Name: in vitro wedge slice preparation for mimicking in vivo neuronal circuit connectivity
Uploaded: 2020-08-18T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about In Vitro Wedge Slice Preparation for Mimicking In Vivo Neuronal Circuit Connectivity at JoVE.com

Questa ricerca è stata supportata dal Programma di ricerca intramurale del NIH, NIDCD, Z01 DC000091 (CJCW).

Tutte le procedure sperimentali sono state approvate dal National Institute of Neurological Disorders and Stroke/National Institute on Deafness and Other Communication Disorders Animal Care and Use Committee.
1. Preparazioni sperimentali
NOTA: I dettagli relativi alla preparazione delle fette, tra cui la soluzione di affettare, la temperatura di affezione, la temperatura e l'apparato di incubazione delle fette (ecc.) sono specifici per la preparazione del tronco encef...

La procedura di affettare qui descritta come una fetta di cuneo è potente per mantenere intatti circuiti neuronali presnaptici, ma con l'accessibilità della sperimentazione della fetta cerebrale per l'analisi della funzione neuronale. Occorre fare molta attenzione in diversi passaggi iniziali al fine di massimizzare l'utilità della preparazione per l'analisi del circuito. Le dimensioni del cuneo devono essere confermate mediante esame istologico, che è parte integrante della conferma che sia i nuclei presnaptici che ...

