Name: in vitro wedge slice preparation for mimicking in vivo neuronal circuit connectivity
Uploaded: 2020-08-18T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about In Vitro Wedge Slice Preparation for Mimicking In Vivo Neuronal Circuit Connectivity at JoVE.com

Esta investigación fue apoyada por el Programa de Investigación Intramuros del NIH, NIDCD, Z01 DC000091 (CJCW).

Todos los procedimientos experimentales fueron aprobados por el Instituto Nacional de Trastornos Neurológicos y Accidentes Cerebrovasculares/Instituto Nacional sobre Sordera y Otros Trastornos de la Comunicación Comité de Cuidado y Uso Animal.
1. Preparaciones experimentales
NOTA: Los detalles relativos a la preparación de la rebanada, incluyendo la solución de corte, la temperatura de corte, la temperatura de incubación de rodajas y el aparato (etc.) son espec?...

El procedimiento de corte descrito aquí llamado una rebanada de cuña es potente para mantener intacta el circuito neuronal presináptico, pero con la accesibilidad de la experimentación de la rebanada cerebral para el análisis de la función neuronal. Se debe tener mucho cuidado en varios pasos iniciales con el fin de maximizar la utilidad de la preparación para el análisis de circuitos. Las dimensiones de la cuña deben confirmarse mediante el examen histológico, que es fundamental para la confirmación de que ta...

