Name: in vitro wedge slice preparation for mimicking in vivo neuronal circuit connectivity
Uploaded: 2020-08-18T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about In Vitro Wedge Slice Preparation for Mimicking In Vivo Neuronal Circuit Connectivity at JoVE.com

この研究は、NIHの壁内研究プログラム、NIDCD、Z01 DC00091(CJCW)によって支援されました。

すべての実験手順は、国立神経疾患研究所と脳卒中/国立難聴およびその他のコミュニケーション障害研究所動物のケアと使用委員会によって承認されました。
1. 実験準備
注:スライス液、スライス温度、スライスインキュベーション温度、装置(など)を含むスライス調製物に関する詳細は、本実験で行う脳幹製剤に特有のものです。スライスインキュ?...

ここで説明するスライス手順は、ウェッジスライスと呼ばれ、無傷のシナプス前神経回路を維持するために強力であるが、神経機能の分析のための脳スライス実験のアクセシビリティを有する。回路解析の準備の有用性を最大限に高めるためには、いくつかの初期ステップで細心の注意を払う必要があります。ウェッジの寸法は、シナプス前核とその軸索突起の両方が準備されたウェッジス?...

神経回路の活動の観察は、理想的には、生体内の脳領域間のネイティブ感覚入力とフィードバック、および無傷の接続性で行われます。しかし、神経回路の単一細胞分解能を与える実験を行うことは、無傷の脳における技術的な課題によって依然として制限されている。生体内の細胞外電気生理学または多光子イメージング法は、インタクト神経系の活動を調査するために使用できますが、異なる入力がどのように統合されるかの解釈や閾値以下のシナプス入力の測定は困難なままです。インビボ全細胞記録はこれらの制限を克服するが、容易にアクセスされる脳領域でさえ、実行することは困難である。単一細胞分解能実験の技術的課題は、脳の深部に位置する特定のニューロン集団、または生体内の細胞を見つけるために遺伝的ツールを必要とする空間的に拡散集団(例えば、オプトロード記録と組み合わせたチャネロドプシンの遺伝的発現)または標識を記録した後のポストホックの細胞化学的同定(例えば神経伝達特異的マーカーを有する)でさらに増幅される。脳幹の腹側表面の近くに拡散して位置している内側オリボコクリア(MOC)ニューロンは、上記の制限1に苦しんで、生体内実験のためにアクセスすることは非常に困難です。
脳のスライス(約100〜500μmの厚さ)は、同じスライス2、3、4、5、6、7、8、9に含まれる接続ニューロンの物理的な分離のために、聴覚脳幹回路を含む脳回路を研究するために長い間使用されてきました。より厚いスライス(>1 mm)を用いた実験は、内側優れたオリーブ10,11を含む優れたオリバリ複合体(SOC)の領域における二国間入力の統合方法を理解するために他の研究室で採用されている。これらのスライスは、聴覚神経(AN)の軸索がスライス内にそのまま残り、CNでシナプス神経伝達物質の放出を開始するために電気的に刺激されるように調製され、音に反応する第一次聴覚ニューロンの活性を模倣した。これらの厚いスライスの1つの大きな欠点は、パッチクランプ電気生理学的記録(「パッチング」)のためのニューロンの可視性です。この領域の多数の軸索が12歳、13歳、14歳、15歳でミリン化され、典型的で薄い脳スライスでも組織が光学的に密で隠れたニューロンを作り出すにつれて、パッチ適用はますます困難になります。私たちの目標は、インビボ録音の回路接続性に似ていますが、脳スライスの視覚的にガイドされたパッチクランプ電気生理学の高スループットと高解像度の記録能力を備えたインビトロ製剤を作成することです。
