Name: in vitro wedge slice preparation for mimicking in vivo neuronal circuit connectivity
Uploaded: 2020-08-18T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about In Vitro Wedge Slice Preparation for Mimicking In Vivo Neuronal Circuit Connectivity at JoVE.com

Denna forskning stöddes av Intramural Research Program av NIH, NIDCD, Z01 DC000091 (CJCW).

Alla experimentella förfaranden godkändes av National Institute of Neurological Disorders and Stroke/National Institute on Deafness and Other Communication Disorders Animal Care and Use Committee.
1. Experimentella preparat
OBS: Detaljer angående skivberedning inklusive skivningslösning, skivningstemperatur, skiva inkubationstemperatur och apparatur (etc.) är specifika för hjärnstamsberedning utförd i detta experiment. Skiva inkubation detaljer kan ändras per...

Skivning förfarandet beskrivs här kallas en kil skiva är kraftfull för att upprätthålla intakt presynaptic neuronal kretsar, men med tillgängligheten av hjärnan skiva experiment för analys av neuronal funktion. Stor försiktighet måste tas i flera inledande steg för att maximera nyttan av preparatet för kretsanalys. Kilens dimensioner bör bekräftas med hjälp av histologisk undersökning, som är integrerad för bekräftelse av att både presynaptiska kärnor och deras axonalprojektioner finns inom den bere...

Observation av aktivitet av neurala kretsar är idealiskt utförs med inhemska sensoriska ingångar och feedback, och intakt anslutning mellan hjärnan regioner, in vivo. Men utför experiment som ger encellig upplösning av neurala kretsfunktion är fortfarande begränsad av tekniska utmaningar i intakt hjärnan. Medan in vivo extracellulär elektrofysiologi eller multifoton avbildningsmetoder kan användas för att undersöka aktivitet i intakta nervsystem, tolka hur olika ingångar integrera eller mäta subthreshold synaptiska ingångar förblir svårt. In vivo helcellsinspelningar övervinna dessa begränsningar men är utmanande att utföra, även i hjärnan regioner som är lätt att komma åt. Tekniska utmaningar av encelliga upplösningsexperiment förstärks ytterligare i vissa neuronpopulationer som ligger djupt i hjärnan, eller i rumsligt diffusa populationer som kräver antingen genetiska verktyg för att lokalisera celler in vivo (t.ex. genetiska uttryck för channelrhodopsin paras ihop med optrodeinspelning) eller post-hoc histokemisk identifiering efter inspelning av sitens märkning (t.ex. med neurotransmission-specifika markörer). Att ligga diffust nära den ventrala ytan av hjärnstammen, mediala olivocochlear (MOC) nervceller lider av ovanstående begränsningar1, vilket gör dem extremt svårt att komma åt för in vivo experiment.
Hjärnan skivor (~ 100-500 μm tjocklek) har länge använts för att studera hjärnan kretsar, inklusive auditiva hjärnstammen kretsar, på grund av den fysiska segregeringen av anslutna nervceller som finns inom samma skiva2,3,4,5,6,7,8,9. Experiment med mycket tjockare skivor (>1 mm) har varit anställda i andra labb för att förstå hur bilaterala ingångar integreras i områden av den överlägsna olivary komplex (SOC) inklusive den mediala överlägsen oliv10,11. Dessa skivor var beredda så att axoner av hörselnerven (AN) förblev intakt inom skiva och var elektriskt stimuleras att inleda synaptic signalsubstansen release i CN, härma verksamhet första ordningens hörsel nervceller som de skulle svara på ljud. En stor nackdel med dessa tjocka skivor är synlighet av nervceller för patch-clamp elektrofysiologiska inspelningar ("patching"). Patching blir allt svårare eftersom de många axoner i detta område blir myelinated medålder 12,13,14,15, vilket gör vävnaden optiskt tät och döljande nervceller även i en typisk, tunn hjärna skiva. Vårt mål är att skapa in vitro-preparat som mer liknar kretsens anslutning av in vivo-inspelningar, men med hög genomströmning och högupplösta inspelningsförmågor hos visuellt guidad patch-clamp elektrofysiologi i hjärnskivor.
