सिंपटिक देरी का संकेत देता है। शारीरिक स्थलों का उपयोग और चुंबकीय डिस्क चरण के सावधान पैंतरेबाज़ी बरकरार न्यूरोनल सर्किटरी और विश्वसनीय पैदा पोस्ट सिनैप्टिक प्रतिक्रियाओं के साथ कील स्लाइस बनाने के लिए महत्वपूर्ण हैं। यह टुकड़ा करने की क्रिया तकनीक कैल्शियम या वोल्टेज इमेजिंग, ऑप्टोजेनेटिक्स, न्यूरोट्रांसमीटर अनकेजिंग, और इंट्रासेलुलर और एक्सट्रासेलुलर फार्माकोलॉजी दोनों सहित अतिरिक्त इन विट्रो इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी उपकरणों का उपयोग करने के लिए एक मंच प्रदान करती है।

Research

JoVE Journal

Neuroscience

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