私たちの研究室では、MOCニューロンを含む聴覚系のニューロンの生理学を調査しています。これらのコリン作動性ニューロンは、外毛細胞(OHCs)16、17、18、19、20の活性を調節することによって、内毛にフィードバックを提供する。以前の研究では、この変調は、21、22、23、24、25、26および音響外傷から27、28、29、30、31、32、33からの保護における利得制御の役割を果たしていることを示している。マウスにおいて、MOCニューロンは、聴覚脳幹1の台形体(VNTB)の腹側核に拡散的に位置する。我々のグループは、TdTomatoレポーターマウスラインと交差するChAT-IRES-Creマウスラインを利用して、エピ蛍光照明下の脳幹スライス中のMOCニューロンを標的にしました。MOCニューロンは、立ち上がる台形体のイプシラテラ内側核(MNTB)から、逆側内頭核(CN)34、35、36、37、38の球状ふさふさ細胞(GBC)からの軸索によって、アッフェレント阻害性入力を受け取っていることを示した。さらに、MOCニューロンは、反側CN39、40、41のT-ステラート細胞から興奮性入力を受け取る可能性が高い。これらの研究は、MOCニューロンが同じ(対側)耳に由来する興奮性および阻害性入力の両方を受け取る。しかし、シナプス前ニューロンとMOCニューロンに収束する軸索は、典型的なコロナスライス調製物で完全に無傷であるほど互いに近くはない。MOCニューロンへのシナプス入力の統合が、新たに説明された阻害に焦点を当てて、その作用電位の発火パターンにどのような影響を与えるかを調べるため、可能な限り生理学的に現実的な方法で、インビトロ脳スライス実験の技術的利点を持つ、片耳からMOCニューロンに多様な異なるアファレントを刺激できる製剤を開発しました。
ウェッジスライスは、MOCニューロンの回路統合の調査のために設計された修正された厚いスライス調製物です(図1Aでスキーマ化)。スライスの厚い側には、末端の神経とシナプスから脳幹に入ると、内神経(以下「聴神経根」と呼ばれる)の切断された軸索が含まれています。聴覚神経根は、神経伝達物質放出を誘発し、完全に無傷のCN42、43、44、45、46の細胞のシナプス活性化を誘発するように電気的に刺激することができる。この刺激形式には、回路解析にはいくつかの利点があります。まず、MOCニューロンに対して発泡性の入力を提供するT-stellateおよびGBC軸索を直接刺激するのではなく、ANを刺激して、CNに豊富な固有回路の活性化を可能にします。これらの回路は、MOCニューロン46、47、48、49、50、51を含む脳全体の目標にCNニューロンの出力を調節する。第二に、ANからMOCニューロンのCN上流を通るアッフェラプス回路の多シナプス活性化は、聴覚刺激中に生体内で起こるように、より自然な活性化タイミングと可塑性がこれらのシナプスで起こることを可能にする。第三に、AN活動を模倣するために刺激パターンを変えることができます。最後に、MOCニューロンに対する興奮性および阻害的なモノラル投影は、ウェッジスライス内でそのままであり、その統合はパッチクランプ電気生理学の精度を有するMOCニューロンで測定することができる。全体として、この活性化スキームは、典型的な脳スライス調製物と比較してMOCニューロンに、より無傷の回路を提供する。この脳幹のくさびのスライスはまた、横方優れたオリーブ、優れたオリバリー核および内側優れたオリーブ10、11、52、53、54、55、56を含むイプシララルMNTBから阻害的な入力を受ける他の聴覚領域を調査するために使用することができる。当社の具体的な準備を超えて、このスライス法は、長距離入力の接続性を維持し、さまざまな単一細胞分解能電気生理学またはイメージング技術のためのニューロンの視覚化を改善するという利点を持つ他のシステムを評価するために使用または変更することができます。
このプロトコルは、約15°傾けることができるビブラートの段階またはプラットフォームの使用を必要とします。ここでは、市販の2ピース磁気ステージを使用し、「ステージ」は凹型磁気「ステージベース」に配置された湾曲した底を持つ金属ディスクです。ステージをシフトしてスライス角度を調整できます。ステージベースの同心円は、再現的に角度を推定するために使用されます。ステージとステージベースは、磁気ステージベースも回転させることができるスライスチャンバーに配置されます。

