Name: in vitro wedge slice preparation for mimicking in vivo neuronal circuit connectivity
Uploaded: 2020-08-18T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about In Vitro Wedge Slice Preparation for Mimicking In Vivo Neuronal Circuit Connectivity at JoVE.com

Denne forskningen ble støttet av Intramural Research Program av NIH, NIDCD, Z01 DC000091 (CJCW).

Alle eksperimentelle prosedyrer ble godkjent av National Institute of Neurological Disorders and Stroke/National Institute on Døvhet og andre kommunikasjonsforstyrrelser Animal Care and Use Committee.
1. Eksperimentelle preparater
MERK: Detaljer om skiveforberedelse, inkludert skjæreløsning, skjæretemperatur, skiveinkubasjonstemperatur og apparat (etc.) er spesifikke for hjernestammeforberedelse utført i dette eksperimentet. Slice inkubasjon detaljer kan endres p...

Kutteprosedyren beskrevet her kalt en kile skive er kraftig for å opprettholde intakt presynaptic neuronal kretser, men med tilgjengeligheten av hjernen skive eksperimentering for analyse av nevronal funksjon. Stor forsiktighet må tas i flere innledende trinn for å maksimere nytten av preparatet for kretsanalyse. Dimensjonene på kilen bør bekreftes ved hjelp av histologisk undersøkelse, noe som er integrert for bekreftelse på at både presynaptiske kjerner og deres aksonale projeksjoner finnes i den tilberedte kil...

