Name: in vitro wedge slice preparation for mimicking in vivo neuronal circuit connectivity
Uploaded: 2020-08-18T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about In Vitro Wedge Slice Preparation for Mimicking In Vivo Neuronal Circuit Connectivity at JoVE.com

이 연구는 NIH, NIDCD, Z01 DC000091 (CJCW)의 교내 연구 프로그램에 의해 지원되었습니다.

모든 실험 절차는 청각 장애 및 기타 통신 장애 동물 관리 및 사용위원회에 신경 장애 및 뇌졸중 / 국립 연구소의 국립 연구소에 의해 승인되었다.
1. 실험 적 준비
참고: 슬라이스 용액, 슬라이스 온도, 슬라이스 인큐베이션 온도 및 장치(등)를 포함한 슬라이스 제제에 대한 세부 사항은 이 실험에서 수행된 뇌간 제제에 특이적이다. 슬라이스 인큐베이션 세?...

여기에 설명된 슬라이스 절차는 웨지 슬라이스라고 불리는 것은 그대로 사전 시냅스 뉴런 회로를 유지하기위한 강력한, 하지만 신경 기능의 분석을위한 뇌 슬라이스 실험의 접근성. 회로 분석 준비의 유용성을 극대화하기 위해 몇 가지 초기 단계에서 세심한 주의를 기울여야 합니다. 웨지의 치수는 조직학적 검사를 사용하여 확인되어야 하며, 이는 사전 시냅스 핵과 축삭 투영이 준비된 쐐기 슬?...