La observación de la actividad de los circuitos neuronales se realiza idealmente con entradas sensoriales nativas y retroalimentación, y conectividad intacta entre las regiones cerebrales, in vivo. Sin embargo, la realización de experimentos que dan resolución de una sola célula de la función del circuito neural todavía está limitada por desafíos técnicos en el cerebro intacto. Mientras que la electrofisiología extracelular in vivo o los métodos de imagen multifoton se pueden utilizar para investigar la actividad en sistemas nerviosos intactos, interpretar cómo diferentes entradas integran o miden las entradas sinápticas de subtrasinas sigue siendo difícil. Las grabaciones de células enteras in vivo superan estas limitaciones, pero son difíciles de realizar, incluso en regiones cerebrales a las que se puede acceder fácilmente. Los desafíos técnicos de los experimentos de resolución de una sola célula se amplifican aún más en ciertas poblaciones de neuronas que se encuentran en lo profundo del cerebro, o en poblaciones espacialmente difusas que requieren herramientas genéticas para localizar células in vivo (por ejemplo, expresión genética de channelrhodopsin emparejada con registro de optrode) o identificación histoquímica post-hoc después de registrar el etiquetado del sitio (por ejemplo, con marcadores específicos de la neurotransmisión). Al estar ubicadas difusamente cerca de la superficie ventral del tronco cerebral, las neuronas olivocochlear medial (MOC) sufren de las limitaciones anteriores1,por lo que son extremadamente difíciles de acceder para la experimentación in vivo.
Las rebanadas cerebrales (espesor de 100-500 m) se han utilizado durante mucho tiempo para estudiar los circuitos cerebrales, incluyendo circuitos auditivos de tronco encefálica, debido a la segregación física de las neuronas conectadas que se encuentran dentro de la misma rebanada2,3,4,5,6,7,8,9. En otros laboratorios se han empleado experimentos con rodajas mucho más gruesas (>1 mm) para entender cómo se integran las entradas bilaterales en áreas del complejo olivar superior (SOC), incluyendo la aceituna superior medial10,11. Estas rebanadas se prepararon de tal manera que los axones del nervio auditivo (AN) permanecieron intactos dentro de la rebanada y fueron estimulados eléctricamente para iniciar la liberación de neurotransmisores sinápticos en el CN, imitando la actividad de las neuronas auditivas de primer orden, ya que responderían al sonido. Una de las principales desventajas de estas rebanadas gruesas es la visibilidad de las neuronas para las grabaciones electrofisiológicas de la abrazadera de parches ("parcheing"). Parchear se vuelve cada vez más difícil a medida que los numerosos axones de esta zona se miinantican conedades de 12,13,14,15años, haciendo que el tejido ópticamente denso y oscureciendo las neuronas incluso en una rebanada cerebral típica, delgada. Nuestro objetivo es crear preparaciones in vitro que se asemejen más a la conectividad de circuito de las grabaciones in vivo, pero con las capacidades de grabación de alto rendimiento y alta resolución de la electrofisiología de la abrazadera de parche guiada visualmente en las rebanadas cerebrales.
Nuestro laboratorio investiga la fisiología de las neuronas del sistema auditivo eferente, incluidas las neuronas MOC. Estas neuronas colinérgicas proporcionan una retroalimentación eferente a la cóclea modulando la actividad de las células pilosas externas (OHC)16,17,18,19,20. Estudios previos han demostrado que esta modulación juega un papel en el control de ganancia en la cóclea21,22,23,24,25,26 y la protección contra el trauma acústico27,28,29,30,31,32,33. En ratones, las neuronas MOC se encuentran difusamente en el núcleo ventral del cuerpo trapezoidal (VNTB) en el tronco cerebral auditivo1. Nuestro grupo ha utilizado la línea de ratón ChAT-IRES-Cre cruzada con la línea de ratón reportero tdTomato para apuntar a las neuronas MOC en rebanadas de tronco cerebral bajo iluminación epifluorescente. Mostramos que las neuronas MOC reciben una aporte inhibitoria aferente del núcleo medial ipsilateral del cuerpo trapezoide (MNTB), que está excitado, a su vez, por axones de células tupidas globulares (GBC) en el núcleo coclear contralateral (CN)34,35,36,37,38. Además, las neuronas MOC probablemente reciben su entrada excitatoria de células T-estelares en el NC contralateral39,40,41. En conjunto, estos estudios muestran que las neuronas MOC reciben insumos excitatorios e inhibitorios derivados del mismo oído (contralateral). Sin embargo, las neuronas presinápticas, y sus axones convergentes en las neuronas MOC, no están lo suficientemente cerca unas de otras para estar completamente intactas en una preparación típica de la rebanada coronal. Para investigar cómo la integración de las entradas sinápticas a las neuronas MOC afecta a sus patrones de disparo potencial de acción, con un enfoque en la inhibición recién descrita, desarrollamos una preparación en la que podríamos estimular los diversos aferentes a las neuronas MOC de un oído de la manera más realista fisiológicamente posible, pero con los beneficios técnicos de los experimentos in vitro de la división cerebral.
