Name: in vitro wedge slice preparation for mimicking in vivo neuronal circuit connectivity
Uploaded: 2020-08-18T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about In Vitro Wedge Slice Preparation for Mimicking In Vivo Neuronal Circuit Connectivity at JoVE.com

Это исследование было поддержано Программой интрамуральных исследований NIH, NIDCD, No01 DC000091 (CJCW).

Все экспериментальные процедуры были одобрены Национальным институтом неврологических расстройств и инсульта / Национальный институт по глухоте и другим коммуникационным расстройствам ухода за животными и использования комитета.
1. Экспериментальные препараты
<p class=...

Процедура нарезки, описанная здесь, называют ломтик клина является мощным для поддержания нетронутыми пресинаптических нейрональных схем, но с доступностью мозга ломтик экспериментов для анализа нейрональной функции. Необходимо принять меры в несколько первоначальных шагов, с тем ч?...

Наблюдение за активностью нейронных цепей идеально выполняется с помощью местных сенсорных входов и обратной связи, а также нетронутой связи между областями мозга, in vivo. Тем не менее, выполнение экспериментов, которые дают одноклеточное разрешение функции нейронной цепи по-прежнему ограничивается техническими проблемами в нетронутом мозге. В то время как экстрацеллюлярная электрофизиология in vivo или многофотонные методы визуализации могут быть использованы для исследования активности в нетронутой нервной системе, интерпретация того, как различные входные данные интегрируются или измеряют синаптические входы подразводки, остается трудной. In vivo цельноклеточные записи преодолевают эти ограничения, но являются сложными для выполнения, даже в областях мозга, которые легко доступны. Технические проблемы одноклеточного разрешения экспериментов еще более усиливаются в определенных популяциях нейронов, которые расположены глубоко в головном мозге, или в пространственно диффузных популяциях, которые требуют либо генетических инструментов для обнаружения клеток in vivo (например, генетическое выражение channelrhodopsin в паре с optrode записи) или пост-специальной гистохимической идентификации после записи сайта маркировки (например, с нейротрансмиссии конкретных маркеров). Находясь диффузно вблизи брюшной поверхности ствола мозга, медиальные оливокохлеарные (MOC) нейроны страдают отвышеуказанных ограничений 1, что делает их чрезвычайно трудно получить доступ для in vivo экспериментов.
Мозг ломтики (толщиной 100-500 мкм) уже давно используются для изучения схем мозга, в том числе слуховой ствол мозга схемы, из-за физической сегрегации подключенных нейронов, которые содержатсяв том же ломтик 2,3,4,5,6,7,8,9. Эксперименты с использованием гораздо толще ломтиками (Nogt;1 мм) были использованы в других лабораториях, чтобыпонять,как двусторонние входы интегрировать в областях высшего оливариального комплекса (SOC), включая медиальный превосходныйоливковый 10,11. Эти ломтики были подготовлены таким образом, что аксоны слухового нерва (АН) остались нетронутыми в ломтик и были электрически стимулировали инициировать синаптический нейромедиатор релиз в CN, имитируя активность первого порядка слуховых нейронов, как они будут реагировать на звук. Одним из основных недостатков этих толстых ломтиков является видимость нейронов для патч-зажим электрофизиологических записей ("патч"). Патчирование становится все болеетрудным,как многочисленные аксоны в этой области становятся myelinatedс возрастом 12,13,14,15, что делает ткань оптически плотной и заслоняющих нейронов даже в типичный, тонкий срез мозга. Наша цель состоит в том, чтобы создать в пробирке препараты, которые больше напоминают цепи подключения in vivo записей, но с высокой пропускной способностью и высоким разрешением записи способности визуально управляемых патч-зажим электрофизиологии в мозге ломтиками.