신경 회로의 활동의 관찰은 이상적으로 네이티브 감각 입력 및 피드백, 그리고 뇌 영역 사이의 그대로 연결, 생체 내에서 수행된다. 그러나 신경 회로 기능의 단일 세포 해상도를 제공하는 실험을 수행하는 것은 여전히 뇌의 기술적 과제에 의해 제한됩니다. 생체 외 세포 외 전기 생리학 또는 다광화상 방법은 그대로 신경계에서 활동을 조사하는 데 사용될 수 있지만, 다른 입력이 어떻게 통합되는지 해석하거나 하위 임계 값 시냅스 입력을 측정하는 것은 여전히 어렵습니다. 생체 내 전세포 기록은 이러한 한계를 극복하지만 쉽게 접근 할 수있는 뇌 영역에서도 수행하기가 어렵습니다. 단일 세포 분해 실험의 기술적 과제는 뇌 깊숙이 위치한 특정 뉴런 집단또는 생체 내에서 세포를 찾기 위해 유전 적 도구가 필요한 공간적으로 확산되는 집단(예: 옵트로드 레코딩과 결합된 채널로돕신의 유전적 발현) 또는 기록 사이트 라벨링 후 의학적 식별(예: 신경 전달 마커)에서 더욱 증폭됩니다. 뇌간의 복부 표면 근처에 확산되는 내측 올리고엽아(MOC) 뉴런은 위의 한계1로인해 생체 내 실험에 액세스하기가 매우 어렵다.
뇌 슬라이스(~100-500 μm 두께)는 동일한 슬라이스2,3,4,5,6,7,8,9내에 포함된 연결된 뉴런의 물리적 분리로 인해 청각 뇌간 회로를 포함한 뇌 회로를 연구하는 데 오랫동안 사용되어 왔다. 훨씬 두꺼운 슬라이스(>1mm)를 이용한 실험은 내측 우수한 올리브10,11을포함한 우수한 올리보리 복합체(SOC)의 영역에서 양자 입력이 어떻게 통합되는지 이해하기 위해 다른 실험실에서 사용되고 있다. 이러한 슬라이스는 청각 신경(AN)의 축삭이 슬라이스 내에서 그대로 유지되고 CN에서 시냅스 신경 전달 물질 방출을 시작하기 위해 전기적으로 자극되어 소리에 반응할 것처럼 1차 청각 뉴런의 활성을 모방하도록 제조하였다. 이러한 두꺼운 조각의 한 가지 주요 단점은 패치 클램프 전기 생리적 기록 ("패치")에 대한 뉴런의 가시성입니다. 이 지역의 수많은 축축이12세,13세,14세,15세로발근해지면서 전형적이고 얇은 뇌 슬라이스에서도 조직이 광학적으로 조밀해지고 모호한 뉴런을 만들기 때문에 패치가 점점 더 어려워집니다. 우리의 목표는 생체 내 레코딩의 회로 연결성과 더 밀접하게 유사한 체외 제제를 만드는 것이지만, 뇌 슬라이스에서 시각적으로 유도된 패치 클램프 전기생리학의 고처리량 및 고해상도 레코딩 능력을 가지고 있습니다.
우리의 실험실은 MOC 신경세포를 포함하여 청각 efferent 시스템의 뉴런의 생리학을 조사합니다. 이러한 콜린성 뉴런은 외부 모발 세포(OHCs)16,17,18,19,20의활성을 조절함으로써 달팽이관에 대한 효과적인 피드백을 제공한다. 이전 연구는 이 변조가 달팽이관21,22,23, 24,25,26 및 음향 외상으로부터 의보호27,28,29,30,31,32,33에서이득 제어에 중요한 역할을 한다는것을보여주었다. 마우스에서, MOC 뉴런은 청각 뇌간1에서사다리꼴 본체(VNTB)의 복부 핵에 확산적으로 위치한다. 우리 그룹은 tdTomato 리포터 마우스 라인과 교차하는 ChAT-IRES-Cre 마우스 라인을 활용하여 상피 조명 아래 뇌간 슬라이스에서 MOC 뉴런을 표적으로 삼았습니다. 우리는 MOC 뉴런이 트라페조이드 체의 ipsilateral 내측 핵으로부터 발포성 억제 입력을 수신한다는 것을 보여주었습니다 (MNTB), 이는 차례로, 반대로 달팽이관 핵 (CN)34,35,36,37, 38에서구형 부시 세포 (GBC)에서 축삭에 의해 흥분된다. 추가적으로, MOC 뉴런은 아마도 반대로 CN39,40,41에서T-stellate 세포로부터 그들의 흥분입력을수신합니다. 종합, 이러한 연구는 MOC 뉴런이 동일한 (contralateral) 귀에서 파생된 흥분성 및 억제 입력을 모두 수신하는 것으로 나타났습니다. 그러나, 전시냅스 뉴런, 그리고 MOC 뉴런에 수렴하는 그들의 축축은, 일반적인 관상 슬라이스 준비에서 완전히 손상될 만큼 서로 충분히 가깝지 않습니다. MOC 뉴런에 시냅스 입력의 통합이 그들의 작용 잠재적인 발사 패턴에 어떻게 영향을 미치는지 조사하기 위하여, 새로 설명한 억제에 초점으로, 우리는 우리가 가능한 가장 생리적으로 현실적인 방법으로 한 귀에서 MOC 뉴런에 다양한 흡수를 자극할 수 있는 준비를 개발했습니다, 그러나 체외 뇌 슬라이스 실험의 기술적 이점.
웨지 슬라이스는 MOC 뉴런의 회로 통합을 조사하도록 설계된 수정된 두꺼운 슬라이스 제제입니다(도 1A에서스키마화). 슬라이스의 두꺼운 측면에, 웨지는 청각 신경의 절단 된 축삭을 포함 (이하 "청각 신경 뿌리"라고) 그들은 CN에서 주변과 시냅스에서 뇌간을 입력으로. 청각 신경 근은 완전히손상된 CN42,43,44,45, 46의세포의 신경 전달물질 방출 및 시냅스 활성화를 연상시키는 전기적으로 자극될 수 있다. 이 자극 형식은 회로 분석에 몇 가지 이점이 있습니다. 첫째, MOC 뉴런에 대한 포심 입력을 제공하는 T-stellate 및 GBC 축축을 직접 자극하는 대신 CN에 풍부한 본질회로의 활성화를 허용하도록 AN을 자극합니다. 이러한 회로는 MOC 뉴런46,47,48,49,50,51을포함하여 뇌 전체의 표적에 CN 뉴런의출력을조절한다. 둘째, MOC 뉴런의 CN 업스트림을 통해 AN으로부터 포퍼런트 회로의 다형성 활성화를 통해 청각 자극 중에 생체 내에서와 마찬가지로 이러한 시냅스에서 보다 자연스러운 활성화 타이밍과 가소성이 발생할 수 있습니다. 셋째, 자극 패턴을 다양하게 하여 AN 활동을 모방할 수 있습니다. 마지막으로, MOC 뉴런에 대한 흥분성 및 억제 모년 투영은 쐐기 조각에 그대로 있으며, 이들의 통합은 패치 클램프 전기생리학의 정밀도로 MOC 뉴런에서 측정될 수 있다. 전체적으로, 이 활성화 계획은 일반적인 두뇌 슬라이스 준비에 비해 MOC 뉴런에 더 온전한 회로를 제공합니다. 이러한 뇌간 쐐기 슬라이스는 측면 우수한 올리브, 우수한 올리보리 핵 및 내측 우수한 올리브10,11,52,53,54,55,56을포함하는 ipsilateral MNTB로부터 억제 입력을 받는 다른 청각영역을조사하는 데 에도 사용될 수있다. 우리의 특정 준비를 넘어, 이 슬라이스 방법은 장거리 입력의 연결을 유지하고 다양한 단세포 해상도 전기 생리학 또는 이미징 기술에 대한 뉴런의 시각화를 개선하는 이점을 가진 다른 시스템을 평가하기 위해 사용하거나 수정할 수 있습니다.
이 프로토콜은 진동 단계 또는 플랫폼을 사용하여 약 15°기울어질 수 있어야 합니다. 여기서 우리는 "스테이지"가 오목한 자기 "스테이지 베이스"에 구부러진 바닥이있는 금속 디스크인 상업적으로 사용 가능한 2 피스 자기 단계를 사용합니다. 그런 다음 스테이지를 이동하여 슬라이스 각도를 조정할 수 있습니다. 스테이지 베이스의 동심 원은 각도를 재현적으로 추정하는 데 사용됩니다. 스테이지 및 스테이지 베이스는 자력 스테이지 베이스를 회전할 수 있는 슬라이싱 챔버에 배치됩니다.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Experimental Preparations</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar, powder</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP1423500</td>
			<td>4% agar block used to stabilize brain tissue during vibratome sectioning</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AlexaFluor Hydrazide 488</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A10436</td>
			<td>Fluorophore used in internal solution to confirm successful MOC neuron patch</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Analytical Balance</td>
			<td>Geneses Scientific (Intramalls)</td>
			<td>AV114</td>
			<td>Weighing chemicals</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Double edged razor blade</td>
			<td>Ted Pella</td>
			<td>121-6</td>