La rebanada de cuña es una preparación de rodaja gruesa modificada diseñada para la investigación de la integración de circuitos en neuronas MOC (esquemática en la Figura 1A). En el lado grueso de la rebanada, la cuña contiene los axones cortados del nervio auditivo (llamado "raíz nerviosa auditiva" en lo sucesivo) a medida que entran en el tronco encefálica desde la periferia y la sinapsis en el NC. La raíz nerviosa auditiva se puede estimular eléctricamente para evocar la liberación de neurotransmisores y la activación sináptica de las células de la CN42completamenteintacta,43,44,45,46. Este formato de estimulación tiene varios beneficios para el análisis de circuitos. En primer lugar, en lugar de estimular directamente los axones T-estelar y GBC que proporcionan una entrada diferente a las neuronas MOC, estimulamos la AN para permitir la activación de circuitos intrínsecos abundantes en la NC. Estos circuitos modulan la salida de las neuronas CN a sus objetivos en todo el cerebro, incluyendo las neuronas MOC46,47,48,49,50,51. En segundo lugar, la activación polisináptica de los circuitos aferentes desde el AN a través de la CN aguas arriba de las neuronas MOC permite un tiempo de activación más natural y que la plasticidad se produzca en estas sinapsis como lo harían in vivo durante la estimulación auditiva. En tercer lugar, podemos variar nuestros patrones de estimulación para imitar la actividad ano. Por último, las proyecciones monoaurales excitatorias e inhibitorias a las neuronas MOC están intactas en la rodaja de cuña, y su integración se puede medir en una neurona MOC con la precisión de la electrofisiología de la abrazadera de parche. En su conjunto, este esquema de activación proporciona un circuito más intacto a las neuronas MOC en comparación con una preparación típica de la rebanada cerebral. Esta rebanada de cuña de tronco encefálica también se puede utilizar para investigar otras áreas auditivas que reciben aporte inhibitorio de MNTB ipsilateral incluyendo la aceituna superior lateral, núcleo olivario superior y aceituna medial superior10,11,52,53,54,55,56. Más allá de nuestra preparación específica, este método de corte se puede utilizar o modificar para evaluar otros sistemas con los beneficios de mantener la conectividad de entradas de largo alcance y mejorar la visualización de las neuronas para una variedad de electrofisiología de resolución de una sola célula o técnicas de imagen.
Este protocolo requiere el uso de una etapa vibratoria o una plataforma que se puede inclinar aproximadamente 15o. Aquí utilizamos una etapa magnética de 2 piezas disponible comercialmente donde la "etapa" es un disco de metal con un fondo curvo colocado en una "base de etapa" magnética cóncava. A continuación, se puede desplazar el escenario para ajustar el ángulo de corte. Los círculos concéntricos en la base del escenario se utilizan para estimar el ángulo de forma reproducible. La base de la etapa y la etapa se colocan en la cámara de corte, donde también se puede girar la base de la etapa magnética.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Experimental Preparations</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar, powder</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP1423500</td>
			<td>4% agar block used to stabilize brain tissue during vibratome sectioning</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AlexaFluor Hydrazide 488</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A10436</td>
			<td>Fluorophore used in internal solution to confirm successful MOC neuron patch</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Analytical Balance</td>
			<td>Geneses Scientific (Intramalls)</td>
			<td>AV114</td>
			<td>Weighing chemicals</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Double edged razor blade</td>
			<td>Ted Pella</td>
			<td>121-6</td>
			<td>Vibratome cutting blade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kynurenic acid (5g)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>K3375-5G</td>
			<td>Slicing ACSF additive used to reduce neuron activity during dissection and slicing in order to improve tissue health for patch clamping</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH Meter</td>
			<td>Fisher Scientific (Intramalls)</td>
			<td>13-620-451</td>
			<td>Solution pH tester</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic petri dishes 100mm dia X 20mm</td>
			<td>Fisher Scientific (Intramalls)</td>
			<td>12-556-002</td>
			<td>4% Agar Prep</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stirring Hotplate</td>
			<td>Fisher Scientific (Intramalls)</td>
			<td>11-500-150</td>
			<td>Heating for 4% Agar preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissection and Slicing</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biocytin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>B4261-250MG</td>
			<td>Chemical used for axonal tracing (conjugated to Streptavidin 488)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting Microscope</td>
			<td>Amscope</td>
			<td>SM-1BN</td>
			<td>For precision dissection during brain removal</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #5 Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11252-20</td>
			<td>Fine forceps dissection tool</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Economy tweezers #3</td>
			<td>WPI</td>
			<td>501976</td>
			<td>Forceps dissection tool</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Petri Dish 150mm dia x 15mm H</td>
			<td>Fisher Scientific (Intramalls)</td>
			<td>08-747E</td>
			<td>Dissection dish</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Interface paper (203 X 254mm PCTE Membrane 10um)</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td>1220823</td>
			<td>Slice incubation/biocytin application</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica VT1200S Vibratome</td>
			<td>Leica</td>
			<td>1491200S001</td>
			<td>Vibratome for wedge slice sectioning</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mayo scissors</td>
			<td>Roboz</td>
			<td>RS-6872</td>
			<td>Dissection tool</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Single-edged carbon steel blades</td>
			<td>Fisher Scientific (Intramalls)</td>
			<td>12-640</td>
			<td>Razor blade for dissection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Specimen disc, orienting</td>
			<td>Leica</td>
			<td>14048142068</td>
			<td>Specialized vibratome stage for reproducible tilting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spoonula</td>
			<td>FisherSci</td>