Observasjon av aktiviteten til nevrale kretser er ideelt utført med innfødte sensoriske innganger og tilbakemeldinger, og intakt tilkobling mellom hjerneregioner, in vivo. Men å utføre eksperimenter som gir encellede oppløsning av nevrale kretsfunksjon er fortsatt begrenset av tekniske utfordringer i den intakte hjernen. Mens in vivo ekstracellulær elektrofysiologi eller multiphoton bildemetoder kan brukes til å undersøke aktivitet i intakte nervesystemer, tolke hvordan ulike innganger integrere eller måle subthreshold synaptiske innganger er fortsatt vanskelig. In vivo hele celleopptak overvinner disse begrensningene, men er utfordrende å utføre, selv i hjerneregioner som er lett tilgjengelig. Tekniske utfordringer med encellede oppløsningseksperimenter forsterkes ytterligere i visse nevronpopulasjoner som ligger dypt i hjernen, eller i romlig diffuse populasjoner som krever enten genetiske verktøy for å lokalisere celler in vivo (f.eks. genetisk uttrykk for kanalrhodopsin sammen med optrode-opptak) eller post-hoc histokjemisk identifikasjon etter registrering av stedmerking (f.eks. med nevrotransmisjonsspesifikke markører). Å være plassert diffust nær ventral overflaten av hjernestammen, lider mediale olivocochlear (MOC) nevroner av de ovennevntebegrensningene 1,noe som gjør dem ekstremt vanskelige å få tilgang til for in vivo eksperimentering.
Hjerneskiver (~ 100-500 μm tykkelse) har lenge vært brukt til å studere hjernekretser, inkludert auditive hjernestammekretser, på grunn av fysisk segregering av tilkoblede nevroner som finnes i samme skive2,3,4,5,6,7,8,9. Eksperimenter ved hjelp av mye tykkere skiver (> 1 mm) har blitt brukt i andre laboratorier for å forstå hvordan bilaterale innganger integreres i områder av det overlegne olivary komplekset (SOC), inkludert medial overlegen oliven10,11. Disse skivene ble utarbeidet slik at aksoner av hørselsnerven (AN) forble intakt i skiven og ble elektrisk stimulert til å initiere synaptisk nevrotransmitterutgivelse i CN, etterligne aktiviteten til første orden auditive nevroner som de ville reagere på lyd. En stor ulempe med disse tykke skiver er synlighet av nevroner for patch-klemme elektrofysiologiske opptak ("patching"). Patching blir stadig vanskeligere som de mange aksoner i dette området blir myelinated medalderen 12,13,14,15, noe som gjør vevet optisk tett og skjule nevroner selv i en typisk, tynn hjerneskive. Vårt mål er å skape in vitro-preparater som ligner tettere på kretstilkoblingen til in vivo-opptak, men med høy gjennomstrømning og høyoppløselige opptaksevner av visuelt styrt patch-clamp elektrofysiologi i hjerneskiver.
Laboratoriet vårt undersøker fysiologien til nevroner i det auditive efferent-systemet, inkludert MOC-nevroner. Disse kolinerge nevronene gir efferent tilbakemelding til sneglehuset ved å modulere aktiviteten til ytre hårceller (OHCs)16,17,18,19,20. Tidligere studier har vist at denne moduleringen spiller en rolle i gevinstkontroll i sneglehuset21,22,23,24,25,26 og beskyttelse mot akustisk traumer27,28,29,30,31,32,33. Hos mus er MOC-nevroner diffust plassert i ventral kjernen i trapeskroppen (VNTB) i den auditive hjernestammen1. Vår gruppe har benyttet ChAT-IRES-Cre muselinjen krysset med tdTomato reporter muselinje for å målrette MOC nevroner i hjernestamme skiver under epifluorescent belysning. Vi viste at MOC nevroner får afferent hemmende innspill fra ipsilateral medial kjerne av trapeskroppen (MNTB), som er begeistret, i sin tur, av aksler fra kuleformede buskete celler (GBC) i den kontralaterale cochleakjernen (CN)34,35,36,37,38. I tillegg får MOC-nevroner sannsynligvis sine eksitatoriske innspill fra T-stellate celler i kontralaterale CN39,40,41. Samlet viser disse studiene moc nevroner får både excitatory og hemmende innganger avledet fra samme (kontralaterale) øre. Imidlertid er de presynaptiske nevronene, og deres aksoner som konvergerer på MOC-nevroner, ikke helt nær nok til hverandre til å være helt intakte i et typisk koronarskivepreparat. For å undersøke hvordan integrering av synaptiske innganger til MOC-nevroner påvirker deres virkningspotensiale avfyringsmønstre, med fokus på nylig beskrevet hemming, utviklet vi et preparat der vi kunne stimulere de ulike afferentene til MOC-nevroner fra ett øre på den mest fysiologisk realistiske måten mulig, men med de tekniske fordelene med in vitro hjerneskiver eksperimenter.
Kileskiven er et modifisert tykt stykkepreparat designet for undersøkelse av kretsintegrasjon i MOC-nevroner (skjematisert i figur 1A). På den tykke siden av skiven inneholder kilen de avkuttede aksonene til hørselsnerven (kalt "auditiv nerverot" heretter) når de kommer inn i hjernestammen fra periferien og synapse i CN. Den auditive nerveroten kan stimuleres elektrisk til å fremkalle nevrotransmitterutgivelse og synaptisk aktivering av celler i den helt intakte CN42,43,44,45,46. Dette stimuleringsformatet har flere fordeler for kretsanalyse. Først, i stedet for å direkte stimulere T-stellate og GBC axons som gir afferent inngang til MOC nevroner, stimulerer vi AN for å tillate aktivering av iboende kretser rikelig i CN. Disse kretsene modulere produksjonen av CN nevroner til sine mål i hele hjernen, inkludert MOC nevroner46,47,48,49,50,51. For det andre, polysynaptisk aktivering av afferent kretser fra AN gjennom CN oppstrøms av MOC nevroner gir mer naturlig aktivering timing og for plastisitet å skje på disse synapser som de ville in