			<td>Vibratome cutting blade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kynurenic acid (5g)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>K3375-5G</td>
			<td>Slicing ACSF additive used to reduce neuron activity during dissection and slicing in order to improve tissue health for patch clamping</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH Meter</td>
			<td>Fisher Scientific (Intramalls)</td>
			<td>13-620-451</td>
			<td>Solution pH tester</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic petri dishes 100mm dia X 20mm</td>
			<td>Fisher Scientific (Intramalls)</td>
			<td>12-556-002</td>
			<td>4% Agar Prep</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stirring Hotplate</td>
			<td>Fisher Scientific (Intramalls)</td>
			<td>11-500-150</td>
			<td>Heating for 4% Agar preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissection and Slicing</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biocytin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>B4261-250MG</td>
			<td>Chemical used for axonal tracing (conjugated to Streptavidin 488)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting Microscope</td>
			<td>Amscope</td>
			<td>SM-1BN</td>
			<td>For precision dissection during brain removal</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #5 Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11252-20</td>
			<td>Fine forceps dissection tool</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Economy tweezers #3</td>
			<td>WPI</td>
			<td>501976</td>
			<td>Forceps dissection tool</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Petri Dish 150mm dia x 15mm H</td>
			<td>Fisher Scientific (Intramalls)</td>
			<td>08-747E</td>
			<td>Dissection dish</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Interface paper (203 X 254mm PCTE Membrane 10um)</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td>1220823</td>
			<td>Slice incubation/biocytin application</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica VT1200S Vibratome</td>
			<td>Leica</td>
			<td>1491200S001</td>
			<td>Vibratome for wedge slice sectioning</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mayo scissors</td>
			<td>Roboz</td>
			<td>RS-6872</td>
			<td>Dissection tool</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Single-edged carbon steel blades</td>
			<td>Fisher Scientific (Intramalls)</td>
			<td>12-640</td>
			<td>Razor blade for dissection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Specimen disc, orienting</td>
			<td>Leica</td>
			<td>14048142068</td>
			<td>Specialized vibratome stage for reproducible tilting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spoonula</td>
			<td>FisherSci</td>
			<td>14-375-10</td>
			<td>Dissection tool</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Super Glue</td>
			<td>Newegg</td>
			<td>15187</td>
			<td>Used for glueing tissue to vibratome stage</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vannas Spring Scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>91500-09</td>
			<td>Dissection tool</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electrophysiology</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>A1R Upright Confocal Microscope</td>
			<td>Nikon Instruments</td>
			<td></td>
			<td>Electrophysiology and imaging microscope, can be any microscope compatible with electrophysiology</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electrode Borosilicate glass w/ Filament OD 1.5mm, ID 1.1mm, 10 cm long</td>
			<td>Sutter Instrument</td>
			<td>BF150-110-10</td>
			<td>Patch clamping pipette glass</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electrode Filler MicroFil</td>
			<td>WPI</td>
			<td>CMF20G</td>
			<td>Patch electrode pipette filler</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>In-line solution heater</td>
			<td>Warner Instruments (GSAdvantage)</td>
			<td>SH-27B</td>
			<td>Slice perfusion system heater</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multi-Micromanipulator Systems</td>
			<td>Sutter Intruments</td>
			<td>MPC-200 with MP285</td>
			<td>Micromanipulators for patch clamp and stimulation electrode placement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P-1000 horizontal pipette puller for glass micropipettes</td>
			<td>Sutter instruments</td>