Наша лаборатория исследует физиологию нейронов слуховой эфферентной системы, включая нейроны MOC. Эти холинергические нейроны обеспечивают эфферентную обратную связь с улиткой, модулируя активность наружных волосковых клеток (OHCs)16,17,18,19,20. Предыдущие исследования показали, что эта модуляция играет определенную роль вусилении контроля в улитке 21,22,23,24,25,26 изащитеот акустической травмы 27,28,29,30,31,32,33. У мышей, MOC нейроны диффузно расположены в брюшном ядре трапециевидного тела (VNTB) в слуховой стволмозга 1. Наша группа использовала chAT-IRES-Cre мыши линии пересекли с tdTomato репортер мыши линии для целевой MOC нейронов в ствол мозга ломтиками под эпифлуоресцентным освещением. Мы показали, что нейроны MOC получают афферентный ингибильный вход от ипсилатерального медиального ядра трапециевидного тела (MNTB), который возбуждается, в свою очередь, аксонами из шаровых густых клеток (GBC) в контралатерального кохлеарного ядра (CN)34,35,36,37,38. Кроме того, нейроны MOC, вероятно, получают их возбудительный вход от Т-стеллат клеток в контралатеральной CN39,40,41. Взятые вместе, эти исследования показывают, MOC нейроны получают как возбуждательные и ингибирующие входы, полученные из того же (контралатерального) уха. Тем не менее, пресинаптические нейроны, и их аксоны сходятся на нейронах MOC, не совсем достаточно близко друг к другу, чтобы быть полностью нетронутыми в типичной подготовки корональной ломтик. Чтобы исследовать, как интеграция синаптических входов в нейроны MOC влияет на их действия потенциальных моделей стрельбы, с акцентом на недавно описанные ингибирования, мы разработали препарат, в котором мы могли бы стимулировать различные афференты MOC нейронов из одного уха в наиболее физиологически реалистичным способом возможно, но с техническими преимуществами in vitro мозга ломтик экспериментов.
Срез клина является модифицированным толстым ломтиком подготовки, предназначенной для исследования цепи интеграции в нейронах MOC (схематизирована на рисунке 1A). На толстой стороне ломтика, клин содержит отрубленные аксоны слухового нерва (так называют "корень слухового нерва" в дальнейшем), как они входят в ствол мозга с периферии и синапса в CN. Корень слухового нерва можно электрически стимулировать, чтобы вызвать высвобождение нейромедиатора и синаптической активации клеток полностью нетронутыми CN42,43,44,45,46. Этот формат стимуляции имеет ряд преимуществ для анализа схемы. Во-первых, вместо того, чтобы непосредственно стимулировать T-stellate и GBC аксоны, которые обеспечивают афферентный вход в нейроны MOC, мы стимулируем AN, чтобы позволить активацию внутренних цепей, обильных в CN. Эти схемы модулировать выход нейронов CN к своим целям по всему мозгу, в том числе MOCнейронов 46,47,48,49,50,51. Во-вторых, полисинаптическая активация афферентных цепей от AN через CN вверх по течению нейронов MOC позволяет более естественное время активации и для пластичности происходить на этих синапсах по мере того как они in vivo во время слуховой стимуляции. В-третьих, мы можем изменять наши модели стимуляции, чтобы имитировать активность АН. Наконец, как возбуждательные, так и ингибирующие монауральные проекции на нейроны MOC не повреждены в срезе клина, и их интеграция может быть измерена в нейроне MOC с точностью электрофизиологии патч-зажима. В целом, эта схема активации обеспечивает более нетронутой цепи нейронов MOC по сравнению с типичной подготовки ломтик мозга. Этот срез клина ствола мозга также может быть использован для исследования других слуховыхобластей,которые получают ингибирующие входы от ипсилатерального MNTB, включая боковое превосходное оливковое, превосходное оливариальное ядро и медиальное превосходноеоливковое 10,11,52,53,54,55,56. Помимо нашей конкретной подготовки, этот метод нарезки может быть использован или изменен для оценки других систем с преимуществами поддержания подключения дальнего ввода и улучшения визуализации нейронов для различных одноклеточного разрешения электрофизиологии или методов визуализации.
Этот протокол требует использования вибромной сцены или платформы, которые могут быть наклонены примерно на 15 градусов. Здесь мы используем коммерчески доступные 2-кусок магнитной стадии, где "этап" является металлический диск с изогнутым дном помещены в вогнутой магнитной "стадии базы". Этап может быть сдвинут для регулировки угла разреза. Концентрические круги на сценической базе используются для оценки угла воспроизведения. Этапная и сценическая основа помещаются в камеру нарезки, где также может вращаться основание магнитной сцены.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Experimental Preparations</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar, powder</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP1423500</td>
			<td>4% agar block used to stabilize brain tissue during vibratome sectioning</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AlexaFluor Hydrazide 488</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A10436</td>