vivo under auditiv stimulering. For det tredje kan vi variere våre stimuleringsmønstre for å etterligne AN-aktivitet. Til slutt er både excitatory og hemmende monaural projeksjoner til MOC nevroner intakt i kilehæren, og deres integrasjon kan måles ved en MOC neuron med presisjonen av patch-clamp elektrofysiologi. Som helhet gir denne aktiveringsordningen en mer intakt krets til MOC-nevronene sammenlignet med et typisk hjerneskiverpreparat. Denne brainstem kile skive kan også brukes til å undersøke andre auditive områder som mottar hemmende innspill fra ipsilateral MNTB inkludert lateral overlegen oliven, overlegen olivary kjerne og mediale overlegen oliven10,11,52,53,54,55,56. Utover vårt spesifikke preparat kan denne kuttemetoden brukes eller endres til å evaluere andre systemer ved å opprettholde tilkobling av langdistanseinnganger og forbedre visualisering av nevroner for en rekke encellede oppløsning elektrofysiologi eller bildeteknikker.
Denne protokollen krever bruk av et vibratomstadium eller en plattform som kan vippes ca. 15°. Her bruker vi et kommersielt tilgjengelig 2-delt magnetisk stadium hvor "scenen" er en metallplate med en buet bunn plassert i en konkav magnetisk "scenebase". Scenen kan deretter skiftes for å justere skivevinkelen. Konsentriske sirkler på scenebasen brukes til å estimere vinkelen reproduserbar. Scenen og scenebasen er plassert i kuttekammeret, hvor den magnetiske scenebasen også kan roteres.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Experimental Preparations</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar, powder</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP1423500</td>
			<td>4% agar block used to stabilize brain tissue during vibratome sectioning</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AlexaFluor Hydrazide 488</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A10436</td>
			<td>Fluorophore used in internal solution to confirm successful MOC neuron patch</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Analytical Balance</td>
			<td>Geneses Scientific (Intramalls)</td>
			<td>AV114</td>
			<td>Weighing chemicals</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Double edged razor blade</td>
			<td>Ted Pella</td>
			<td>121-6</td>
			<td>Vibratome cutting blade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kynurenic acid (5g)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>K3375-5G</td>
			<td>Slicing ACSF additive used to reduce neuron activity during dissection and slicing in order to improve tissue health for patch clamping</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH Meter</td>
			<td>Fisher Scientific (Intramalls)</td>
			<td>13-620-451</td>
			<td>Solution pH tester</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic petri dishes 100mm dia X 20mm</td>
			<td>Fisher Scientific (Intramalls)</td>
			<td>12-556-002</td>
			<td>4% Agar Prep</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stirring Hotplate</td>
			<td>Fisher Scientific (Intramalls)</td>
			<td>11-500-150</td>
			<td>Heating for 4% Agar preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissection and Slicing</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biocytin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>B4261-250MG</td>
			<td>Chemical used for axonal tracing (conjugated to Streptavidin 488)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting Microscope</td>
			<td>Amscope</td>
			<td>SM-1BN</td>
			<td>For precision dissection during brain removal</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #5 Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11252-20</td>
			<td>Fine forceps dissection tool</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Economy tweezers #3</td>
			<td>WPI</td>
			<td>501976</td>
			<td>Forceps dissection tool</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Petri Dish 150mm dia x 15mm H</td>
			<td>Fisher Scientific (Intramalls)</td>
			<td>08-747E</td>
			<td>Dissection dish</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Interface paper (203 X 254mm PCTE Membrane 10um)</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td>1220823</td>
			<td>Slice incubation/biocytin application</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica VT1200S Vibratome</td>
			<td>Leica</td>
			<td>1491200S001</td>
			<td>Vibratome for wedge slice sectioning</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mayo scissors</td>
			<td>Roboz</td>
			<td>RS-6872</td>
			<td>Dissection tool</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Single-edged carbon steel blades</td>
			<td>Fisher Scientific (Intramalls)</td>
			<td>12-640</td>
			<td>Razor blade for dissection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Specimen disc, orienting</td>
			<td>Leica</td>
			<td>14048142068</td>
			<td>Specialized vibratome stage for reproducible tilting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spoonula</td>
			<td>FisherSci</td>
			<td>14-375-10</td>
			<td>Dissection tool</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Super Glue</td>
			<td>Newegg</td>
			<td>15187</td>
			<td>Used for glueing tissue to vibratome stage</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vannas Spring Scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>91500-09</td>
			<td>Dissection tool</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electrophysiology</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>A1R Upright Confocal Microscope</td>