L'osservazione dell'attività dei circuiti neurali viene eseguita idealmente con input sensoriali e feedback nativi e connettività intatta tra le regioni cerebrali, in vivo. Tuttavia, l'esecuzione di esperimenti che danno una risoluzione a una cellula della funzione del circuito neurale è ancora limitata da sfide tecniche nel cervello intatto. Mentre l'elettrofisiologia extracellulare in vivo o i metodi di imaging multifotonica possono essere utilizzati per studiare l'attività in sistemi nervosi intatti, interpretare come diversi input integrino o misurino gli input sinaptici sottosoglie rimane difficile. Le registrazioni intere cellulari in vivo superano questi limiti ma sono difficili da eseguire, anche nelle regioni cerebrali facilmente accessibili. Le sfide tecniche degli esperimenti di risoluzione a singola cellula sono ulteriormente amplificate in alcune popolazioni neuronali che si trovano in profondità nel cervello, o in popolazioni spazialmente diffuse che richiedono strumenti genetici per localizzare le cellule in vivo (ad esempio, espressione genetica della channelrhodopsina abbinata alla registrazione optrode) o identificazione istochimica post-hoc dopo la registrazione dell'etichettatura del sito (ad esempio con marcatori specifici della neurotrasmissione). Essendo situati diffusamente vicino alla superficie ventrale del tronco encefalico, i neuroni olivocochlear mediali (MOC) soffrono dei limiti di cuisopra 1,rendendoli estremamente difficili da accedere per la sperimentazione in vivo.
Le fette cerebrali (~100-500 μm di spessore) sono state a lungo utilizzate per studiare i circuiti cerebrali, compresi i circuiti uditivi del tronco encefalico, a causa della segregazione fisica dei neuroni collegati che sono contenuti all'interno dellastessa fetta 2,3,4,5,6,7,8,9. Esperimenti che utilizzano fette molto più spesse (>1 mm) sono stati impiegati in altri laboratori per capire come gli input bilaterali si integrano nelle aree del complesso olivario superiore (SOC) tra cui l'oliva medialesuperiore 10,11. Queste fette sono state preparate in modo tale che gli assoni del nervo uditivo (AN) sono rimasti intatti all'interno della fetta e sono stati stimolati elettricamente ad avviare il rilascio di neurotrasmettitori sinaptici nel CN, imitando l'attività dei neuroni uditivi di primo ordine mentre rispondevano al suono. Uno dei principali svantaggi di queste fette spesse è la visibilità dei neuroni per le registrazioni elettrofisiofisioche patch-clamp ("patching"). L'applicazione di patch diventa sempre più difficile man mano che i numerosi assoni in quest'area si mielivano conl'età di 12,13,14,15anni, rendendo il tessuto otticamente denso e oscurando i neuroni anche in una tipica, sottile fetta cerebrale. Il nostro obiettivo è quello di creare preparati in vitro che assomiglino più strettamente alla connettività del circuito delle registrazioni in vivo, ma con le capacità di registrazione ad alta produttività e ad alta risoluzione dell'elettrofisiologia patch-clamp guidata visivamente nelle fette cerebrali.
Il nostro laboratorio studia la fisiologia dei neuroni del sistema efferente uditivo, compresi i neuroni MOC. Questi neuroni colinergici forniscono un feedback efferente alla coclea modulando l'attività delle cellule ciliate esterne (OHC)16,17,18,19,20. Studi precedenti hanno dimostrato che questa modulazione gioca un ruolo nel controllo del guadagno nella cochlea21,22,23,24,25,26 e protezione dal trauma acustico27,28,29,30,31,32,33. Nei topi, i neuroni MOC si trovano diffusamente nel nucleo ventrale del corpo trapezoiato (VNTB) nel tronco uditivo1. Il nostro gruppo ha utilizzato la linea di topi ChAT-IRES-Cre incrociata con la linea del mouse tdTomato reporter per colpire i neuroni MOC in fette di tronco encefalico sotto illuminazione epifluorescente. Abbiamo dimostrato che i neuroni MOC ricevono un input inibitoriofferente dal nucleo mediale ipsilaterale del corpo trapezoiato (MNTB), che è eccitato, a sua volta, dagli assoni delle cellule folte globulari (GBC) nel nucleo cocleare conlaterale (CN)34,35,36,37,38. Inoltre, i neuroni MOC probabilmente ricevono il loro input eccitatorio dalle cellule T-stellate nel contralaterale CN39,40,41. Nel loro insieme, questi studi mostrano che i neuroni MOC ricevono sia input eccitatori che inibitori derivati dallo stesso orecchio (contralaterale). Tuttavia, i neuroni presnaptici, e i loro assoni che convergono sui neuroni MOC, non sono abbastanza vicini l'uno all'altro per essere completamente intatti in una tipica preparazione delle fette coronali. Per indagare come l'integrazione degli input sinaptici ai neuroni MOC influenzi i loro potenziali schemi di fuoco d'azione, con particolare attenzione all'inibizione appena descritta, abbiamo sviluppato una preparazione in cui potremmo stimolare i diversi afferenti ai neuroni MOC da un orecchio nel modo più fisiologicamente realistico possibile, ma con i benefici tecnici degli esperimenti in vitro sulle fette cerebrali.