			<td>Fluorophore used in internal solution to confirm successful MOC neuron patch</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Analytical Balance</td>
			<td>Geneses Scientific (Intramalls)</td>
			<td>AV114</td>
			<td>Weighing chemicals</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Double edged razor blade</td>
			<td>Ted Pella</td>
			<td>121-6</td>
			<td>Vibratome cutting blade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kynurenic acid (5g)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>K3375-5G</td>
			<td>Slicing ACSF additive used to reduce neuron activity during dissection and slicing in order to improve tissue health for patch clamping</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH Meter</td>
			<td>Fisher Scientific (Intramalls)</td>
			<td>13-620-451</td>
			<td>Solution pH tester</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic petri dishes 100mm dia X 20mm</td>
			<td>Fisher Scientific (Intramalls)</td>
			<td>12-556-002</td>
			<td>4% Agar Prep</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stirring Hotplate</td>
			<td>Fisher Scientific (Intramalls)</td>
			<td>11-500-150</td>
			<td>Heating for 4% Agar preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissection and Slicing</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biocytin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>B4261-250MG</td>
			<td>Chemical used for axonal tracing (conjugated to Streptavidin 488)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting Microscope</td>
			<td>Amscope</td>
			<td>SM-1BN</td>
			<td>For precision dissection during brain removal</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #5 Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11252-20</td>
			<td>Fine forceps dissection tool</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Economy tweezers #3</td>
			<td>WPI</td>
			<td>501976</td>
			<td>Forceps dissection tool</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Petri Dish 150mm dia x 15mm H</td>
			<td>Fisher Scientific (Intramalls)</td>
			<td>08-747E</td>
			<td>Dissection dish</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Interface paper (203 X 254mm PCTE Membrane 10um)</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td>1220823</td>
			<td>Slice incubation/biocytin application</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica VT1200S Vibratome</td>
			<td>Leica</td>
			<td>1491200S001</td>
			<td>Vibratome for wedge slice sectioning</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mayo scissors</td>
			<td>Roboz</td>
			<td>RS-6872</td>
			<td>Dissection tool</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Single-edged carbon steel blades</td>
			<td>Fisher Scientific (Intramalls)</td>
			<td>12-640</td>
			<td>Razor blade for dissection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Specimen disc, orienting</td>
			<td>Leica</td>
			<td>14048142068</td>
			<td>Specialized vibratome stage for reproducible tilting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spoonula</td>
			<td>FisherSci</td>
			<td>14-375-10</td>
			<td>Dissection tool</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Super Glue</td>
			<td>Newegg</td>
			<td>15187</td>
			<td>Used for glueing tissue to vibratome stage</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vannas Spring Scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>91500-09</td>
			<td>Dissection tool</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electrophysiology</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>A1R Upright Confocal Microscope</td>
			<td>Nikon Instruments</td>
			<td></td>
			<td>Electrophysiology and imaging microscope, can be any microscope compatible with electrophysiology</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electrode Borosilicate glass w/ Filament OD 1.5mm, ID 1.1mm, 10 cm long</td>
			<td>Sutter Instrument</td>
			<td>BF150-110-10</td>
			<td>Patch clamping pipette glass</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electrode Filler MicroFil</td>
			<td>WPI</td>
			<td>CMF20G</td>
			<td>Patch electrode pipette filler</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>In-line solution heater</td>
			<td>Warner Instruments (GSAdvantage)</td>
			<td>SH-27B</td>
			<td>Slice perfusion system heater</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multi-Micromanipulator Systems</td>
			<td>Sutter Intruments</td>
			<td>MPC-200 with MP285</td>