			<td>Nikon Instruments</td>
			<td></td>
			<td>Electrophysiology and imaging microscope, can be any microscope compatible with electrophysiology</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electrode Borosilicate glass w/ Filament OD 1.5mm, ID 1.1mm, 10 cm long</td>
			<td>Sutter Instrument</td>
			<td>BF150-110-10</td>
			<td>Patch clamping pipette glass</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electrode Filler MicroFil</td>
			<td>WPI</td>
			<td>CMF20G</td>
			<td>Patch electrode pipette filler</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>In-line solution heater</td>
			<td>Warner Instruments (GSAdvantage)</td>
			<td>SH-27B</td>
			<td>Slice perfusion system heater</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multi-Micromanipulator Systems</td>
			<td>Sutter Intruments</td>
			<td>MPC-200 with MP285</td>
			<td>Micromanipulators for patch clamp and stimulation electrode placement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P-1000 horizontal pipette puller for glass micropipettes</td>
			<td>Sutter instruments</td>
			<td>FG-P1000</td>
			<td>Patch clamp pipetter puller</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Patch-clamp amplifier and Software</td>
			<td>HEKA</td>
			<td>EPC-10 / Patchmaster Next</td>
			<td>Can be any amplifier/software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recording Chamber</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>RC26G</td>
			<td>Slice &#34;bath&#34; during recording</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recording Chamber Harp</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>640253</td>
			<td>Stablizes slice during electrophysiology recording</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slice Incubation Chamber</td>
			<td>Custom Build</td>
			<td></td>
			<td>Heated, oxygenated holding chamber for slices during recovery after slicing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stimulus isolation unit</td>
			<td>A.M.P.I.</td>
			<td>Iso-Flex</td>
			<td>Stimulus isolation unit for electrophysiology</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe 60CC</td>
			<td>Fischer Scientific (Intramalls)</td>
			<td>14-820-11</td>
			<td>Electrophysiology perfusion fluid handling</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Temperature controller</td>
			<td>Warner Instruments (GSAdvantage)</td>
			<td>TC-324C</td>
			<td>Slice perfusion system temperature controller</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tubing 1/8 OD 1/16 ID</td>
			<td>Fischer Scientific (Intramalls)</td>
			<td>14-171-129</td>
			<td>Electrophysiology perfusion fluid handling</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tugsten concentric bipolar microelectrode</td>
			<td>WPI</td>
			<td>TM33CCINS</td>
			<td>Stimulating electrode for electrophysiology</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Histology</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24 well Plate</td>
			<td>Fisher Scientific (Intramalls)</td>
			<td>12-556006</td>
			<td>Histology slice collection and immunostaining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 Streptavidin</td>
			<td>Jackson Immuno labs</td>
			<td>016-540-084</td>
			<td>Secondary antibody for biocytin visualization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning Orbital Shaker</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>CLS6780FP</td>
			<td>Shaker for immunohistochemistry agitation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cresyl Violet Acetate</td>
			<td>Sigma Aldrich (Intramalls)</td>
			<td>C5042-10G</td>
			<td>Cellular stain for histology</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable Microtome Blades</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>22-210-052</td>
			<td>Sliding microtome blade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter-syringe Nalgene 4mm Cellulose Acetate 0.2um</td>
			<td>Fisher Scientific (Intramalls)</td>
			<td>09-740-34A</td>
			<td>Syringe filter for filling recording pipettes with internal solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluoromount-G Slide Mounting Medium</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>OB100-01</td>
			<td>Immunohistochemistry fluorescence mounting medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glass slide staining dish with rack</td>
			<td>Fisher Scientific (Intramalls)</td>
			<td>08-812</td>
			<td>Cresyl Violet staining chamber</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microm HM450 Sliding Microtome</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>910020</td>
			<td>Freezing microtome for histology</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Cover Glasses: Rectangles 50mm X 24mm</td>
			<td>Fisher Scientific (Intramalls)</td>
			<td>12-543D</td>
			<td>Histochemistry slide cover glass</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Permount mounting medium</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>SP15-100</td>
			<td>Cresyl violet section mounting medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superfrost Slides</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>22-034980</td>
			<td>Histology slides</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vitro wedge slice preparation for mimicking in vivo neuronal circuit connectivity