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Experimental Preparations</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar, powder</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP1423500</td>
			<td>4% agar block used to stabilize brain tissue during vibratome sectioning</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AlexaFluor Hydrazide 488</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A10436</td>
			<td>Fluorophore used in internal solution to confirm successful MOC neuron patch</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Analytical Balance</td>
			<td>Geneses Scientific (Intramalls)</td>
			<td>AV114</td>
			<td>Weighing chemicals</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Double edged razor blade</td>
			<td>Ted Pella</td>
			<td>121-6</td>
			<td>Vibratome cutting blade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kynurenic acid (5g)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>K3375-5G</td>
			<td>Slicing ACSF additive used to reduce neuron activity during dissection and slicing in order to improve tissue health for patch clamping</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH Meter</td>
			<td>Fisher Scientific (Intramalls)</td>
			<td>13-620-451</td>
			<td>Solution pH tester</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic petri dishes 100mm dia X 20mm</td>
			<td>Fisher Scientific (Intramalls)</td>
			<td>12-556-002</td>
			<td>4% Agar Prep</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stirring Hotplate</td>
			<td>Fisher Scientific (Intramalls)</td>
			<td>11-500-150</td>
			<td>Heating for 4% Agar preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissection and Slicing</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biocytin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>B4261-250MG</td>
			<td>Chemical used for axonal tracing (conjugated to Streptavidin 488)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting Microscope</td>
			<td>Amscope</td>
			<td>SM-1BN</td>
			<td>For precision dissection during brain removal</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #5 Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11252-20</td>
			<td>Fine forceps dissection tool</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Economy tweezers #3</td>
			<td>WPI</td>
			<td>501976</td>
			<td>Forceps dissection tool</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Petri Dish 150mm dia x 15mm H</td>
			<td>Fisher Scientific (Intramalls)</td>
			<td>08-747E</td>
			<td>Dissection dish</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Interface paper (203 X 254mm PCTE Membrane 10um)</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td>1220823</td>
			<td>Slice incubation/biocytin application</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica VT1200S Vibratome</td>
			<td>Leica</td>
			<td>1491200S001</td>
			<td>Vibratome for wedge slice sectioning</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mayo scissors</td>
			<td>Roboz</td>
			<td>RS-6872</td>
			<td>Dissection tool</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Single-edged carbon steel blades</td>
			<td>Fisher Scientific (Intramalls)</td>
			<td>12-640</td>
			<td>Razor blade for dissection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Specimen disc, orienting</td>
			<td>Leica</td>
			<td>14048142068</td>
			<td>Specialized vibratome stage for reproducible tilting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spoonula</td>
			<td>FisherSci</td>
			<td>14-375-10</td>
			<td>Dissection tool</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Super Glue</td>
			<td>Newegg</td>
			<td>15187</td>
			<td>Used for glueing tissue to vibratome stage</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vannas Spring Scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>91500-09</td>
			<td>Dissection tool</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electrophysiology</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>A1R Upright Confocal Microscope</td>
			<td>Nikon Instruments</td>
			<td></td>
			<td>Electrophysiology and imaging microscope, can be any microscope compatible with electrophysiology</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electrode Borosilicate glass w/ Filament OD 1.5mm, ID 1.1mm, 10 cm long</td>
			<td>Sutter Instrument</td>
			<td>BF150-110-10</td>
			<td>Patch clamping pipette glass</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electrode Filler MicroFil</td>
			<td>WPI</td>
			<td>CMF20G</td>
			<td>Patch electrode pipette filler</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>In-line solution heater</td>
			<td>Warner Instruments (GSAdvantage)</td>
			<td>SH-27B</td>
			<td>Slice perfusion system heater</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multi-Micromanipulator Systems</td>
			<td>Sutter Intruments</td>
			<td>MPC-200 with MP285</td>
			<td>Micromanipulators for patch clamp and stimulation electrode placement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P-1000 horizontal pipette puller for glass micropipettes</td>
			<td>Sutter instruments</td>
			<td>FG-P1000</td>
			<td>Patch clamp pipetter puller</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Patch-clamp amplifier and Software</td>
			<td>HEKA</td>
			<td>EPC-10 / Patchmaster Next</td>
			<td>Can be any amplifier/software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recording Chamber</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>RC26G</td>
			<td>Slice &#34;bath&#34; during recording</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recording Chamber Harp</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>640253</td>
			<td>Stablizes slice during electrophysiology recording</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slice Incubation Chamber</td>
			<td>Custom Build</td>
			<td></td>
			<td>Heated, oxygenated holding chamber for slices during recovery after slicing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stimulus isolation unit</td>
			<td>A.M.P.I.</td>
			<td>Iso-Flex</td>
			<td>Stimulus isolation unit for electrophysiology</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe 60CC</td>
			<td>Fischer Scientific (Intramalls)</td>
			<td>14-820-11</td>
			<td>Electrophysiology perfusion fluid handling</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Temperature controller</td>
			<td>Warner Instruments (GSAdvantage)</td>
			<td>TC-324C</td>
			<td>Slice perfusion system temperature controller</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tubing 1/8 OD 1/16 ID</td>
			<td>Fischer Scientific (Intramalls)</td>
			<td>14-171-129</td>
			<td>Electrophysiology perfusion fluid handling</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tugsten concentric bipolar microelectrode</td>
			<td>WPI</td>
			<td>TM33CCINS</td>
			<td>Stimulating electrode for electrophysiology</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Histology</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24 well Plate</td>
			<td>Fisher Scientific (Intramalls)</td>
			<td>12-556006</td>
			<td>Histology slice collection and immunostaining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 Streptavidin</td>
			<td>Jackson Immuno labs</td>
			<td>016-540-084</td>
			<td>Secondary antibody for biocytin visualization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning Orbital Shaker</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>CLS6780FP</td>
			<td>Shaker for immunohistochemistry agitation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cresyl Violet Acetate</td>
			<td>Sigma Aldrich (Intramalls)</td>
			<td>C5042-10G</td>
			<td>Cellular stain for histology</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable Microtome Blades</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>22-210-052</td>
			<td>Sliding microtome blade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter-syringe Nalgene 4mm Cellulose Acetate 0.2um</td>
			<td>Fisher Scientific (Intramalls)</td>
			<td>09-740-34A</td>
			<td>Syringe filter for filling recording pipettes with internal solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluoromount-G Slide Mounting Medium</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>OB100-01</td>
			<td>Immunohistochemistry fluorescence mounting medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glass slide staining dish with rack</td>
			<td>Fisher Scientific (Intramalls)</td>
			<td>08-812</td>
			<td>Cresyl Violet staining chamber</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microm HM450 Sliding Microtome</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>910020</td>
			<td>Freezing microtome for histology</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Cover Glasses: Rectangles 50mm X 24mm</td>
			<td>Fisher Scientific (Intramalls)</td>
			<td>12-543D</td>
			<td>Histochemistry slide cover glass</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Permount mounting medium</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>SP15-100</td>
			<td>Cresyl violet section mounting medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superfrost Slides</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>22-034980</td>
			<td>Histology slides</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vitro wedge slice preparation for mimicking in vivo neuronal circuit connectivity