			<td>FG-P1000</td>
			<td>Patch clamp pipetter puller</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Patch-clamp amplifier and Software</td>
			<td>HEKA</td>
			<td>EPC-10 / Patchmaster Next</td>
			<td>Can be any amplifier/software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recording Chamber</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>RC26G</td>
			<td>Slice &#34;bath&#34; during recording</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recording Chamber Harp</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>640253</td>
			<td>Stablizes slice during electrophysiology recording</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slice Incubation Chamber</td>
			<td>Custom Build</td>
			<td></td>
			<td>Heated, oxygenated holding chamber for slices during recovery after slicing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stimulus isolation unit</td>
			<td>A.M.P.I.</td>
			<td>Iso-Flex</td>
			<td>Stimulus isolation unit for electrophysiology</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe 60CC</td>
			<td>Fischer Scientific (Intramalls)</td>
			<td>14-820-11</td>
			<td>Electrophysiology perfusion fluid handling</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Temperature controller</td>
			<td>Warner Instruments (GSAdvantage)</td>
			<td>TC-324C</td>
			<td>Slice perfusion system temperature controller</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tubing 1/8 OD 1/16 ID</td>
			<td>Fischer Scientific (Intramalls)</td>
			<td>14-171-129</td>
			<td>Electrophysiology perfusion fluid handling</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tugsten concentric bipolar microelectrode</td>
			<td>WPI</td>
			<td>TM33CCINS</td>
			<td>Stimulating electrode for electrophysiology</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Histology</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24 well Plate</td>
			<td>Fisher Scientific (Intramalls)</td>
			<td>12-556006</td>
			<td>Histology slice collection and immunostaining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 Streptavidin</td>
			<td>Jackson Immuno labs</td>
			<td>016-540-084</td>
			<td>Secondary antibody for biocytin visualization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning Orbital Shaker</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>CLS6780FP</td>
			<td>Shaker for immunohistochemistry agitation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cresyl Violet Acetate</td>
			<td>Sigma Aldrich (Intramalls)</td>
			<td>C5042-10G</td>
			<td>Cellular stain for histology</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable Microtome Blades</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>22-210-052</td>
			<td>Sliding microtome blade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter-syringe Nalgene 4mm Cellulose Acetate 0.2um</td>
			<td>Fisher Scientific (Intramalls)</td>
			<td>09-740-34A</td>
			<td>Syringe filter for filling recording pipettes with internal solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluoromount-G Slide Mounting Medium</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>OB100-01</td>
			<td>Immunohistochemistry fluorescence mounting medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glass slide staining dish with rack</td>
			<td>Fisher Scientific (Intramalls)</td>
			<td>08-812</td>
			<td>Cresyl Violet staining chamber</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microm HM450 Sliding Microtome</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>910020</td>
			<td>Freezing microtome for histology</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Cover Glasses: Rectangles 50mm X 24mm</td>
			<td>Fisher Scientific (Intramalls)</td>
			<td>12-543D</td>
			<td>Histochemistry slide cover glass</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Permount mounting medium</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>SP15-100</td>
			<td>Cresyl violet section mounting medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superfrost Slides</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>22-034980</td>
			<td>Histology slides</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vitro wedge slice preparation for mimicking in vivo neuronal circuit connectivity