In vitro skive elektrofysiologi teknikker måle encellede aktivitet med presis elektrisk og timelig oppløsning. Hjerneskiver må være relativt tynne for å visualisere og få tilgang til nevroner for patch-klemming eller bildebehandling, og in vitro-undersøkelse av hjernekretser er begrenset til bare det som er fysisk tilstede i den akutte skiven. For å opprettholde fordelene med in vitro skive eksperimentering samtidig bevare en større del av presynaptic kjerner, utviklet vi en ny skive forberedelse. Denne "kile skive" ble designet for patch-clamp elektrofysiologi opptak for å karakterisere de ulike monaural, lyddrevne innganger til mediale olivocochlear (MOC) nevroner i hjernestammen. Disse nevronene får sine primære afferent excitatory og hemmende innganger fra nevroner aktivert av stimuli i det kontralaterale øret og tilsvarende cochleakjerne (CN). En asymmetrisk hjerneskive ble designet som er tykkest i rostro-caudal domenet på sidekanten av en halvkule og deretter tynner mot den laterale kanten av motsatt halvkule. Denne skiven inneholder, på den tykke siden, den hørbare nerveroten som formidler informasjon om auditive stimuli til hjernen, de indre CN-kretsene, og både de disynaptiske eksitatoriske og trisynaptiske hemmende afferentbanene som konvergerer på kontralaterale MOC-nevroner. Opptak utføres fra MOC nevroner på den tynne siden av skiven, hvor de visualiseres ved hjelp av DIC optikk for typiske patch-klemme eksperimenter. Direkte stimulering av hørselsnerven utføres når den kommer inn i den hørbare hjernestammen, slik at iboende CN-kretsaktivitet og synaptisk plastisitet kan forekomme ved synapser oppstrøms av MOC-nevroner. Med denne teknikken kan man etterligne in vivo kretsaktivering så nært som mulig i stykket. Dette kileskivepreparatet gjelder for andre hjernekretser der kretsanalyser vil ha nytte av bevaring av oppstrøms tilkobling og langdistanseinnganger, i kombinasjon med de tekniske fordelene med in vitro skive fysiologi.