			<td>14-375-10</td>
			<td>Dissection tool</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Super Glue</td>
			<td>Newegg</td>
			<td>15187</td>
			<td>Used for glueing tissue to vibratome stage</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vannas Spring Scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>91500-09</td>
			<td>Dissection tool</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electrophysiology</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>A1R Upright Confocal Microscope</td>
			<td>Nikon Instruments</td>
			<td></td>
			<td>Electrophysiology and imaging microscope, can be any microscope compatible with electrophysiology</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electrode Borosilicate glass w/ Filament OD 1.5mm, ID 1.1mm, 10 cm long</td>
			<td>Sutter Instrument</td>
			<td>BF150-110-10</td>
			<td>Patch clamping pipette glass</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electrode Filler MicroFil</td>
			<td>WPI</td>
			<td>CMF20G</td>
			<td>Patch electrode pipette filler</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>In-line solution heater</td>
			<td>Warner Instruments (GSAdvantage)</td>
			<td>SH-27B</td>
			<td>Slice perfusion system heater</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multi-Micromanipulator Systems</td>
			<td>Sutter Intruments</td>
			<td>MPC-200 with MP285</td>
			<td>Micromanipulators for patch clamp and stimulation electrode placement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P-1000 horizontal pipette puller for glass micropipettes</td>
			<td>Sutter instruments</td>
			<td>FG-P1000</td>
			<td>Patch clamp pipetter puller</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Patch-clamp amplifier and Software</td>
			<td>HEKA</td>
			<td>EPC-10 / Patchmaster Next</td>
			<td>Can be any amplifier/software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recording Chamber</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>RC26G</td>
			<td>Slice &#34;bath&#34; during recording</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recording Chamber Harp</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>640253</td>
			<td>Stablizes slice during electrophysiology recording</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slice Incubation Chamber</td>
			<td>Custom Build</td>
			<td></td>
			<td>Heated, oxygenated holding chamber for slices during recovery after slicing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stimulus isolation unit</td>
			<td>A.M.P.I.</td>
			<td>Iso-Flex</td>
			<td>Stimulus isolation unit for electrophysiology</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe 60CC</td>
			<td>Fischer Scientific (Intramalls)</td>
			<td>14-820-11</td>
			<td>Electrophysiology perfusion fluid handling</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Temperature controller</td>
			<td>Warner Instruments (GSAdvantage)</td>
			<td>TC-324C</td>
			<td>Slice perfusion system temperature controller</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tubing 1/8 OD 1/16 ID</td>
			<td>Fischer Scientific (Intramalls)</td>
			<td>14-171-129</td>
			<td>Electrophysiology perfusion fluid handling</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tugsten concentric bipolar microelectrode</td>
			<td>WPI</td>
			<td>TM33CCINS</td>
			<td>Stimulating electrode for electrophysiology</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Histology</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24 well Plate</td>
			<td>Fisher Scientific (Intramalls)</td>
			<td>12-556006</td>
			<td>Histology slice collection and immunostaining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 Streptavidin</td>
			<td>Jackson Immuno labs</td>
			<td>016-540-084</td>
			<td>Secondary antibody for biocytin visualization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning Orbital Shaker</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>CLS6780FP</td>
			<td>Shaker for immunohistochemistry agitation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cresyl Violet Acetate</td>
			<td>Sigma Aldrich (Intramalls)</td>
			<td>C5042-10G</td>
			<td>Cellular stain for histology</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable Microtome Blades</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>22-210-052</td>
			<td>Sliding microtome blade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter-syringe Nalgene 4mm Cellulose Acetate 0.2um</td>
			<td>Fisher Scientific (Intramalls)</td>
			<td>09-740-34A</td>
			<td>Syringe filter for filling recording pipettes with internal solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluoromount-G Slide Mounting Medium</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>OB100-01</td>
			<td>Immunohistochemistry fluorescence mounting medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glass slide staining dish with rack</td>
			<td>Fisher Scientific (Intramalls)</td>
			<td>08-812</td>
			<td>Cresyl Violet staining chamber</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microm HM450 Sliding Microtome</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>910020</td>
			<td>Freezing microtome for histology</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Cover Glasses: Rectangles 50mm X 24mm</td>
			<td>Fisher Scientific (Intramalls)</td>
			<td>12-543D</td>
			<td>Histochemistry slide cover glass</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Permount mounting medium</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>SP15-100</td>
			<td>Cresyl violet section mounting medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superfrost Slides</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>22-034980</td>
			<td>Histology slides</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vitro wedge slice preparation for mimicking in vivo neuronal circuit connectivity