체외 슬라이스 전기 생리학 기술은 정확한 전기 및 측두성 해상도로 단일 세포 활동을 측정합니다. 뇌 슬라이스는 패치 클램핑 이나 이미징을 위해 뉴런을 적절히 시각화하고 액세스하기 위해 상대적으로 얇아야하며 뇌 회로의 체외 검사는 급성 슬라이스에 물리적으로 존재하는 것으로만 제한됩니다. 시험관 내 슬라이스 실험의 이점을 유지하면서 시냅스 핵의 더 큰 부분을 보존하기 위해, 우리는 새로운 슬라이스 준비를 개발했다. 이 "웨지 슬라이스"는 뇌의 내측 올리고 올리고(MOC) 뉴런에 대한 다양한 모노알, 사운드 구동 입력을 특성화하기 위해 패치 클램프 전기 생리학 기록을 위해 설계되었습니다. 이러한 뉴런은 콘트라탈 귀및 상응하는 달팽이관 핵(CN)에서 자극에 의해 활성화된 뉴런으로부터 그들의 1차 발포성 흥분및 억제 입력을 수신한다. 비대칭 뇌 슬라이스는 한 반구의 측면 가장자리에서 로스트로 -caudal 도메인에서 가장 두꺼운 다음 반대 반구의 측면 가장자리를 향해 얇게 설계되었습니다. 이 슬라이스에는 청각 자극에 대한 정보를 뇌에 전달하는 청각 신경 뿌리, 본질적인 CN 회로, 및 모순된 MOC 뉴런에 수렴하는 소멸 흥분 및 삼중 억제 성 포렌티드 경로가 모두 포함되어 있습니다. 레코딩은 슬라이스의 얇은 면에 있는 MOC 뉴런에서 수행되며, 여기서 일반적인 패치 클램프 실험을 위해 DIC 광학을 사용하여 시각화됩니다. 청각 신경의 직접적인 자극은 청각 뇌간에 들어갈 때 수행되며, 내식 CN 회로 활동과 시냅스 가소성이 MOC 뉴런의 상류시냅스에서 발생할 수 있도록 합니다. 이 기술을 사용하면 조각 내에서 가능한 한 가깝게 생체 내 회로 활성화를 모방할 수 있습니다. 이 쐐기 슬라이스 준비는 회로 분석이 생체 외 슬라이스 생리학의 기술적 이점과 함께 업스트림 연결 및 장거리 입력의 보존의 혜택을 누릴 수있는 다른 뇌 회로에 적용됩니다.