La fetta di cuneo è una preparazione di fette spesse modificata progettata per lo studio dell'integrazione del circuito nei neuroni MOC (schematizzata nella figura 1A). Sul lato spesso della fetta, il cuneo contiene gli assoni mozzati del nervo uditivo (chiamato "radice nervosa uditivo" di seguito) mentre entrano nel tronco encefalico dalla periferia e dalla sinapsi nel CN. La radice nervosa uditivo può essere stimolata elettricamente per evocare il rilascio di neurotrasmettitori e l'attivazione sinaptica delle cellule del CN42completamenteintatto,43,44,45,46. Questo formato di stimolazione ha diversi vantaggi per l'analisi del circuito. In primo luogo, invece di stimolare direttamente gli assoni T-stellati e GBC che forniscono un input afferente ai neuroni MOC, stimoliamo l'AN per consentire l'attivazione di circuiti intrinseci abbondanti nel CN. Questi circuiti modulano l'uscita dei neuroni CN ai loro obiettivi in tutto il cervello, compresi i neuroni MOC46,47,48,49,50,51. In secondo luogo, l'attivazione polisinaptica di circuiti afferenti dall'AN attraverso il CN a monte dei neuroni MOC consente tempi di attivazione più naturali e la plasticità a queste sinapsi come sarebbero in vivo durante la stimolazione uditivo. In terzo luogo, possiamo variare i nostri modelli di stimolazione per imitare l'attività AN. Infine, sia le proiezioni monoali eccitatorie che inibitorie ai neuroni MOC sono intatte nella fetta di cuneo e la loro integrazione può essere misurata su un neurone MOC con la precisione dell'elettrofisiologia patch-clamp. Nel complesso, questo schema di attivazione fornisce un circuito più intatto ai neuroni MOC rispetto a una tipica preparazione delle fette cerebrali. Questa fetta di cuneo del tronco encefalico può anche essere utilizzata per indagare altre aree uditivi che ricevono input inibitori da MNTB ipsilaterale tra cui l'oliva superiore laterale, il nucleo olivario superiore e l'oliva superiore mediale10,11,52,53,54,55,56. Oltre alla nostra preparazione specifica, questo metodo di affezione può essere utilizzato o modificato per valutare altri sistemi con i vantaggi di mantenere la connettività degli input a lungo raggio e migliorare la visualizzazione dei neuroni per una varietà di tecniche di elettrofisiologia o imaging a risoluzione a singola cellula.
Questo protocollo richiede l'uso di uno stadio o di una piattaforma del vibratomo che può essere inclinato di circa 15°. Qui usiamo uno stadio magnetico a 2 pezzi disponibile in commercio in cui lo "stadio" è un disco metallico con un fondo curvo posto in una "base dello stadio" magnetica concava. Il palco può quindi essere spostato per regolare l'angolo della fetta. I cerchi concentrici sulla base dello stadio vengono utilizzati per stimare l'angolo in modo riproducibile. La base dello stadio e dello stadio è posizionata nella camera di affezione, dove può anche essere ruotata la base dello stadio magnetico.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Experimental Preparations</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar, powder</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP1423500</td>
			<td>4% agar block used to stabilize brain tissue during vibratome sectioning</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AlexaFluor Hydrazide 488</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A10436</td>
			<td>Fluorophore used in internal solution to confirm successful MOC neuron patch</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Analytical Balance</td>
			<td>Geneses Scientific (Intramalls)</td>
			<td>AV114</td>
			<td>Weighing chemicals</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Double edged razor blade</td>
			<td>Ted Pella</td>
			<td>121-6</td>
			<td>Vibratome cutting blade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kynurenic acid (5g)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>K3375-5G</td>
			<td>Slicing ACSF additive used to reduce neuron activity during dissection and slicing in order to improve tissue health for patch clamping</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH Meter</td>
			<td>Fisher Scientific (Intramalls)</td>
			<td>13-620-451</td>
			<td>Solution pH tester</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic petri dishes 100mm dia X 20mm</td>
			<td>Fisher Scientific (Intramalls)</td>
			<td>12-556-002</td>
			<td>4% Agar Prep</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stirring Hotplate</td>
			<td>Fisher Scientific (Intramalls)</td>
			<td>11-500-150</td>
			<td>Heating for 4% Agar preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissection and Slicing</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biocytin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>B4261-250MG</td>
			<td>Chemical used for axonal tracing (conjugated to Streptavidin 488)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting Microscope</td>
			<td>Amscope</td>
			<td>SM-1BN</td>
			<td>For precision dissection during brain removal</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #5 Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11252-20</td>
			<td>Fine forceps dissection tool</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Economy tweezers #3</td>
			<td>WPI</td>
			<td>501976</td>
			<td>Forceps dissection tool</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Petri Dish 150mm dia x 15mm H</td>
			<td>Fisher Scientific (Intramalls)</td>
			<td>08-747E</td>
			<td>Dissection dish</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Interface paper (203 X 254mm PCTE Membrane 10um)</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td>1220823</td>
			<td>Slice incubation/biocytin application</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica VT1200S Vibratome</td>
			<td>Leica</td>
			<td>1491200S001</td>
			<td>Vibratome for wedge slice sectioning</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mayo scissors</td>
			<td>Roboz</td>
			<td>RS-6872</td>
			<td>Dissection tool</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Single-edged carbon steel blades</td>
			<td>Fisher Scientific (Intramalls)</td>
			<td>12-640</td>
			<td>Razor blade for dissection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Specimen disc, orienting</td>
			<td>Leica</td>
			<td>14048142068</td>
			<td>Specialized vibratome stage for reproducible tilting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spoonula</td>
			<td>FisherSci</td>
			<td>14-375-10</td>
			<td>Dissection tool</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Super Glue</td>