Histologisk undersøkelse av kilehive For vår undersøkelse av auditiv hjernestamme neuron funksjon, kile skive preparatet ble designet for å inneholde auditiv nerve rot og CN contralateral til MOC nevroner målrettet for opptak (eksempel skive vist i figur 1B). Innledende histologisk undersøkelse av preparatet er viktig for å bekrefte at skiven inneholder kjernene som er nødvendige for kretsaktivering, og at aksonære projeksjoner er intakte. To celletyper i CN gir ...

Watch this Scientific Journal Video about In Vitro Wedge Slice Preparation for Mimicking In Vivo Neuronal Circuit Connectivity at JoVE.com

In Vitro Wedge Slice Preparation for Mimicking In Vivo Neuronal Circuit Connectivity

Integrering av ulike synaptiske innganger til nevroner måles best i et preparat som bevarer alle presynaptiske kjerner for naturlig timing og kretsplastisitet, men hjerneskiver som vanligvis bryte mange tilkoblinger. Vi utviklet en modifisert hjerneskive for å etterligne in vivo kretsaktivitet samtidig som in vitro eksperimenteringsevne.

In Vitro Kile skive Forberedelse for å etterligne In Vivo Neuronal Circuit Connectivity

In vitro slice electrophysiology techniques measure single-cell activity with precise electrical and temporal resolution. Brain slices must be relatively ...