웨지 슬라이스의 조직학적 검사 청각 뇌간 뉴런 기능에 대한 당사의 조사를 위해, 웨지 슬라이스 제제는 기록(도 1B에도시된 예시 슬라이스)을 표적으로 한 MOC 뉴런에 청각 신경 근과 CN 모순을 포함하도록 설계되었다. 초기 조직학적 검사는 슬라이스가 회로 활성화에 필요한 핵을 포함하고 축축투영이 손상되지 않음을 확인하는 것이 중요하다. CN 내의 두 세포...

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In Vitro Wedge Slice Preparation for Mimicking In Vivo Neuronal Circuit Connectivity

뉴런에 다양한 시냅스 입력의 통합은 자연 타이밍과 회로 가소성을 위해 모든 사전 시냅스 핵을 보존하는 준비에서 가장 잘 측정되지만, 뇌 슬라이스는 일반적으로 많은 연결을 끊습니다. 우리는 생체 외 실험 능력을 유지하면서 생체 내 회로 활동을 모방하는 수정 된 뇌 조각을 개발했습니다.

생체 내 신경 회로 연결성 모방을 위한 체외 쐐기 슬라이스 준비

In vitro slice electrophysiology techniques measure single-cell activity with precise electrical and temporal resolution. Brain slices must be relatively ...