			<td>Newegg</td>
			<td>15187</td>
			<td>Used for glueing tissue to vibratome stage</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vannas Spring Scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>91500-09</td>
			<td>Dissection tool</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electrophysiology</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>A1R Upright Confocal Microscope</td>
			<td>Nikon Instruments</td>
			<td></td>
			<td>Electrophysiology and imaging microscope, can be any microscope compatible with electrophysiology</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electrode Borosilicate glass w/ Filament OD 1.5mm, ID 1.1mm, 10 cm long</td>
			<td>Sutter Instrument</td>
			<td>BF150-110-10</td>
			<td>Patch clamping pipette glass</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electrode Filler MicroFil</td>
			<td>WPI</td>
			<td>CMF20G</td>
			<td>Patch electrode pipette filler</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>In-line solution heater</td>
			<td>Warner Instruments (GSAdvantage)</td>
			<td>SH-27B</td>
			<td>Slice perfusion system heater</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multi-Micromanipulator Systems</td>
			<td>Sutter Intruments</td>
			<td>MPC-200 with MP285</td>
			<td>Micromanipulators for patch clamp and stimulation electrode placement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P-1000 horizontal pipette puller for glass micropipettes</td>
			<td>Sutter instruments</td>
			<td>FG-P1000</td>
			<td>Patch clamp pipetter puller</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Patch-clamp amplifier and Software</td>
			<td>HEKA</td>
			<td>EPC-10 / Patchmaster Next</td>
			<td>Can be any amplifier/software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recording Chamber</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>RC26G</td>
			<td>Slice &#34;bath&#34; during recording</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recording Chamber Harp</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>640253</td>
			<td>Stablizes slice during electrophysiology recording</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slice Incubation Chamber</td>
			<td>Custom Build</td>
			<td></td>
			<td>Heated, oxygenated holding chamber for slices during recovery after slicing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stimulus isolation unit</td>
			<td>A.M.P.I.</td>
			<td>Iso-Flex</td>
			<td>Stimulus isolation unit for electrophysiology</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe 60CC</td>
			<td>Fischer Scientific (Intramalls)</td>
			<td>14-820-11</td>
			<td>Electrophysiology perfusion fluid handling</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Temperature controller</td>
			<td>Warner Instruments (GSAdvantage)</td>
			<td>TC-324C</td>
			<td>Slice perfusion system temperature controller</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tubing 1/8 OD 1/16 ID</td>
			<td>Fischer Scientific (Intramalls)</td>
			<td>14-171-129</td>
			<td>Electrophysiology perfusion fluid handling</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tugsten concentric bipolar microelectrode</td>
			<td>WPI</td>
			<td>TM33CCINS</td>
			<td>Stimulating electrode for electrophysiology</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Histology</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24 well Plate</td>
			<td>Fisher Scientific (Intramalls)</td>
			<td>12-556006</td>
			<td>Histology slice collection and immunostaining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 Streptavidin</td>
			<td>Jackson Immuno labs</td>
			<td>016-540-084</td>
			<td>Secondary antibody for biocytin visualization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning Orbital Shaker</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>CLS6780FP</td>
			<td>Shaker for immunohistochemistry agitation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cresyl Violet Acetate</td>
			<td>Sigma Aldrich (Intramalls)</td>
			<td>C5042-10G</td>
			<td>Cellular stain for histology</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable Microtome Blades</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>22-210-052</td>
			<td>Sliding microtome blade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter-syringe Nalgene 4mm Cellulose Acetate 0.2um</td>
			<td>Fisher Scientific (Intramalls)</td>
			<td>09-740-34A</td>
			<td>Syringe filter for filling recording pipettes with internal solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluoromount-G Slide Mounting Medium</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>OB100-01</td>
			<td>Immunohistochemistry fluorescence mounting medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glass slide staining dish with rack</td>
			<td>Fisher Scientific (Intramalls)</td>
			<td>08-812</td>
			<td>Cresyl Violet staining chamber</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microm HM450 Sliding Microtome</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>910020</td>
			<td>Freezing microtome for histology</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Cover Glasses: Rectangles 50mm X 24mm</td>
			<td>Fisher Scientific (Intramalls)</td>
			<td>12-543D</td>
			<td>Histochemistry slide cover glass</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Permount mounting medium</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>SP15-100</td>
			<td>Cresyl violet section mounting medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superfrost Slides</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>22-034980</td>
			<td>Histology slides</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vitro wedge slice preparation for mimicking in vivo neuronal circuit connectivity