			<td>Micromanipulators for patch clamp and stimulation electrode placement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P-1000 horizontal pipette puller for glass micropipettes</td>
			<td>Sutter instruments</td>
			<td>FG-P1000</td>
			<td>Patch clamp pipetter puller</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Patch-clamp amplifier and Software</td>
			<td>HEKA</td>
			<td>EPC-10 / Patchmaster Next</td>
			<td>Can be any amplifier/software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recording Chamber</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>RC26G</td>
			<td>Slice &#34;bath&#34; during recording</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recording Chamber Harp</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>640253</td>
			<td>Stablizes slice during electrophysiology recording</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slice Incubation Chamber</td>
			<td>Custom Build</td>
			<td></td>
			<td>Heated, oxygenated holding chamber for slices during recovery after slicing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stimulus isolation unit</td>
			<td>A.M.P.I.</td>
			<td>Iso-Flex</td>
			<td>Stimulus isolation unit for electrophysiology</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe 60CC</td>
			<td>Fischer Scientific (Intramalls)</td>
			<td>14-820-11</td>
			<td>Electrophysiology perfusion fluid handling</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Temperature controller</td>
			<td>Warner Instruments (GSAdvantage)</td>
			<td>TC-324C</td>
			<td>Slice perfusion system temperature controller</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tubing 1/8 OD 1/16 ID</td>
			<td>Fischer Scientific (Intramalls)</td>
			<td>14-171-129</td>
			<td>Electrophysiology perfusion fluid handling</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tugsten concentric bipolar microelectrode</td>
			<td>WPI</td>
			<td>TM33CCINS</td>
			<td>Stimulating electrode for electrophysiology</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Histology</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24 well Plate</td>
			<td>Fisher Scientific (Intramalls)</td>
			<td>12-556006</td>
			<td>Histology slice collection and immunostaining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 Streptavidin</td>
			<td>Jackson Immuno labs</td>
			<td>016-540-084</td>
			<td>Secondary antibody for biocytin visualization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning Orbital Shaker</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>CLS6780FP</td>
			<td>Shaker for immunohistochemistry agitation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cresyl Violet Acetate</td>
			<td>Sigma Aldrich (Intramalls)</td>
			<td>C5042-10G</td>
			<td>Cellular stain for histology</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable Microtome Blades</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>22-210-052</td>
			<td>Sliding microtome blade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter-syringe Nalgene 4mm Cellulose Acetate 0.2um</td>
			<td>Fisher Scientific (Intramalls)</td>
			<td>09-740-34A</td>
			<td>Syringe filter for filling recording pipettes with internal solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluoromount-G Slide Mounting Medium</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>OB100-01</td>
			<td>Immunohistochemistry fluorescence mounting medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glass slide staining dish with rack</td>
			<td>Fisher Scientific (Intramalls)</td>
			<td>08-812</td>
			<td>Cresyl Violet staining chamber</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microm HM450 Sliding Microtome</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>910020</td>
			<td>Freezing microtome for histology</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Cover Glasses: Rectangles 50mm X 24mm</td>
			<td>Fisher Scientific (Intramalls)</td>
			<td>12-543D</td>
			<td>Histochemistry slide cover glass</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Permount mounting medium</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>SP15-100</td>
			<td>Cresyl violet section mounting medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superfrost Slides</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>22-034980</td>
			<td>Histology slides</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vitro wedge slice preparation for mimicking in vivo neuronal circuit connectivity