Vårt labb undersöker fysiologi neuroner av hörsel efferent systemet, inklusive MOC nervceller. Dessa kolinerga nervceller ger efferent feedback till cochlea genom modulera aktiviteten hos yttre hårceller (OHCs)16,17,18,19,20. Tidigare studier har visat att denna modulering spelar en roll i att få kontroll i snäckan21,22,23,24,25,26 och skydd mot akustiskt trauma27,28,29,30,31,32,33. Hos möss, MOC nervceller är diffust ligger i den ventrala kärnan i trapetsoid kroppen (VNTB) i hörselhjärnstammen1. Vår grupp har utnyttjat ChAT-IRES-Cre muslinjen korsade med tdTomato reporter mus linje för att rikta MOC nervceller i hjärnstammen skivor under epifluorescerande belysning. Vi visade att MOC nervceller får afferent hämmande ingång från ipsilateral mediala kärnan i trapetsoid kroppen (MNTB), som är upphetsad, i sin tur, av axoner från klotformiga buskiga celler (GBC) i den kontralaterala cochlear kärnan (CN)34,35,36,37,38. Dessutom, MOC nervceller sannolikt får sina excitatoriska input från T-stellate celler i kontralateral CN39,40,41. Sammantaget visar dessa studier MOC nervceller får både excitatoriska och hämmande ingångar som härrör från samma (kontralateral) öra. Emellertid, den presynaptiska nervceller, och deras axoner konvergerande på MOC nervceller, är inte riktigt tillräckligt nära varandra för att vara helt intakt i en typisk koronal skiva beredning. För att undersöka hur integration av synaptiska ingångar till MOC nervceller påverkar deras åtgärder potentiella bränning mönster, med fokus på nyligen beskrivna hämning, utvecklade vi en beredning där vi kunde stimulera de olika afferents till MOC nervceller från ena örat på det mest fysiologiskt realistiska sätt som möjligt, men med de tekniska fördelarna med in vitro hjärnan skiva experiment.
Kilskivan är en modifierad tjock skiva beredning avsedd för undersökning av krets integration i MOC nervceller (schematized i figur 1A). På den tjocka sidan av skivan innehåller kilen hörselnervens avhuggna axoner (kallas "auditiv nervrot" härefter) när de kommer in i hjärnstammen från periferin och synapsen i CN. Den auditiva nervrot kan elektriskt stimuleras att framkalla signalsubstansen release och synaptisk aktivering av celler i den helt intakta CN42,43,44,45,46. Detta stimuleringsformat har flera fördelar för kretsanalys. Först, istället för att direkt stimulera T-stellate och GBC axoner som ger afferent input till MOC nervceller, stimulerar vi AN att tillåta aktivering av inneboende kretsar rikligt i CN. Dessa kretsar modulera produktionen av CN nervceller till sina mål i hela hjärnan, inklusive MOC nervceller46,47,48,49,50,51. För det andra, den polysynaptiska aktiveringen av afferenta kretsar från AN genom CN uppströms MOC nervceller möjliggör mer naturlig aktivering timing och för plasticitet att inträffa vid dessa synapser som de skulle in vivo under auditiv stimulering. För det tredje kan vi variera våra stimuleringsmönster för att efterlikna EN aktivitet. Slutligen, både excitatoriska och hämmande monaural prognoser till MOC nervceller är intakt i kilen skiva, och deras integration kan mätas vid en MOC neuron med precision patch-clamp elektrofysiologi. Som helhet ger detta aktiveringssystem en mer intakt krets till MOC nervceller jämfört med en typisk hjärnan skiva beredning. Denna hjärnstammen kil slice kan också användas för att undersöka andra hörselområden som får hämmande ingång från ipsilateral MNTB inklusive den laterala överlägsen oliv, överlägsen olivary kärnan och mediala överlägsen oliv10,11,52,53,54,55,56. Utöver vår specifika förberedelse, kan denna skivning metod användas eller ändras för att utvärdera andra system med fördelarna med att upprätthålla anslutning av långväga ingångar och förbättra visualisering av nervceller för en mängd encellig upplösning elektrofysiologi eller bildframställning tekniker.