Hjerneskiver forsøk tillate avhør av nevronal funksjon med høy elektrisk og timelig oppløsning, men disse skivene vanligvis bryte mange presynaptiske forbindelser. En kileformet skive opprettholder en mer intakt presynaptisk krets. Denne modifiserte hjerneskiven opprettholder en mer komplett in vivo-lignende nevronal krets samtidig som den gir fordelene med in vitro-eksperimentering, for eksempel visuelt veiledede patch clamp opptak, farmakologi og aktivitetsavbildning.Nøyaktig kile skiver geometri kan estimeres basert på atlas plasseringen av nevronene i kretsen, men integriteten til presynaptic schemata og aksoner bør bestemmes ved hjelp av histologi. Begynn med å bruke et barberblad for å kutte huden midt i skallen fra nesen til baksiden av nakken. Skrell tilbake huden for å eksponere skallen og starter ved bunnen av skallen og fortsetter mot nesen, bruk liten saks for å gjøre et snitt i skallen gjennom midtlinjen.På lambda sutur, gjør kutt i skallen fra midtlinjen lateralt mot øret på begge sider for å skrelle tilbake skallen for å avsløre hjernen. Starter på rostral slutten, bruk en liten lab slikkepott for å forsiktig løfte hjernen fra skallen for å tillate optiske nerver å bli kuttet. Fortsett å forsiktig arbeide hjernen bakover, utsette ventral overflaten og bruke fine tang for å forsiktig klemme trigeminusnervene nær ventral overflate av hjernestammen for å kutte dem.Legg preparatet i et glass Petriskål fylt med kald kuttløsning og legg fatet under et disseksjonsmikroskop. Trim ansiktsnervene nær hjernestammen for å eksponere vestibulocochlear nerver. Bruk fine tang til å skyve spissene inn i foraminaen der vestibulocochlear nerven kommer ut av skallen så langt som mulig.Klem for å bryte nervene på begge sider, og la nerveroten være festet til hjernestammen. Fjern meninges og vaskulatur fra ventral overflate av hjernestammen nær trapeskroppen. Klyp deretter de gjenværende kraniale nervene og bindevevet for å frigjøre hjernen helt fra skallen, og ta vare på å bevare den gjenværende ryggmargen, om mulig.For å forberede overflaten av hjernen for ligaen til scenen, plasser hjernen ventral side opp og bruk et sløvt verktøy for å forsiktig immobilisere ryggmargen for å stabilisere hjernevevet. Sett inn åpne tang i en ca 20 graders vinkel gjennom hjernen til bunnen av parabolen slik at spissene går ut av hjerneblydens dorsale overflate til den optiske chiasmen og bruk et barberblad til å skjære langs tangen. Deretter forbereder du en en kubikkcentimeter blokk på 4% agar og sprer en liten dråpe lim inn i et rektangel på scenen.Bruk tang til å løfte hjernen forsiktig og forsiktig dab overflødig væske med kanten av et papirhåndkle. Plasser deretter den blokkerte overflaten på limet slik at ventraloverflaten vender mot bladets retning under kutting og skyv agarblokken forsiktig mot den dorsale overflaten som støtte. For å skaffe kileskiver med cochleanervenroten på den tykke siden og de mediale olivocochlearonronene og den mediale kjernen i trapeskroppen på den tynne siden, plasser den magnetiske platen med den vedlagte hjernen på sceneholderen og plasser holderen i skjærekammeret i en vibratom med hjernens ventrale overflate orientert mot bladet.Fyll kammeret med iskald skjæreløsning og senk bladet ned i karbagenboblet løsning. Skjær skiver caudal til interesseområdet for å sikre at skivene er symmetriske. Deretter skifter scenen ca 15 grader til den ene siden.Fortsett å kutte forsiktig til den hørbare nerveroten er nær overflaten på den ene siden, og ansiktsnerven kan ses på overflaten av den andre siden av skiven. Flytt trinnet 15 grader tilbake til den opprinnelige posisjonen og flytt bladet bort fra vevet. Spinn scenebasen 90 grader slik at den laterale kanten av den tynne siden vender mot bladet og senker bladet flere hundre mikrometer før du sakte bringer bladet nær kanten av vevet.Med bladet trukket litt ned bladet til ønsket tykkelse på den tynne kanten av skiven. Flytt bladet tilbake fra vevet og spinn scenebasen tilbake slik at ventraloverflaten vender mot scenebasen. Lag et kutt for å utpeke rostral overflaten av kileskiven og overføre skiven til en firkantet centimeter stykke grensesnitt papir caudle overflaten ned.Ansiktsnerven skal være synlig på begge halvkuler av skiven på rostraloverflaten. Flytt deretter skiven til et 35 grader Celsius inkubasjonskammer for å gjenopprette i 30 minutter. For å sette opp kilehæren for elektrofysiologianalyse plasserer du prøven i et opptakskammer som kontinuerlig perfunderes med 35 grader Celsius ACSF og stabiliserer skiven.Bruk DIC optikk, fokuser på den hørbare nerveroten på den tykke siden av skiven og bruk en mikromanipulator til å flytte den bipolare wolframstimulerende elektroden til den hørbare nerveroten og forsiktig inn i overflaten av vevet. Flytt synsfeltet til den ventrale kjernen i trapeskroppen på den tynne siden og velg en medial olivocochlea neuron som mål for patch clamp elektrofysiologi under epifluorescens ved hjelp av et 561 nanometer utslippsfilter. Fyll en opptakpipette med riktig intern løsning for det foreslåtte eksperimentet og under DIC optikk patch og registrere fra medial olivocochlear neuron i hele cellekonfigurasjonen.Juster den elektriske stimuleringsalituden til hørselsnerven for å oppnå konsistente postsynaptiske hendelser i den mediale olivocochlearonronnen. Kjør deretter passende stimuleringsprotokoller for å observere fremkalte synaptiske strømmer i mediale olivocochlearononer. Dette kileskiven er designet for å inneholde den hørbare nerveroten og cochleakjernen kontralaterale til de mediale olivocochlearonronene som er rettet mot opptak.I denne cresyl fiolett farget reseksjonert kile skive cochlea kjernen er til stede i nesten sin fulle rostral-caudal grad. Og hørselsnerven rot observeres inn i cochlea kjernen. I tillegg inneholder kileskiven nevroner av den mediale kjernen i trapeskroppen ipsilateral til mediale olivocochlearononer hvor opptakene utføres.For å bekrefte den nevronale tilkoblingen i en kile skive presynaptic innganger stimuleres på to måter. Først stimuleres ventral akustisk stria på midtlinjen elektrisk, aktiverer T-stellate aksler direkte og den mediale kjernen i trapeskroppens nevroner via globular buskete celleaksonstimulering og resulterer i postsynaptiske strømmer som måles ved det mediale olivocochlearonronon. Den auditive nerveroten stimuleres deretter til å aktivere hele monaural stigende hjernestammekretser og å fremkalle postsynaptiske responser.Sammenligning av latensmålene ved første postsynaptiske strøm fremkalt med direkte stimulering av ventral akustisk stria med de som fremkales med auditiv nervestimulering avslører en betydelig lengre ventetid i den hørbare nervestimuleringshendelsen, noe som indikerer synaptisk forsinkelse som følge av den ekstra cochleakjernersynapse aktivert under auditiv nervestimulering. Bruken av anatomiske landemerker og forsiktig manøvrering av magnetplatestadiet er avgjørende for å skape kilehærer med intakte nevronale kretser og pålitelige fremkalte postsynaptiske responser. Denne kutteteknikken gir en plattform for bruk av ekstra in vitro elektrofysiologiverktøy, inkludert kalsium- eller spenningsavbildning, optogenetikk, nevrotransmitter uncaging, og både intracellulær og ekstracellulær farmakologi.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