Las técnicas de electrofisiología de rebanadas in vitro miden la actividad de una sola célula con una resolución eléctrica y temporal precisa. Las rebanadas cerebrales deben ser relativamente delgadas para visualizar y acceder adecuadamente a las neuronas para la sujeción de parches o imágenes, y el examen in vitro de los circuitos cerebrales se limita sólo a lo que está físicamente presente en la rebanada aguda. Para mantener los beneficios de la experimentación in vitro en rodajas conservando al mismo tiempo una porción más grande de núcleos presinápticos, desarrollamos una nueva preparación de la rebanada. Esta "rebanada de cuña" fue diseñada para grabaciones electrofisiología de parches-pinza para caracterizar las diversas entradas monoaurales impulsadas por sonido a las neuronas olivocochlear medial (MOC) en el tronco cerebral. Estas neuronas reciben sus entradas excitatorias e inhibitorias aferentes primarias de las neuronas activadas por estímulos en el oído contralateral y el núcleo coclear correspondiente (CN). Se diseñó una rebanada cerebral asimétrica que es más gruesa en el dominio rostro-caudal en el borde lateral de un hemisferio y luego se adelgaza hacia el borde lateral del hemisferio opuesto. Esta rebanada contiene, en el lado grueso, la raíz nerviosa auditiva que transmite información sobre los estímulos auditivos al cerebro, el circuito NC intrínseco, y tanto el excitatorio disynaptic y trisináptica inhibitorio aferente vías que convergen en las neuronas MOC contralaterales. La grabación se realiza a partir de neuronas MOC en el lado delgado de la rebanada, donde se visualizan utilizando óptica DIC para experimentos típicos de abrazadera de parche. La estimulación directa del nervio auditivo se realiza al entrar en el tronco cerebral auditivo, lo que permite que la actividad intrínseca del circuito CN y la plasticidad sináptica se produzcan en las sinapsis aguas arriba de las neuronas MOC. Con esta técnica, se puede imitar la activación del circuito in vivo lo más cerca posible dentro de la rebanada. Esta preparación de la rebanada de cuña es aplicable a otros circuitos cerebrales donde los análisis de circuitos se beneficiarían de la preservación de la conectividad aguas arriba y las entradas de largo alcance, en combinación con las ventajas técnicas de la fisiología in vitro de las rebanadas.