Электрофизиологические методы in vitro измеряют одноклеточную активность с точным электрическим и временным разрешением. Мозг ломтики должны быть относительно тонкими, чтобы правильно визуализировать и доступ к нейронам для патч-зажима или изображения, и в пробирке изучение схемы мозга ограничивается только то, что физически присутствует в острой ломтик. Чтобы сохранить преимущества экспериментов в пробирке, сохраняя при этом большую часть пресинаптических ядер, мы разработали новую подготовку ломтика. Этот "клин ломтик" был разработан для патч-зажим электрофизиологии записей для характеристики различных монауральных, звуковых входов в медиальной olivocochlear (MOC) нейронов в стволе мозга. Эти нейроны получают свои первичные возбудительные и ингибирующие входы от нейронов, активированных стимулами в контралатеральной уха и соответствующего кохлеарного ядра (CN). Был разработан асимметричный кусочек мозга, который является самым толстым в ростро-каудальном домене на боковом краю одного полушария, а затем истончается к боковому краю противоположного полушария. Этот ломтик содержит, на толстой стороне, корень слухового нерва, передающий информацию о слуховых стимулах к мозгу, внутренней схеме CN, и как дисинаптическом возбуждающих и трисинаптических ингибирующие афферентные пути, которые сходятся на контралатеральных нейронов MOC. Запись выполняется из нейронов MOC на тонкой стороне ломтика, где они визуализированы с помощью оптики DIC для типичных экспериментов патч-зажим. Прямая стимуляция слухового нерва осуществляется при входе в слуховой ствол мозга, что позволяет внутренней активности цепи CN и синаптической пластичности происходит в синапсах вверх по течению нейронов MOC. С помощью этого метода можно имитировать активацию цепи in vivo как можно ближе в пределах среза. Этот клин срез подготовки применима к другим схемам мозга, где схема анализы выиграют от сохранения подключения вверх по течению и дальнего ввода, в сочетании с техническими преимуществами физиологии в пробирке ломтик.