The Organotypic Hippocampal Slice Culture Model for Examining Neuronal Injury

Organotypic hippocampal slice culture is an in vitro method to examine mechanisms of neuronal injury in which the basic architecture and composition of ...

Organotypic Slice Cultures of Embryonic Ventral Midbrain: A System to Study Dopaminergic Neuronal Development in vitro

Organotypic Slice Cultures of Embryonic Ventral Midbrain: A System to Study Dopaminergic Neuronal Development in vitro

Organotypic Slice kulturer av embryonale Ventral midthjernen: Et system for å Study dopaminerge neuronal Development In vitro</em

The  mouse is an excellent model organism to study mammalian brain development due  to the abundance of molecular and genetic data. However, the ...

Functional Neuroimaging Using Ultrasonic Blood-brain Barrier Disruption and Manganese-enhanced MRI

Funksjonell Bildediagnostiske Bruke Ultrasonic blod-hjerne barrieren avbrudd og mangan forbedret MR

Although mice are the dominant model system for studying the genetic and molecular underpinnings of neuroscience, functional neuroimaging in mice remains ...

Dual Electrophysiological Recordings of Synaptically-evoked Astroglial and Neuronal Responses in Acute Hippocampal Slices

Dual Elektrofysiologiske Opptak av Synaptically-fremkalt Astroglial og Neuronal Responses i akutt hippocampus Slices

Astrocytes form together with neurons tripartite synapses, where they integrate and modulate neuronal activity. Indeed, astrocytes sense neuronal inputs ...

In vivo Neuronal Calcium Imaging in C. elegans

In vivo Neuronal Calcium Imaging in C. elegans

In vivo Neuronal Kalsium Imaging i C. elegans

The nematode worm C. elegans is an ideal model organism  for relatively simple, low cost neuronal imaging in vivo. Its small transparent body and simple, ...

Fast Micro-iontophoresis of Glutamate and GABA: A Useful Tool to Investigate Synaptic Integration

Fast Micro-iontoforese av glutamat og GABA: Et nyttig verktøy for å etterforske Synaptic Integration

One of the fundamental interests in neuroscience is to understand the integration of excitatory and inhibitory inputs along the very complex structure of ...

Genetic Manipulation of Cerebellar Granule Neurons In Vitro and In Vivo to Study Neuronal Morphology and Migration

Genetic Manipulation of Cerebellar Granule Neurons In Vitro and In Vivo to Study Neuronal Morphology and Migration

Genetisk manipulering av Lillehjernen Granule Neuroner<em&gt; In Vitro</em&gt; Og<em&gt; I Vivo</em&gt; Å studere nevrale morfologi og migrasjon

Developmental events in the brain including neuronal morphogenesis and migration are highly orchestrated processes. In vitro and in vivo analyses allow ...

Brain Slice Biotinylation: An Ex Vivo Approach to Measure Region-specific Plasma Membrane Protein Trafficking in Adult Neurons

Brain Slice Biotinylation: An Ex Vivo Approach to Measure Region-specific Plasma Membrane Protein Trafficking in Adult Neurons

Brain Slice Biotinvlerina: An<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Approach to Measure Region spesifikke Plasma Membrane Protein Trafficking in Adult Neuroner

Regulated endocytic trafficking is the central mechanism facilitating a variety of neuromodulatory events, by dynamically controlling receptor, ion ...

Inducing Plasticity of Astrocytic Receptors by Manipulation of Neuronal Firing Rates

Inducing Plasticity av astrocytic Reseptorer av Manipulering av nevronal utløsning priser

Close to two decades of research has established that astrocytes in situ and in vivo express numerous G protein-coupled receptors (GPCRs) that can be ...

In Utero Electroporation Approaches to Study the Excitability of Neuronal Subpopulations and Single-cell Connectivity

In Utero Electroporation Approaches to Study the Excitability of Neuronal Subpopulations and Single-cell Connectivity

I Utero Electroporation Tilnærminger til Studer Excitability av neuronal subpopulasjoner og Single-celle Tilkobling

The nervous system is composed of an enormous range of distinct neuronal types. These neuronal subpopulations are characterized by, among other features, ...