Examen histológico de la rodaja de cuña Para nuestra investigación de la función de la neurona del tronco encefálica auditiva, la preparación de la rebanada de cuña fue diseñada para contener la raíz nerviosa auditiva y la NC contralateral a las neuronas MOC dirigidas a las grabaciones (ejemplo de sector mostrado en la Figura 1B). El examen histológico inicial de la preparación es importante para confirmar que la rebanada contiene los núcleos necesarios para l...

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In Vitro Wedge Slice Preparation for Mimicking In Vivo Neuronal Circuit Connectivity

La integración de diversas entradas sinápticas a las neuronas se mide mejor en una preparación que preserva todos los núcleos presinápticos para la sincronización natural y la plasticidad del circuito, pero las rebanadas cerebrales suelen cortar muchas conexiones. Desarrollamos una rebanada cerebral modificada para imitar la actividad del circuito in vivo mientras mantenemos la capacidad de experimentación in vitro.

In Vitro Wedge Slice Preparación para imitar la conectividad del circuito neuronal In Vivo

In vitro slice electrophysiology techniques measure single-cell activity with precise electrical and temporal resolution. Brain slices must be relatively ...

Los experimentos de sectores cerebrales permiten el interrogamiento de la función neuronal con alta resolución eléctrica y temporal, pero estas rebanadas suelen cortar muchas conexiones presinápticas. Una rebanada en forma de cuña mantiene un circuito presináptico más intacto. Esta rebanada cerebral modificada mantiene un circuito neuronal in vivo más completo al tiempo que proporciona los beneficios de la experimentación in vitro, como grabaciones de abrazaderas de parches guiadas visualmente, farmacología e imágenes de actividad.La geometría precisa en rodajas de cuña se puede estimar en función de las ubicaciones del atlas de las neuronas dentro del circuito, pero la integridad de la schemata presináptica y los axones debe determinarse utilizando histología. Comienza usando una cuchilla de afeitar para cortar la piel en la línea media del cráneo desde la nariz hasta la parte posterior del cuello. Pelar hacia atrás la piel para exponer el cráneo y comenzando en la base del cráneo y continuando hacia la nariz, utilizar tijeras pequeñas para hacer una incisión en el cráneo a través de la línea media.En la sutura lambda, haz cortes en el cráneo desde la línea media lateralmente hacia la oreja en ambos lados para pelar el cráneo para exponer el cerebro. Comenzando en el extremo rostral, usa una pequeña espátula de laboratorio para levantar suavemente el cerebro del cráneo para permitir que los nervios ópticos se se teguen. Continúe trabajando suavemente el cerebro hacia atrás, exponiendo la superficie ventral y use fórceps finos para pellizcar cuidadosamente los nervios trigéminos cerca de la superficie ventral del tronco encefálica para cortarlos.Coloque la preparación en un plato petri de vidrio lleno de solución de corte en frío y coloque el plato debajo de un microscopio diseccionado. Recorta los nervios faciales cerca del tronco encefálica para exponer los nervios vestibulocochlear. Usa fórceps finos para empujar las puntas hacia el foramina donde el nervio vestibulocochlear sale del cráneo lo más lejos posible.Pincha para cortar los nervios de ambos lados, dejando la raíz nerviosa unida al tronco encefálica. Retire las meninges y vasculaturas de la superficie ventral del tronco encefárico cerca del cuerpo trapezoidal. Luego pellizca los nervios craneales restantes y el tejido conectivo para liberar el cerebro completamente del cráneo, teniendo cuidado de preservar la médula espinal restante, si es posible.Para preparar la superficie del cerebro para fijarse a la etapa, coloque el lado ventral del cerebro hacia arriba y utilice una herramienta contundente para inmovilizar suavemente la médula espinal para estabilizar el tejido cerebral. Inserte fórceps abiertos en un ángulo de aproximadamente 20 grados a través del cerebro hasta la parte inferior de la placa para que las puntas salgan de la superficie dorsal del cerebro caudal al quiasmo óptico y utilice una cuchilla de afeitar para cortar a lo largo de los fórceps. A continuación, prepara un bloque de un centímetro cúbico de 4% de agar y extiende una pequeña gota de pegamento en un rectángulo en el escenario.Use fórceps para levantar cuidadosamente el cerebro y frote suavemente el exceso de líquido con el borde de una toalla de papel. A continuación, coloque la superficie bloqueada sobre el pegamento para que la superficie ventral esté orientada hacia la dirección de la hoja durante el corte y empuje el bloque de agar suavemente contra la superficie dorsal como soporte. Para adquirir rodajas de cuña con la raíz nerviosa coclear en el lado grueso y las neuronas olivocochlear mediales y el núcleo medial del cuerpo trapezoidal en el lado delgado, coloque el disco magnético con el cerebro unido en el soporte del escenario y coloque el soporte en la cámara de corte de un vibratome con la superficie ventral del cerebro orientada hacia la hoja.Llene la cámara con una solución de corte en frío y baje la cuchilla en la solución de carbógeno burbuja. Corte los sectores caudal a la región de interés para asegurarse de que los sectores son simétricos. A continuación, cambie la etapa aproximadamente 15 grados a un lado.Continúe cortando cuidadosamente hasta que la raíz del nervio auditivo esté cerca de la superficie en un lado y el nervio facial se pueda ver en la superficie del otro lado de la rebanada. Vuelva a colocar la etapa 15 grados a la posición original y aleje la hoja del tejido. Gire la base de la etapa 90 grados de modo que el borde lateral del lado delgado esté mirando hacia la hoja y baje la hoja varios cientos de micras antes de llevar lentamente la hoja al borde del tejido.Con la hoja retraída ligeramente baje la hoja al espesor deseado del borde delgado de la rebanada. Mueva la hoja hacia atrás del tejido y gire la base de la etapa hacia atrás para que la superficie ventral se dirija a la base de la etapa. Haga un corte para designar la superficie rostral de la rebanada de cuña y transfiera la rebanada a un pedazo de un centímetro cuadrado de superficie de caudle de papel de interfaz hacia abajo.El nervio facial debe ser visible en ambos hemisferios de la rebanada en la superficie rostral. A continuación, mueva la rebanada a una cámara de incubación de 35 grados Celsius para recuperarse durante 30 minutos. Para configurar la rebanada de cuña para el análisis de electrofisiología, coloque la muestra en una cámara de grabación que se perfunda continuamente con 35 grados Celsius ACSF y estabilice la rebanada.Usando la óptica DIC, concéntrese en la raíz nerviosa auditiva en el lado grueso de la rebanada y use un micromaniprógrafo para mover el electrodo estimulante de tungsteno bipolar a la raíz del nervio auditivo y suavemente en la superficie del tejido. Mueva el campo de visión al núcleo ventral del cuerpo trapezoidal en el lado delgado y seleccione una neurona olivocochlear medial como objetivo para la electrofisiología de la abrazadera de parche bajo epifluorescencia utilizando un filtro de emisión de 561 nanómetros. Llene una pipeta de grabación con la solución interna adecuada para el experimento propuesto y bajo parche óptico DIC y grabe desde la neurona olivocochlear medial en la configuración de toda la célula.Ajuste la amplitud de estimulación eléctrica de la raíz nerviosa auditiva para obtener eventos postsinápticos consistentes en la neurona olivocochlear medial. A continuación, ejecute los protocolos de estimulación adecuados para observar las corrientes sinápticas evocadas en las neuronas olivocochlear mediales. Esta preparación de la rebanada de cuña está diseñada para contener la raíz nerviosa auditiva y el núcleo coclear contralateral a las neuronas olivocochlear mediales dirigidas a grabaciones.En esta rebanada de cuña teñida de color violeta cresil, el núcleo coclear está presente en casi su extensión rostral-caudal completa. Y la raíz del nervio auditivo se observa entrando en el núcleo coclear. Además, la rebanada de cuña contiene neuronas del núcleo medial del cuerpo trapezoidal ipsilateral a las neuronas olivocochlear mediales desde las que se realizan grabaciones.Para confirmar la conectividad neuronal dentro de una rebanada de cuña, las entradas presinápticas se estimulan de dos maneras. En primer lugar, la estría acústica ventral en la línea media se estimula eléctricamente, activando los axones T-estelares directamente y el núcleo medial de las neuronas trapezoidales del cuerpo a través de la estimulación globular de axilas de células tupidas y dando lugar a corrientes postsinápticas que se miden en la neurona olivocochlear medial. La raíz nerviosa auditiva se estimula entonces para activar todo el circuito de tronco cerebral ascendente monaural y para evocar respuestas postsinápticas.La comparación de las medidas de latencia de inicio de la primera corriente postsináptica evocada con estimulación directa de la estrías acústica ventral con las evocadas con estimulación del nervio auditivo revela una latencia significativamente más larga en el evento de estimulación nerviosa auditiva, indicativo del retraso sináptico resultante de la sinapsis coclear adicional activada durante la estimulación del nervio auditivo. El uso de puntos de referencia anatómicos y la maniobra cuidadosa de la etapa del disco magnético son críticos para crear rodajas de cuña con circuitos neuronales intactos y respuestas sinápticas evocadas confiables. Esta técnica de corte proporciona una plataforma para el uso de herramientas electrofisiología in vitro adicionales, incluyendo imágenes de calcio o voltaje, optogenética, descapado de neurotransmisores y farmacología intracelular y extracelular.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