Гистологическое исследование ломтика клина Для нашего исследования слуховой функции нейрона ствола мозга, препарат ломтика клина был разработан, чтобы содержать корень слухового нерва и CN контралатеральных нейронов MOC, предназначенных для записи (пример ломтик показано <str...

Watch this Scientific Journal Video about In Vitro Wedge Slice Preparation for Mimicking In Vivo Neuronal Circuit Connectivity at JoVE.com

In Vitro Wedge Slice Preparation for Mimicking In Vivo Neuronal Circuit Connectivity

Интеграция различных синаптических входов в нейроны лучше всего измеряется в препарате, который сохраняет все до синаптические ядра для естественного времени и пластичности цепи, но ломтики мозга обычно разрывают многие соединения. Мы разработали модифицированный срез мозга, чтобы имитировать активность цепи in vivo, сохраняя при этом возможности экспериментов в пробирке.

In Vitro Клин Фрагмент Подготовка для имитации In Vivo Нейрональной цепи подключения

In vitro slice electrophysiology techniques measure single-cell activity with precise electrical and temporal resolution. Brain slices must be relatively ...

Эксперименты с ломтиками мозга позволяют допроса нейронной функции с высоким электрическим и временным разрешением, но эти ломтики обычно разорвать многие пресинаптические соединения. Клиновидный ломтик поддерживает более нетронутую пресинаптическую схему. Этот модифицированный срез мозга поддерживает более полную виво-подобную нейронную схему, обеспечивая при этом преимущества экспериментов in vitro, такие как визуально управляемые записи зажима патчей, фармакология и визуализация активности.Точную нарезанную геометрию клина можно оценить на основе расположения атласа нейронов в цепи, но целостность пресинаптической шематы и аксонов должна определяться с помощью гистологии. Начните с помощью лезвия бритвы, чтобы сократить кожу в средней линии черепа от носа до задней части шеи. Очистите кожу, чтобы разоблачить череп и, начиная с основания черепа и продолжая к носу, использовать небольшие ножницы, чтобы сделать разрез в черепе через середину.На шве лямбды, сделать порезы в черепе от средней линии боковой к уху с обеих сторон, чтобы очистить череп, чтобы разоблачить мозг. Начиная с рострального конца, используйте небольшой лабораторный шпатель, чтобы аккуратно поднять мозг из черепа, чтобы зрительные нервы были разорваны. Продолжайте мягко работать мозга назад, подвергая брюшной поверхности и использовать тонкие щипся, чтобы тщательно ущипнуть тригеминальных нервов вблизи брюшной поверхности ствола мозга, чтобы сократить их.Поместите препарат в стеклянную чашку Петри, наполненную холодным нарезаным раствором, и поместите блюдо под рассеченный микроскоп. Обрезать лицевые нервы близко к стволу мозга, чтобы разоблачить вестибюльно-скелетные нервы. Используйте тонкие типсы, чтобы подтолкнуть кончики в foramina, где вестибюльно-бликохлеарный нерв выходит из черепа, насколько это возможно.Pinch разорвать нервы с обеих сторон, оставляя нервный корень прилагается к стволу мозга. Удалите озночек и сосудов из брюшной поверхности ствола мозга вблизи трапециевидного тела. Затем щепотку оставшихся черепных нервов и соединительной ткани, чтобы полностью освободить мозг от черепа, заботясь, чтобы сохранить оставшийся спинной мозг, если это возможно.Для подготовки поверхности мозга для приспособления к сцене место брюшной стороны мозга вверх и использовать тупой инструмент, чтобы мягко обездвижить спинной мозг для стабилизации ткани мозга. Вставьте открытые типсы под углом около 20 градусов через мозг в нижней части блюда, так что кончики выхода спинной поверхности мозга caudal к оптической чиазм и использовать лезвие бритвы, чтобы сократить вдоль типсов. Затем подготовь один кубический сантиметровый блок 4%agar и выложить небольшую каплю клея в прямоугольник на сцене.Используйте типсы, чтобы осторожно поднять мозг и аккуратно мазок избыток жидкости с краем бумажного полотенца. Затем поместите заблокированную поверхность на клей так, чтобы вентраальная поверхность была обращена к направлению лезвия во время нарезки и осторожно прижмите агаровый блок к спинной поверхности в качестве опоры. Чтобы приобрести ломтики клина с корнем кохлеарного нерва на толстой стороне и медиальной оливокохлеарных нейронов и медиальное ядро трапециевидного тела на тонкой стороне, поместите магнитный диск с прикрепленным мозгом на держатель сцены и поместите держателя в нарезке камеры вибромы с вентральной поверхности мозга, ориентированной на лезвие.