뇌 슬라이스 실험은 높은 전기 및 측두해상도와 신경 기능의 심문을 허용하지만,이 조각은 일반적으로 많은 사전 시냅스 연결을 끊습니다. 쐐기 모양의 슬라이스는 보다 그대로 사전 회로를 유지합니다. 이 수정된 두뇌 슬라이스는 시각적으로 유도된 패치 클램프 기록, 약리학 및 활동 화상 진찰과 같은 체외 실험의 이점을 제공하면서 생체 내와 같은 신경 회로에서 더 완전한 유지합니다.정확한 쐐기 슬라이스 형상은 회로 내의 뉴런의 아틀라스 위치를 기반으로 추정될 수 있지만, 사전 시냅스 스키마타와 축삭의 무결성은 조직학을 사용하여 결정되어야 한다. 먼저 면도날을 사용하여 두개골 의 중간선에서 목 뒤쪽으로 피부를 자른다. 두개골을 드러내고 두개골의 기지에서 시작하여 코를 향해 계속 하기 위해 피부를 다시 껍질을 벗기고 작은 가위를 사용하여 중간선을 통해 두개골에 절개를합니다.람다 봉합사에서, 뇌를 드러내기 위해 두개골을 벗겨내고 양쪽의 귀를 향해 중간선에서 두개골을 잘라냅니다. 로스트랄 끝에서 시작하여 작은 실험실 주걱을 사용하여 두개골에서 뇌를 부드럽게 들어 올려 시신경을 절단할 수 있습니다. 뇌를 뒤로 부드럽게 작동시키고, 복부 표면을 노출시키고 미세 한 집게를 사용하여 뇌줄기의 복부 표면 근처의 삼차 신경을 조심스럽게 꼬집어 잘라냅니다.차가운 슬라이스 용액으로 가득 찬 유리 페트리 접시에 준비를 놓고 해부 현미경 아래에 접시를 놓습니다. 브레디불로초클레아 신경을 노출하기 위해 뇌간 가까이에 있는 안면 신경을 다듬습니다. 좋은 집게를 사용하여 현관 신경이 가능한 한 두개골을 빠져 나가는 포라미나로 팁을 밀어 넣습니다.양쪽의 신경을 끊고 뇌간에 부착된 신경 뿌리를 남깁니다. 사다리꼴 몸 근처 뇌간의 복부 표면에서 수막과 혈관을 제거합니다. 그런 다음 남아있는 두개골 신경과 결합 조직을 꼬집어 두개골에서 뇌를 완전히 풀어 주며 가능한 경우 남아있는 척수를 보존하십시오.무대에 고정에 대한 뇌의 표면을 준비하려면 뇌 복부 측면을 위로 배치하고 부드럽게 뇌 조직을 안정화척수를 고정하는 무딘 도구를 사용합니다. 팁이 광학 치아에 뇌 의 등쪽 표면을 종료하고 집게를 따라 절단 면도날을 사용하는 있도록 접시의 바닥에 뇌를 통해 약 20도 각도에 열린 집게를 삽입합니다. 다음으로, 4%의 한입방 센티미터 블록을 준비하고 작은 한 방울의 접착제를 무대의 사각형으로 퍼뜨립니다.집게를 사용하여 조심스럽게 뇌를 들어 올리고 종이 타월 가장자리로 여분의 액체를 부드럽게 두드려보십시오. 그런 다음 차단된 표면을 접착제에 배치하여 복부 표면이 슬라이스 하는 동안 블레이드의 방향을 향하고 서 열 반 에 부드럽게 대 한 천 블록을 밀어 지원으로. 두꺼운 측면에 달팽이 신경 뿌리와 쐐기 조각을 취득하고, 얇은 쪽에 사다리꼴 몸의 내측 올리고 신경 및 내측 핵을 획득하려면, 날개 를 향한 뇌의 진부한 표면으로 진동챔버에 부착 된 뇌가있는 자기 디스크를 배치합니다.얼음 차가운 슬라이스 용액으로 챔버를 채우고 칼날을 카보겐 버블 솔루션으로 낮춥니다. 슬라이스가 대칭인지 확인하기 위해 관심 영역으로 슬라이스 를 잘라냅니다. 그런 다음 스테이지를 약 15도 에서 한쪽으로 이동합니다.청각 신경 뿌리가 한쪽면의 표면에 가까우고 안면 신경이 슬라이스의 반대편 표면에서 볼 수 있을 때까지 조심스럽게 슬라이스를 계속합니다. 스테이지를 15도 뒤로 이동하여 블레이드를 조직에서 멀리 이동합니다. 얇은 면의 측면 가장자리가 블레이드를 향하도록 스테이지 베이스 90도회전하여 블레이드를 수백 미크론을 내리고 천천히 블레이드를 조직의 가장자리에 가깝게 가져온다.블레이드가 약간 하중하여 슬라이스의 얇은 가장자리의 원하는 두께로 후퇴합니다. 블레이드를 조직에서 다시 이동하고 원반 표면이 스테이지 베이스를 향할 수 있도록 스테이지 베이스를 다시 회전시합니다. 쐐기 슬라이스의 장밋빛 표면을 지정하고 슬라이스를 인터페이스 용지 카들 표면의 1 평방 센티미터 조각으로 옮기도록 잘라냅니다.얼굴 신경은 장밋빛 표면에 있는 슬라이스의 두 반구에서 볼 수 있어야 합니다. 그런 다음 슬라이스를 섭씨 35도 인큐베이션 챔버로 이동하여 30분 동안 복구합니다. 전기 생리분석을 위한 쐐기 슬라이스를 설정하려면 샘플을 연속섭씨 35도ACSF로 지속적으로 침투하는 기록챔버로 배치하고 슬라이스를 안정화한다.DIC 광학을 사용하여, 슬라이스의 두꺼운 측면에 청각 신경 뿌리에 초점을 맞추고 양극성 텅스텐 자극 전극을 청각 신경 뿌리로 이동하고 조직의 표면에 부드럽게 이동미세 조작기를 사용합니다. 시야를 얇은 측의 사다리꼴 몸체의 복부 핵으로 이동하고 561 나노미터 방출 필터를 사용하여 피광학 하에서 패치 클램프 전기 생리학의 대상으로 내측 올리고폴리아 뉴런을 선택한다. 제안된 실험에 적합한 내부 솔루션으로 레코딩 파이펫을 채우고 DIC 광학 패치 하에서 전체 셀 구성에서 내측 올리고성 폴리보코클레아 뉴런으로부터 기록한다.청각 신경 근의 전기 자극 진폭을 조정하여 내측 올리고성 신경에서 일관된 포스트냅틱 이벤트를 얻습니다. 그런 다음 내측 올리고성 신경에서 불러일으킨 시냅스 전류를 관찰하기 위해 적절한 자극 프로토콜을 실행합니다. 이 쐐기 슬라이스 제제는 청각 신경 근과 달팽이관 핵을 기록 대상으로 한 내측 올리고성 골수 신경에 대한 모순을 포함하도록 설계되었습니다.이 크레실 바이올렛 염색 된 절제 웨지 슬라이스에서 달팽이관 핵은 거의 전체 로스트랄 - 코달 정도에 존재한다. 그리고 청각 신경 뿌리는 달팽이관 핵을 입력 하는 관찰. 또한, 웨지 슬라이스는 레코딩이 수행되는 내측 올리고올리고 뉴런에 사다리꼴 본체의 내측 핵의 뉴런을 함유하고 있다.웨지 슬라이스 사전 시냅스 입력 내의 뉴런 연결을 확인하기 위해 두 가지 방법으로 자극된다. 첫째, 미드라인의 복부 음향 스트리아는 전기적으로 자극되고, T-stellate 축삭을 직접 활성화하고, 구형 부시 세포 축삭 자극을 통해 사다리꼴 체뉴런의 내측 핵을 활성화시키고, 중간 올리보콜레아 뉴런에서 측정되는 포스트냅스 전류의 결과로. 청각 신경 뿌리는 그 때 전체 모루 오름차순 뇌간 회로를 활성화하고 포스트 냅틱 반응을 연상하도록 자극된다.청각 신경 자극으로 불러일으킨 것과 복부 음향 성수기의 직접적인 자극으로 불러일으킨 첫 번째 포스트냅틱 전류의 개시 대기 시간 측정을 비교하면 청각 신경 자극 이벤트에서 훨씬 더 긴 대기 시간을 나타내며, 이는 청각 신경 자극 시자극 시냅스 자극 중에 활성화된 추가 인공와우 핵으로 인한 시냅스 지연을 나타낸다. 해부학 적 랜드 마크의 사용과 자기 디스크 단계의 신중한 기동은 그대로 뉴런 회로와 신뢰할 수있는 사후 시냅스 응답을 생성하기위한 중요합니다. 이 슬라이싱 기술은 칼슘 또는 전압 이미징, 광유전학, 신경 전달 물질 미수, 세포 내 및 세포 외 약리학을 포함한 추가 체외 전기 생리학 도구를 사용하기위한 플랫폼을 제공합니다.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