インビトロスライスの電気生理学の技術は精密な電気および時間的決断の単細胞活動を測定する。脳スライスは、パッチクランプやイメージングのためにニューロンを適切に視覚化してアクセスするために比較的薄くする必要があり、脳回路のインビトロ検査は急性スライスに物理的に存在するものだけに限定されます。シナプス前核の大部分を維持しながらインビトロスライス実験の利点を維持するために、我々は新しいスライス調製物を開発した。この「ウェッジスライス」は、脳幹の内側オリボコクレア(MOC)ニューロンへの多様なモノラル、音駆動入力を特徴付けるために、パッチクランプ電気生理学の録音用に設計されました。これらのニューロンは、対側耳および対応する人工内核(CN)における刺激によって活性化されたニューロンから、その主要な刺激性および抑制性入力を受ける。非対称の脳スライスは、1つの半球の横端にあるロストロ・カウダル領域で最も厚く、反対側の半球の横端に向かって薄く設計されました。このスライスには、厚い側に、聴覚神経根が脳に聴覚刺激に関する情報を伝え、本質的なCN回路、および逆MOCニューロンに収束する不活性化および三シナプス阻害性の両方の経路が含まれている。記録は、スライスの薄い側のMOCニューロンから行われ、一般的なパッチクランプ実験のためにDIC光学を使用して視覚化されます。聴神経の直接刺激は、聴神経の脳幹に入る時に行われ、MOCニューロンのシナプス上流で本質的なCN回路活性およびシナプス可塑性が起こることを可能にする。この技術により、in vivo回路の活性化をスライス内で可能な限り近づけることができます。このウェッジスライス調製物は、インビトロスライス生理学の技術的利点と組み合わせて、回路分析が上流接続性と長距離入力の保存の恩恵を受ける他の脳回路に適用可能です。