Le tecniche di elettrofisiologia a fette in vitro misurano l'attività a singola cellula con una precisa risoluzione elettrica e temporale. Le fette cerebrali devono essere relativamente sottili per visualizzare e accedere correttamente ai neuroni per il bloccaggio delle patch o l'imaging, e l'esame in vitro dei circuiti cerebrali è limitato solo a ciò che è fisicamente presente nella fetta acuta. Per mantenere i benefici della sperimentazione di fette in vitro preservando una porzione maggiore di nuclei presnaptici, abbiamo sviluppato una nuova preparazione di fette. Questa "fetta di cuneo" è stata progettata per le registrazioni di elettrofisiologia patch-clamp per caratterizzare i diversi input monaurali e sound-driven ai neuroni olivocochlear mediali (MOC) nel tronco encefalico. Questi neuroni ricevono i loro input eccitatori e inibitori afferenti primari dai neuroni attivati dagli stimoli nell'orecchio contralaterale e dal corrispondente nucleo cocleare (CN). È stata progettata una fetta cerebrale asimmetrica che è più spessa nel dominio rostro-caudale sul bordo laterale di un emisfero e poi si assottiglia verso il bordo laterale dell'emisfero opposto. Questa fetta contiene, sul lato spesso, la radice nervosa uditiva che trasmette informazioni sugli stimoli uditivi al cervello, sui circuiti NC intrinseci e sia sulle vie afferenti inibitorie disinaptiche che trisintottiche che convergono sui neuroni MOC contralaterali. La registrazione viene eseguita dai neuroni MOC sul lato sottile della fetta, dove vengono visualizzati utilizzando l'ottica DIC per tipici esperimenti patch-clamp. La stimolazione diretta del nervo uditivo viene eseguita mentre entra nel tronco uditivo, consentendo l'attività intrinseca del circuito CN e la plasticità sinaptica a sinapsi a monte dei neuroni MOC. Con questa tecnica, si può imitare l'attivazione del circuito in vivo il più vicino possibile all'interno della fetta. Questa preparazione della fetta di cuneo è applicabile ad altri circuiti cerebrali in cui le analisi dei circuiti beneficeranno della conservazione della connettività a monte e degli input a lungo raggio, in combinazione con i vantaggi tecnici della fisiologia delle fette in vitro.