The Organotypic Hippocampal Slice Culture Model for Examining Neuronal Injury

의 연결을 부상을 검사에 대한 Organotypic Hippocampal 슬라이스 문화 모델

Organotypic hippocampal slice culture is an in vitro method to examine mechanisms of neuronal injury in which the basic architecture and composition of ...

연구

신경과학

Organotypic Slice Cultures of Embryonic Ventral Midbrain: A System to Study Dopaminergic Neuronal Development in vitro

Organotypic Slice Cultures of Embryonic Ventral Midbrain: A System to Study Dopaminergic Neuronal Development in vitro

배아 복부 Midbrain의 Organotypic 슬라이스 문화 : Dopaminergic의 연결을 개발 연구하는 시스템 체외에서</em

The  mouse is an excellent model organism to study mammalian brain development due  to the abundance of molecular and genetic data. However, the ...

Functional Neuroimaging Using Ultrasonic Blood-brain Barrier Disruption and Manganese-enhanced MRI

초음파 혈액 - 뇌 장벽 파괴 및 망간 향상된 MRI를 사용하여 기능성 Neuroimaging

Although mice are the dominant model system for studying the genetic and molecular underpinnings of neuroscience, functional neuroimaging in mice remains ...

Dual Electrophysiological Recordings of Synaptically-evoked Astroglial and Neuronal Responses in Acute Hippocampal Slices

급성 Hippocampal 슬라이스에 Synaptically-evoked Astroglial와 Neuronal 응답의 듀얼 Electrophysiological 레코딩

Astrocytes form together with neurons tripartite synapses, where they integrate and modulate neuronal activity. Indeed, astrocytes sense neuronal inputs ...

In vivo Neuronal Calcium Imaging in C. elegans

In vivo Neuronal Calcium Imaging in C. elegans

C.의 생체 Neuronal 칼슘 이미징에서 elegans

The nematode worm C. elegans is an ideal model organism  for relatively simple, low cost neuronal imaging in vivo. Its small transparent body and simple, ...

Fast Micro-iontophoresis of Glutamate and GABA: A Useful Tool to Investigate Synaptic Integration

글루타민산 염과 GABA의 빠른 마이크로 이온 도입 : 시냅틱 통합을 조사하는 유용한 도구

One of the fundamental interests in neuroscience is to understand the integration of excitatory and inhibitory inputs along the very complex structure of ...

Genetic Manipulation of Cerebellar Granule Neurons In Vitro and In Vivo to Study Neuronal Morphology and Migration

Genetic Manipulation of Cerebellar Granule Neurons In Vitro and In Vivo to Study Neuronal Morphology and Migration

소뇌 과립 신경 세포의 유전자 조작<em&gt; 체외</em&gt;와<em&gt; 생체</em&gt; 신경 세포의 형태와 마이그레이션을 연구하는

Developmental events in the brain including neuronal morphogenesis and migration are highly orchestrated processes. In vitro and in vivo analyses allow ...

Brain Slice Biotinylation: An Ex Vivo Approach to Measure Region-specific Plasma Membrane Protein Trafficking in Adult Neurons

Brain Slice Biotinylation: An Ex Vivo Approach to Measure Region-specific Plasma Membrane Protein Trafficking in Adult Neurons

뇌 슬라이스 바이오 티 닐화 :<em&gt; 전의 VIVO</em성인 뉴런에서 지역 고유의 플라즈마 막 단백질 인신 매매를 측정하는&gt; 접근

Regulated endocytic trafficking is the central mechanism facilitating a variety of neuromodulatory events, by dynamically controlling receptor, ion ...

Inducing Plasticity of Astrocytic Receptors by Manipulation of Neuronal Firing Rates

신경 발사 환율의 조작에 의해 성상 세포 수용체의 가소성을 유도

Close to two decades of research has established that astrocytes in situ and in vivo express numerous G protein-coupled receptors (GPCRs) that can be ...

In Utero Electroporation Approaches to Study the Excitability of Neuronal Subpopulations and Single-cell Connectivity

In Utero Electroporation Approaches to Study the Excitability of Neuronal Subpopulations and Single-cell Connectivity

자궁 내 일렉트로는 신경 세포의 부분 집단의 흥분 및 단일 세포의 연결을 연구에 접근

The nervous system is composed of an enormous range of distinct neuronal types. These neuronal subpopulations are characterized by, among other features, ...