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Genetic Manipulation of Cerebellar Granule Neurons In Vitro and In Vivo to Study Neuronal Morphology and Migration

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La manipulación genética de las neuronas cerebelosa gránulo<em&gt; In Vitro</em&gt; Y<em&gt; En Vivo</em&gt; Estudiar Neuronal Morfología y Migración

Developmental events in the brain including neuronal morphogenesis and migration are highly orchestrated processes. In vitro and in vivo analyses allow ...

Brain Slice Biotinylation: An Ex Vivo Approach to Measure Region-specific Plasma Membrane Protein Trafficking in Adult Neurons

Brain Slice Biotinylation: An Ex Vivo Approach to Measure Region-specific Plasma Membrane Protein Trafficking in Adult Neurons

Cerebro Slice Biotinilación: Una<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Enfoque medir tráfico de proteínas específicas Región membrana plasmática en adultos las neuronas

Regulated endocytic trafficking is the central mechanism facilitating a variety of neuromodulatory events, by dynamically controlling receptor, ion ...

Inducing Plasticity of Astrocytic Receptors by Manipulation of Neuronal Firing Rates

La inducción de la plasticidad de astrocítico Receptores por manipulación de Neuronales cocción Precios

Close to two decades of research has established that astrocytes in situ and in vivo express numerous G protein-coupled receptors (GPCRs) that can be ...

In Utero Electroporation Approaches to Study the Excitability of Neuronal Subpopulations and Single-cell Connectivity

In Utero Electroporation Approaches to Study the Excitability of Neuronal Subpopulations and Single-cell Connectivity

La electroporación en el útero métodos para estudiar la excitabilidad de las subpoblaciones neuronales y Conectividad Una sola célula

The nervous system is composed of an enormous range of distinct neuronal types. These neuronal subpopulations are characterized by, among other features, ...