Esame istologico della fetta di cuneo Per la nostra indagine sulla funzione neuronale del tronco encefalico uditivo, la preparazione della fetta di cuneo è stata progettata per contenere la radice nervosa uditivo e il contralaterale CN ai neuroni MOC destinati alle registrazioni (fetta di esempio mostrata nella figura 1B). L'esame istologico iniziale del preparato è importante per confermare che la fetta contiene i nuclei necessari per l'attivazione del circuito e che l...

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In Vitro Wedge Slice Preparation for Mimicking In Vivo Neuronal Circuit Connectivity

L'integrazione di diversi input sinaptici ai neuroni è meglio misurata in una preparazione che preserva tutti i nuclei pre-sinaptici per la tempismo naturale e la plasticità del circuito, ma le fette cerebrali in genere tagliano molte connessioni. Abbiamo sviluppato una fetta cerebrale modificata per imitare l'attività del circuito in vivo mantenendo la capacità di sperimentazione in vitro.

Preparazione della fetta di cuneo in vitro per imitare la connettività del circuito neuronale in vivo

In vitro slice electrophysiology techniques measure single-cell activity with precise electrical and temporal resolution. Brain slices must be relatively ...

Gli esperimenti sulle fette cerebrali consentono l'interrogatorio della funzione neuronale con un'alta risoluzione elettrica e temporale, ma queste fette in genere tagliano molte connessioni presnaptiche. Una fetta a forma di cuneo mantiene un circuito presettico più intatto. Questa fetta cerebrale modificata mantiene un circuito neuronale in vivo più completo, fornendo al contempo i benefici della sperimentazione in vitro, come registrazioni di patch clamp guidate visivamente, farmacologia e imaging di attività.La geometria a cuneo accurata può essere stimata in base alle posizioni dell'atlante dei neuroni all'interno del circuito, ma l'integrità degli schemi e degli assoni presnaptici dovrebbe essere determinata usando l'istologia. Inizia usando una lama di rasoio per tagliare la pelle alla linea mediana del cranio dal naso alla parte posteriore del collo. Sbucciare la pelle per esporre il cranio e partendo dalla base del cranio e continuando verso il naso, utilizzare piccole forbici per fare un'incisione nel cranio attraverso la linea mediana.Alla sutura lambda, fai tagli nel cranio dalla linea mediana lateralmente verso l'orecchio su entrambi i lati per sbucciare il cranio per esporre il cervello. A partire dall'estremità rostrale, utilizzare una piccola spatola da laboratorio per sollevare delicatamente il cervello dal cranio per consentire la recisa dei nervi ottici. Continuare a lavorare delicatamente il cervello all'indietro, esponendo la superficie ventrale e utilizzare forcep fini per pizzicare con cura i nervi trigeminali vicino alla superficie ventrale del tronco encefalico per tagliarli.Mettere la preparazione in una piastra di Petri di vetro riempita con soluzione di affezione a freddo e posizionare la piastra al microscopio di sezionamento. Tagliare i nervi facciali vicino al tronco encefalico per esporre i nervi vestibulocochleari. Usa le forcep fini per spingere le punte nella foramina dove il nervo vestibulocochlear esce il cranio il più lontano possibile.Pizzicare per severare i nervi su entrambi i lati, lasciando la radice nervosa attaccata al tronco encefalico. Rimuovere le meningi e la vascucolatura dalla superficie ventrale del tronco encefalico vicino al corpo trapezoiato. Quindi pizzicare i restanti nervi cranici e il tessuto connettivo per liberare completamente il cervello dal cranio, facendo attenzione a preservare il midollo spinale rimanente, se possibile.Per preparare la superficie del cervello per l'apparecchio allo stadio posizionare il lato ventrale cerebrale verso l'alto e utilizzare uno strumento smussato per immobilizzare delicatamente il midollo spinale per stabilizzare il tessuto cerebrale. Inserire le forcep aperte con un angolo di circa 20 gradi attraverso il cervello fino alla parte inferiore del piatto in modo che le punte escano dalla superficie dorsale del cervello caudale al chiasmo ottico e utilizzare una lama di rasoio per tagliare lungo le forcep. Quindi, preparare un blocco di un centimetro cubo del 4%agar e stendere una piccola goccia di colla in un rettangolo sul palco.Utilizzare le forcep per sollevare con cura il cervello e tamponare delicatamente il liquido in eccesso con il bordo di un tovagliolo di carta. Quindi posizionare la superficie bloccata sulla colla in modo che la superficie ventrale sia rivolta verso la direzione della lama durante l'affettamento e spingere delicatamente il blocco di agar contro la superficie dorsale come supporto. Per acquisire fette di cuneo con la radice nervosa cocleare sul lato spesso e i neuroni olivocochleari mediali e il nucleo mediale del corpo trapezoiato sul lato sottile, posizionare il disco magnetico con il cervello attaccato sul