ウェッジスライスの組織学的検査 聴覚脳幹ニューロン機能の調査のために、ウェッジスライス製剤は、記録対象のMOCニューロンに対する聴覚神経根およびCN反局面を含むように設計された(図1Bに示すスライスの例)。最初の組織学的検査は、スライスが回路活性化に必要な核を含み、軸索突起がそのままであることを確認するために重要である。CN内の2つ?...

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In Vitro Wedge Slice Preparation for Mimicking In Vivo Neuronal Circuit Connectivity

ニューロンへの多様なシナプス入力の統合は、自然なタイミングと回路の可塑性のためにすべてのシナプス前核を保存する準備で最もよく測定されますが、脳スライスは通常、多くの接続を切断します。インビボ回路活性を模倣しながら、インビトロ実験能力を維持する修飾脳スライスを開発しました。

生体内ニューロン回路接続を模倣するためのインビトロウェッジスライスの準備

In vitro slice electrophysiology techniques measure single-cell activity with precise electrical and temporal resolution. Brain slices must be relatively ...

脳スライス実験は、高い電気的および時間的分解能を有する神経機能の尋問を可能にするが、これらのスライスは通常、多くのシナプス前接続を切断する。くさび状のスライスは、より無傷のシナプス前回路を維持します。この修飾された脳のスライスは、視覚誘導パッチクランプ記録、薬理学、および活動イメージングなどのインビトロ実験の利点を提供しながら、より完全な生体様神経回路を維持します。正確なウェッジスライス幾何学は、回路内のニューロンのアトラス位置に基づいて推定することができるが、シナプス前のスキーマと軸索の完全性は、構造学を使用して決定されるべきである。まず、カミソリの刃を使用して、頭蓋骨の正中線の皮膚を鼻から首の後ろに切り取ります。頭蓋骨を露出させるために皮膚を剥がし、頭蓋骨の基部から始まり、鼻に向かって続き、小さなはさみを使用して中線を通して頭蓋骨の切開を行います。ラムダ縫合糸では、正中線から両側の耳に向かって左右に頭蓋骨を切り取り、頭蓋骨を剥がして脳を露出させます。鼻孔の端から始めて、小さなラボのヘラを使用して頭蓋骨から脳を静かに持ち上げ、視神経を切断できるようにします。脳を穏やかに後方に働き続け、腹側表面を露出させ、細かい鉗子を使用して脳幹の腹側表面付近の三叉神経を慎重につまんで切断する。冷たいスライス溶液で満たされたガラスペトリ皿に準備を入れ、解剖顕微鏡の下に皿を置きます。脳幹に近い顔面神経をトリミングして、前庭神経を露出させます。痕跡神経が頭蓋骨を可能な限り出る前庭に先端を押し込むために細かい鉗子を使用してください。脳幹に取り付けられた神経根を残して、両側の神経を切断するためにピンチ。台形体近くの脳幹の腹側表面から髄膜と血管系を取り除きます。その後、残りの脳神経と結合組織をつまんで頭蓋骨から脳を完全に解放し、可能であれば残りの脊髄を維持するように注意します。ステージにフィクスチャのための脳の表面を準備するには、脳腹側を上に置き、脳組織を安定させるために脊髄を穏やかに固定化するための鈍いツールを使用します。脳を通して約20度の角度で開いた鉗子を皿の底に挿入し、先端が脳の背側表面を視チアズムに出て、カミソリの刃を使って鉗子に沿って切断するようにします。次に、4%寒天の1立方センチメートルブロックを準備し、ステージ上の長方形に接着剤の小さな滴を広げます。鉗子を使用して慎重に脳を持ち上げ、余分な液体をペーパータオルの端でそっと手を出します。次に、ブロックされた表面を接着剤の上に置き、腹側の表面がスライス中にブレードの方向に向くようにし、寒天ブロックを支持体として後側の表面にそっと押し付けます。