Detta protokoll kräver användning av en vibratome skede eller plattform som kan lutas cirka 15°. Här använder vi en kommersiellt tillgänglig 2-bit magnetiska scenen där "scenen" är en metallskiva med en böjd botten placeras i en konkav magnetisk "scenbas." Scenen kan sedan skiftas för att justera segmentvinkeln. Koncentriska cirklar på scenbasen används för att uppskatta vinkeln reproducerbara. Scen- och scenbasen placeras i skivningskammaren, där även den magnetiska scenbasen kan roteras.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Experimental Preparations</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar, powder</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP1423500</td>
			<td>4% agar block used to stabilize brain tissue during vibratome sectioning</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AlexaFluor Hydrazide 488</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A10436</td>
			<td>Fluorophore used in internal solution to confirm successful MOC neuron patch</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Analytical Balance</td>
			<td>Geneses Scientific (Intramalls)</td>
			<td>AV114</td>
			<td>Weighing chemicals</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Double edged razor blade</td>
			<td>Ted Pella</td>
			<td>121-6</td>
			<td>Vibratome cutting blade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kynurenic acid (5g)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>K3375-5G</td>
			<td>Slicing ACSF additive used to reduce neuron activity during dissection and slicing in order to improve tissue health for patch clamping</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH Meter</td>
			<td>Fisher Scientific (Intramalls)</td>
			<td>13-620-451</td>
			<td>Solution pH tester</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic petri dishes 100mm dia X 20mm</td>
			<td>Fisher Scientific (Intramalls)</td>
			<td>12-556-002</td>
			<td>4% Agar Prep</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stirring Hotplate</td>
			<td>Fisher Scientific (Intramalls)</td>
			<td>11-500-150</td>
			<td>Heating for 4% Agar preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissection and Slicing</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biocytin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>B4261-250MG</td>
			<td>Chemical used for axonal tracing (conjugated to Streptavidin 488)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting Microscope</td>
			<td>Amscope</td>
			<td>SM-1BN</td>
			<td>For precision dissection during brain removal</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #5 Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11252-20</td>
			<td>Fine forceps dissection tool</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Economy tweezers #3</td>
			<td>WPI</td>
			<td>501976</td>
			<td>Forceps dissection tool</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Petri Dish 150mm dia x 15mm H</td>
			<td>Fisher Scientific (Intramalls)</td>
			<td>08-747E</td>
			<td>Dissection dish</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Interface paper (203 X 254mm PCTE Membrane 10um)</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td>1220823</td>
			<td>Slice incubation/biocytin application</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica VT1200S Vibratome</td>
			<td>Leica</td>
			<td>1491200S001</td>
			<td>Vibratome for wedge slice sectioning</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mayo scissors</td>
			<td>Roboz</td>
			<td>RS-6872</td>
			<td>Dissection tool</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Single-edged carbon steel blades</td>
			<td>Fisher Scientific (Intramalls)</td>
			<td>12-640</td>
			<td>Razor blade for dissection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Specimen disc, orienting</td>
			<td>Leica</td>
			<td>14048142068</td>
			<td>Specialized vibratome stage for reproducible tilting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spoonula</td>
			<td>FisherSci</td>
			<td>14-375-10</td>
			<td>Dissection tool</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Super Glue</td>
			<td>Newegg</td>
			<td>15187</td>
			<td>Used for glueing tissue to vibratome stage</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vannas Spring Scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>91500-09</td>
			<td>Dissection tool</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electrophysiology</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>A1R Upright Confocal Microscope</td>
			<td>Nikon Instruments</td>
			<td></td>
			<td>Electrophysiology and imaging microscope, can be any microscope compatible with electrophysiology</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electrode Borosilicate glass w/ Filament OD 1.5mm, ID 1.1mm, 10 cm long</td>
			<td>Sutter Instrument</td>
			<td>BF150-110-10</td>
			<td>Patch clamping pipette glass</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electrode Filler MicroFil</td>
			<td>WPI</td>
			<td>CMF20G</td>
			<td>Patch electrode pipette filler</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>In-line solution heater</td>
			<td>Warner Instruments (GSAdvantage)</td>
			<td>SH-27B</td>
			<td>Slice perfusion system heater</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multi-Micromanipulator Systems</td>
			<td>Sutter Intruments</td>
			<td>MPC-200 with MP285</td>
			<td>Micromanipulators for patch clamp and stimulation electrode placement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P-1000 horizontal pipette puller for glass micropipettes</td>