supporto dello stadio e posizionare il supporto nella camera di affezione di un vibratome con la superficie ventrale del cervello orientata verso la lama.Riempire la camera con soluzione di affettamento ghiacciato e abbassare la lama nella soluzione a bolle di carbogeno. Tagliare le fette caudali nella regione di interesse per assicurarsi che le fette siano simmetriche. Quindi spostare lo stadio di circa 15 gradi da un lato.Continuare a affettare attentamente fino a quando la radice del nervo uditivo è vicina alla superficie su un lato e il nervo facciale può essere visto sulla superficie dell'altro lato della fetta. Spostare lo stadio di 15 gradi nella posizione originale e allontanare la lama dal tessuto. Ruotare la base dello stadio di 90 gradi in modo che il bordo laterale del lato sottile sia rivolto verso la lama e abbassare la lama diverse centinaia di micron prima di avvicinare lentamente la lama al bordo del tessuto.Con la lama retratti leggermente abbassare la lama allo spessore desiderato del bordo sottile della fetta. Spostare la lama indietro dal tessuto e ruotare indietro la base del palco in modo che la superficie ventrale sia di fronte alla base del palco. Effettuare un taglio per designare la superficie rostrale della fetta di cuneo e trasferire la fetta su un pezzo quadrato di carta di interfaccia caudle superficie verso il basso.Il nervo facciale dovrebbe essere visibile su entrambi gli emisferi della fetta sulla superficie rostrale. Quindi spostare la fetta in una camera di incubazione di 35 gradi Celsius per recuperare per 30 minuti. Per impostare la fetta di cuneo per l'analisi elettrofisiologia, posizionare il campione in una camera di registrazione che viene continuamente perfusa con 35 gradi Celsius ACSF e stabilizzare la fetta.Utilizzando l'ottica DIC, concentrarsi sulla radice del nervo uditivo sul lato spesso della fetta e utilizzare un micromanipolatore per spostare l'elettrodo stimolante del tungsteno bipolare sulla radice nervosa uditivo e delicatamente nella superficie del tessuto. Spostare il campo visivo verso il nucleo ventrale del corpo trapezoidico sul lato sottile e selezionare un neurone olivocochlear mediale come bersaglio per l'elettrofisiologia del morsetto patch sotto epifluorescenza utilizzando un filtro di emissione da 561 nanometri. Riempire una pipetta di registrazione con la soluzione interna appropriata per l'esperimento proposto e sotto la patch ottica DIC e registrare dal neurone olivocochlear mediale nella configurazione a celle intere.Regolare l'ampiezza della stimolazione elettrica della radice nervosa uditivo per ottenere eventi postsinaptici coerenti nel neurone olivocochlear mediale. Quindi eseguire protocolli di stimolazione appropriati per osservare le correnti sinaptiche evocate nei neuroni olivocochleari mediali. Questa preparazione della fetta di cuneo è progettata per contenere la radice nervosa uditivo e il nucleo cocleare contralaterale ai neuroni olivocochleari mediali mirati per le registrazioni.In questa fetta di cuneo resezionato macchiato di viola cresile il nucleo cocleare è presente in quasi tutta la sua estensione rostrale-caudale. E la radice nervosa uditivo si osserva entrare nel nucleo cocleare. Inoltre, la fetta di cuneo contiene neuroni del nucleo mediale del corpo trapezio ipsilaterale ai neuroni olivocochleari mediali da cui vengono eseguite le registrazioni.Per confermare la connettività neuronale all'interno di una fetta di cuneo gli input presnaptici vengono stimolati in due modi. In primo luogo, la striatura acustica ventrale alla linea mediana viene stimolata elettricamente, attivando direttamente gli assoni t-stellati e il nucleo mediale dei neuroni del corpo trapezoidali attraverso la stimolazione dell'assone globulare delle cellule folte e con conseguente correnti postsinaptiche che vengono misurate al neurone olivocochleare mediale. La radice nervosa uditivo viene quindi stimolata ad attivare l'intero circuito del tronco encefalico ascendente mono e a evocare risposte postsinaptiche.Il confronto delle misure di latenza di esordio della prima corrente postinaptica evocata con la stimolazione diretta della striata acustica ventrale con quelle evocate con stimolazione nervosa uditivo rivela una latenza significativamente più lunga nell'evento di stimolazione nervosa uditivo, indicativa del ritardo sinaptico risultante dall'ulteriore sinapsi del nucleo cocleare attivata durante la stimolazione nervosa uditivo. L'uso di punti di riferimento anatomici e un'attenta manovra dello stadio del disco magnetico sono fondamentali per creare fette di cuneo con circuiti neuronali intatti e risposte post sinaptiche evocate affidabili. Questa tecnica di affettare fornisce una piattaforma per l'utilizzo di ulteriori strumenti di elettrofisiologia in vitro tra cui l'imaging di calcio o tensione, l'optogenetica, lo sconvolgimento del neurotrasmettitore e la farmacologia sia intracellulare che extracellulare.