Заполните камеру раствором ледяной нарезки и опустите лезвие в карбогенный раствор. Вырезать ломтики caudal в области, представляющие интерес, чтобы убедиться, что ломтики симметричны. Затем сдвинуть сцену примерно на 15 градусов в одну сторону.Продолжить нарезки тщательно, пока корень слухового нерва близко к поверхности с одной стороны, и лицевой нерв можно увидеть на поверхности другой стороны ломтика. Сдвиг этапе 15 градусов обратно в исходное положение и переместить лезвие от ткани. Спин стадии базы 90 градусов, так что боковой край тонкой стороны сталкивается с лезвием и опустите лезвие несколько сотен микрон, прежде чем медленно чего лезвие близко к краю ткани.С лезвием вытягивается немного ниже лезвие до желаемой толщины тонкого края ломтика. Перемести лезвие назад от ткани и закрути основание этапа назад так, что вентральная поверхность смотрит на основание этапа. Сделайте разрез, чтобы обозначить ростральной поверхности клина ломтик и передать ломтик на один квадратный сантиметр кусок интерфейса бумаги caudle поверхности вниз.Лицевой нерв должен быть виден на обоих полушариях ломтика на ростральной поверхности. Затем переместите ломтик в инкубационую камеру по 35 градусов по Цельсию, чтобы восстановиться в течение 30 минут. Чтобы настроить срез клина для электрофизиологического анализа поместите образец в камеру записи, которая непрерывно проливается с 35 градусов по Цельсию ACSF и стабилизировать ломтик.Используя оптику DIC, сосредоточьтесь на корень слухового нерва на толстой стороне ломтика и используйте микроманипулятор для перемещения биполярного вольфрама, стимулирующего электрод к корню слухового нерва и осторожно в поверхность ткани. Переместите поле зрения на брюшное ядро трапециевидного тела на тонкой стороне и выберите медиальный оливокохлеарный нейрон в качестве мишени для электрофизиологии зажима при эпифлюоресценции с помощью фильтра выбросов 561 нанометров. Заполните запись пипетки с соответствующим внутренним решением для предлагаемого эксперимента и под DIC оптики патч и запись из медиальной оливокохлеарный нейрон в конфигурации всей клетки.Отрегулируйте амплитуду электрической стимуляции корня слухового нерва, чтобы получить последовательные постсинаптические события в медиальной оливокохлеарный нейрон. Затем запустите соответствующие протоколы стимуляции для наблюдения вызванных синаптических тока в медиальной оливокохлеарных нейронов. Этот клин ломтик подготовки предназначен для сдерживания корня слухового нерва и кохлеарного ядра контралатеральной медиальной оливокохлеарных нейронов, предназначенных для записи.В этом cresyl фиолетовый окрашенных resectioned клин ломтик кохлеарного ядра присутствует почти в полном рострал-caudal степени. И слуховой нервный корень наблюдается вход в кохлеарное ядро. Кроме того, срез клина содержит нейроны медиального ядра трапециевидного тела ipsilateral к медиальной оливокохлеарных нейронов, из которых выполняются записи.Для подтверждения нейронной связи в клин ломтик пресинаптических входов стимулируются двумя способами. Во-первых, брюшной акустической стрии в средней линии электрически стимулируется, активации T-stellate аксонов непосредственно и медиальное ядро трапециевидных нейронов тела через шаровые густые клетки аксон стимуляции и в результате postsynaptic токов, которые измеряются в медиальной оливокохлеарный нейрон. Корень слухового нерва затем стимулируется, чтобы активировать весь монауральный восходящей схемы ствола мозга и вызвать постсинаптические реакции.Сравнение показателей задержки начала первого постсинаптического тока, вызванного прямой стимуляцией брюшной акустической стрии с показателями, вызванными слуховой стимуляцией нерва, показывает значительно более длинную задержку в случае стимуляции слухового нерва, что свидетельствует о синаптической задержке в результате дополнительного кохлеарного ядра, активированного во время слуховой стимуляции нерва. Использование анатомических ориентиров и тщательное маневрирование магнитного диска этапе имеют решающее значение для создания клина ломтики с нетронутыми нейрональной схемы и надежной вызвал пост синаптических реакций. Этот метод нарезки обеспечивает платформу для использования дополнительных электрофизиологических инструментов in vitro, включая визуализацию кальция или напряжения, оптогенетику, нейромедиатор, а также внутриклеточную и внеклеточную фармакологию.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