厚い側の内腔神経根と内側のオリボコクレアニューロンと台形体の内側核を薄い側に置いてくさびのスライスを取得するには、取り付けられた脳を持つ磁気ディスクをステージホルダーに置き、脳の腹側をブレードに向けた振動体のスライシングチャンバーにホルダーを置きます。チャンバーに氷冷スライス液を充填し、ブレードをカルボゲンバブル溶液に下げます。スライスが対称になるように、目的の領域に切り取ります。その後、ステージを15度程度片側に移動します。聴覚神経根が片側の表面に近づくまで慎重にスライスを続け、スライスの反対側の表面に顔面神経が見える。ステージを元の位置に15度戻し、ブレードを組織から遠ざけます。ステージベースを90度回転させて、薄い側の側面の端がブレードに向き、ブレードを数百ミクロン下げてから、ゆっくりとブレードを組織の端に近づけます。ブレードを引き込んだ後、ブレードをスライスの薄いエッジの所望の厚さに下げます。ブレードを組織から戻し、腹側表面がステージベースに向かるようにステージベースを後ろに回転させます。カットしてウェッジスライスのロストラル表面を指定し、スライスを1平方センチメートルのインターフェースペーパーの表面に移します。顔面神経は、rostral表面上のスライスの両方の半球に表示される必要があります。その後、スライスを35°Cのインキュベーションチャンバーに移動して30分間回復します。エレクトロ生理解析用にウェッジスライスを設定するには、サンプルを35°CのACSFで連続的に浸透している記録チャンバーに入れ、スライスを安定化させます。DIC視を使用して、スライスの厚い側の聴覚神経根に焦点を当て、マイクロマニピュレータを使用して双極タングステン刺激電極を聴覚神経根に移動させ、組織の表面にそっと移動させます。薄辺の台形体の腹側核に視野を移動し、561ナノメートルの発光フィルターを使用して、発蛍光下のパッチクランプ電気生理学の標的として内側オリボコクレアニューロンを選択します。提案された実験に適した内部溶液を記録ピペットに充填し、DIC光学パッチの下で、全細胞構成の内側オリボコクリアニューロンから記録します。聴覚神経根の電気刺激振幅を調整して、内側オリボコクリアニューロンで一貫したポストナプティクス事象を得る。次に、適切な刺激プロトコルを実行して、内側オリボコクレアニューロンにおける呼び起こされるシナプス電流を観察する。このウェッジスライス調製物は、録音対象の内側オリボコクレアニューロンに対する聴覚神経根および人工内核を含有するように設計されている。このクレシルバイオレット染色切除ウェッジスライスでは、人工内核はほぼ完全なロストラル・コーダルの範囲に存在する。そして、聴神経根は人工内核に入って観察される。さらに、ウェッジスライスは、記録が行われる内側オリボコクレアニューロンに対する台形体の内側核のニューロンを含む。ウェッジスライスシナプス前入力内の神経結合性を確認するには、2つの方法で刺激される。まず、正中線の腹側音響線素は電気的に刺激され、球状ふさふさした細胞軸索刺激を介してT-星状軸索および台形体ニューロンの内側核を直接活性化し、内側オリボコクレアニューロンで測定される心筋波流をもたらす。聴覚神経根は、その後、モノラル上昇脳幹回路全体を活性化し、心筋応答を呼び起こすために刺激される。腹側神経刺激で誘発される腹腔音響線素の直接刺激で誘発された最初の心内聴き電流の発症遅延測定と聴覚神経刺激で誘発される遅延の比較は、聴覚神経刺激事象における有意に長い遅延を明らかにし、聴覚神経刺激の間に活性化された追加の人工内核シナプスに起因するシナプス遅延を示す。解剖学的ランドマークの使用と磁気ディスクステージの慎重な操縦は、無傷の神経回路と信頼性の高い呼び起こされるポストシナプス応答を持つウェッジスライスを作成するために重要です。このスライス技術は、カルシウムや電圧イメージング、光遺伝学、神経伝達物質の老化、細胞内および細胞外薬理学の両方を含む、追加のインビトロでの電気生理学ツールを使用するためのプラットフォームを提供します。

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