Research

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Culture Slice organotipica del mesencefalo ventrale embrionali: un sistema per studiare dopaminergici sviluppo neuronale In vitro</em

The  mouse is an excellent model organism to study mammalian brain development due  to the abundance of molecular and genetic data. However, the ...

Functional Neuroimaging Using Ultrasonic Blood-brain Barrier Disruption and Manganese-enhanced MRI

Neuroimaging funzionale con l&#39;impiego dell&#39;ecografia emato-encefalica e la barriera di Turbativa del Manganese-enhanced MRI

Although mice are the dominant model system for studying the genetic and molecular underpinnings of neuroscience, functional neuroimaging in mice remains ...

Dual Electrophysiological Recordings of Synaptically-evoked Astroglial and Neuronal Responses in Acute Hippocampal Slices

Due registrazioni elettrofisiologiche di sinapticamente-evocati Risposte astrogliale e neuronale in acute fettine di ippocampo

Astrocytes form together with neurons tripartite synapses, where they integrate and modulate neuronal activity. Indeed, astrocytes sense neuronal inputs ...

In vivo Neuronal Calcium Imaging in C. elegans

In vivo Neuronal Calcium Imaging in C. elegans

In vivo imaging di calcio neuronale in C. elegans

The nematode worm C. elegans is an ideal model organism  for relatively simple, low cost neuronal imaging in vivo. Its small transparent body and simple, ...

Fast Micro-iontophoresis of Glutamate and GABA: A Useful Tool to Investigate Synaptic Integration

Veloce micro-ionoforesi di glutammato e GABA: un utile strumento per indagare l&#39;integrazione Synaptic

One of the fundamental interests in neuroscience is to understand the integration of excitatory and inhibitory inputs along the very complex structure of ...

Genetic Manipulation of Cerebellar Granule Neurons In Vitro and In Vivo to Study Neuronal Morphology and Migration

Genetic Manipulation of Cerebellar Granule Neurons In Vitro and In Vivo to Study Neuronal Morphology and Migration

Manipolazione genetica delle cerebellare granuli neuroni<em&gt; In Vitro</em&gt; E<em&gt; In Vivo</em&gt; Per studiare neuronale Morfologia e migrazione

Developmental events in the brain including neuronal morphogenesis and migration are highly orchestrated processes. In vitro and in vivo analyses allow ...

Brain Slice Biotinylation: An Ex Vivo Approach to Measure Region-specific Plasma Membrane Protein Trafficking in Adult Neurons

Brain Slice Biotinylation: An Ex Vivo Approach to Measure Region-specific Plasma Membrane Protein Trafficking in Adult Neurons

Slice Cervello biotinilazione: An<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Approccio alla Misura Regione-specifica proteina Tratta plasma membrana in neuroni adulti

Regulated endocytic trafficking is the central mechanism facilitating a variety of neuromodulatory events, by dynamically controlling receptor, ion ...

Inducing Plasticity of Astrocytic Receptors by Manipulation of Neuronal Firing Rates

Indurre Plasticità di astrociti recettori per manipolazione del neuronali di cottura Prezzi

Close to two decades of research has established that astrocytes in situ and in vivo express numerous G protein-coupled receptors (GPCRs) that can be ...

In Utero Electroporation Approaches to Study the Excitability of Neuronal Subpopulations and Single-cell Connectivity

In Utero Electroporation Approaches to Study the Excitability of Neuronal Subpopulations and Single-cell Connectivity

Elettroporazione in utero approcci per studiare l&#39;eccitabilità neuronale sottopopolazioni e connettività single-cell

The nervous system is composed of an enormous range of distinct neuronal types. These neuronal subpopulations are characterized by, among other features, ...