The Organotypic Hippocampal Slice Culture Model for Examining Neuronal Injury

Органотипической гиппокампа Модель культуры фрагмент за рассмотрение нейронов травмы

Organotypic hippocampal slice culture is an in vitro method to examine mechanisms of neuronal injury in which the basic architecture and composition of ...

Organotypic Slice Cultures of Embryonic Ventral Midbrain: A System to Study Dopaminergic Neuronal Development in vitro

Organotypic Slice Cultures of Embryonic Ventral Midbrain: A System to Study Dopaminergic Neuronal Development in vitro

Органотипической культур Кусочек Эмбриональные Брюшной мозга: системы по изучению дофаминергической нейронов развития В пробирке</em

The  mouse is an excellent model organism to study mammalian brain development due  to the abundance of molecular and genetic data. However, the ...

Functional Neuroimaging Using Ultrasonic Blood-brain Barrier Disruption and Manganese-enhanced MRI

Функциональные нейровизуализации с использованием ультразвуковых Гематоэнцефалический Разрушение барьеров и марганца-МРТ

Although mice are the dominant model system for studying the genetic and molecular underpinnings of neuroscience, functional neuroimaging in mice remains ...

Dual Electrophysiological Recordings of Synaptically-evoked Astroglial and Neuronal Responses in Acute Hippocampal Slices

Двойной Электрофизиологические Записи синаптически-вызванных астроглиального и нейрональных ответов, при остром срезов гиппокампа

Astrocytes form together with neurons tripartite synapses, where they integrate and modulate neuronal activity. Indeed, astrocytes sense neuronal inputs ...

In vivo Neuronal Calcium Imaging in C. elegans

In vivo Neuronal Calcium Imaging in C. elegans

В естественных нейронных изображений кальция в C. Элеганс

The nematode worm C. elegans is an ideal model organism  for relatively simple, low cost neuronal imaging in vivo. Its small transparent body and simple, ...

Fast Micro-iontophoresis of Glutamate and GABA: A Useful Tool to Investigate Synaptic Integration

Быстрый Micro-ионтофорезом глутамата и ГАМК: полезный инструмент по расследованию Synaptic интеграции

One of the fundamental interests in neuroscience is to understand the integration of excitatory and inhibitory inputs along the very complex structure of ...

Genetic Manipulation of Cerebellar Granule Neurons In Vitro and In Vivo to Study Neuronal Morphology and Migration

Genetic Manipulation of Cerebellar Granule Neurons In Vitro and In Vivo to Study Neuronal Morphology and Migration

Генетических манипуляций мозжечка Granule нейронов<em&gt; Экстракорпоральное</em&gt; И<em&gt; В Vivo</em&gt; По изучению нейронных Морфология и миграция

Developmental events in the brain including neuronal morphogenesis and migration are highly orchestrated processes. In vitro and in vivo analyses allow ...

Brain Slice Biotinylation: An Ex Vivo Approach to Measure Region-specific Plasma Membrane Protein Trafficking in Adult Neurons

Brain Slice Biotinylation: An Ex Vivo Approach to Measure Region-specific Plasma Membrane Protein Trafficking in Adult Neurons

Мозг Slice Биотинилирование:<em&gt; Экс Vivo</em&gt; Подход к Измерьте Регион-специфический плазменным мембранный белок с торговлей взрослых нейронов

Regulated endocytic trafficking is the central mechanism facilitating a variety of neuromodulatory events, by dynamically controlling receptor, ion ...

Inducing Plasticity of Astrocytic Receptors by Manipulation of Neuronal Firing Rates

Склонение пластичности астроцитов рецепторов манипуляциями нейронных уровней расхода топлива

Close to two decades of research has established that astrocytes in situ and in vivo express numerous G protein-coupled receptors (GPCRs) that can be ...

In Utero Electroporation Approaches to Study the Excitability of Neuronal Subpopulations and Single-cell Connectivity

In Utero Electroporation Approaches to Study the Excitability of Neuronal Subpopulations and Single-cell Connectivity

В Utero Электропорация подходы к изучению возбудимости нейрональных субпопуляциях и Connectivity одноклеточные

The nervous system is composed of an enormous range of distinct neuronal types. These neuronal subpopulations are characterized by, among other features, ...