			<td>Sutter instruments</td>
			<td>FG-P1000</td>
			<td>Patch clamp pipetter puller</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Patch-clamp amplifier and Software</td>
			<td>HEKA</td>
			<td>EPC-10 / Patchmaster Next</td>
			<td>Can be any amplifier/software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recording Chamber</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>RC26G</td>
			<td>Slice &#34;bath&#34; during recording</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recording Chamber Harp</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>640253</td>
			<td>Stablizes slice during electrophysiology recording</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slice Incubation Chamber</td>
			<td>Custom Build</td>
			<td></td>
			<td>Heated, oxygenated holding chamber for slices during recovery after slicing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stimulus isolation unit</td>
			<td>A.M.P.I.</td>
			<td>Iso-Flex</td>
			<td>Stimulus isolation unit for electrophysiology</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe 60CC</td>
			<td>Fischer Scientific (Intramalls)</td>
			<td>14-820-11</td>
			<td>Electrophysiology perfusion fluid handling</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Temperature controller</td>
			<td>Warner Instruments (GSAdvantage)</td>
			<td>TC-324C</td>
			<td>Slice perfusion system temperature controller</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tubing 1/8 OD 1/16 ID</td>
			<td>Fischer Scientific (Intramalls)</td>
			<td>14-171-129</td>
			<td>Electrophysiology perfusion fluid handling</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tugsten concentric bipolar microelectrode</td>
			<td>WPI</td>
			<td>TM33CCINS</td>
			<td>Stimulating electrode for electrophysiology</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Histology</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24 well Plate</td>
			<td>Fisher Scientific (Intramalls)</td>
			<td>12-556006</td>
			<td>Histology slice collection and immunostaining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 Streptavidin</td>
			<td>Jackson Immuno labs</td>
			<td>016-540-084</td>
			<td>Secondary antibody for biocytin visualization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning Orbital Shaker</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>CLS6780FP</td>
			<td>Shaker for immunohistochemistry agitation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cresyl Violet Acetate</td>
			<td>Sigma Aldrich (Intramalls)</td>
			<td>C5042-10G</td>
			<td>Cellular stain for histology</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable Microtome Blades</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>22-210-052</td>
			<td>Sliding microtome blade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter-syringe Nalgene 4mm Cellulose Acetate 0.2um</td>
			<td>Fisher Scientific (Intramalls)</td>
			<td>09-740-34A</td>
			<td>Syringe filter for filling recording pipettes with internal solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluoromount-G Slide Mounting Medium</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>OB100-01</td>
			<td>Immunohistochemistry fluorescence mounting medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glass slide staining dish with rack</td>
			<td>Fisher Scientific (Intramalls)</td>
			<td>08-812</td>
			<td>Cresyl Violet staining chamber</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microm HM450 Sliding Microtome</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>910020</td>
			<td>Freezing microtome for histology</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Cover Glasses: Rectangles 50mm X 24mm</td>
			<td>Fisher Scientific (Intramalls)</td>
			<td>12-543D</td>
			<td>Histochemistry slide cover glass</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Permount mounting medium</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>SP15-100</td>
			<td>Cresyl violet section mounting medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superfrost Slides</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>22-034980</td>
			<td>Histology slides</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vitro wedge slice preparation for mimicking in vivo neuronal circuit connectivity

In vitro-skiva elektrofysiologi tekniker mäta encellig aktivitet med exakt elektriska och tidsmässiga upplösning. Hjärnan skivor måste vara relativt tunn för att korrekt visualisera och tillgång nervceller för patch-fastspänning eller bildbehandling, och in vitro-undersökning av hjärnan kretsar är begränsad till endast vad som är fysiskt närvarande i den akuta skiva. För att bibehålla fördelarna med in vitro-skiva experiment samtidigt som en större del av presynaptiska kärnor, utvecklade vi en ny skiva beredning. Denna "kil skiva" var avsedd för patch-clamp elektrofysiologi inspelningar för att karakterisera olika monaural, ljud-driven ingångar till mediala olivocochlear (MOC) nervceller i hjärnstammen. Dessa nervceller får sin primära afferent excitatoriska och hämmande ingångar från nervceller aktiveras av stimuli i kontralateral örat och motsvarande cochlear kärnan (CN). En asymmetrisk hjärnan skiva utformades som är tjockaste i rostro-caudal domänen vid den laterala kanten av en halvklotet och sedan tunnar mot den laterala kanten av den motsatta halvklotet. Denna skiva innehåller, på den tjocka sidan, den auditiva nervrot förmedla information om auditiva stimuli till hjärnan, den inneboende CN kretsar, och både disynaptic excitatoriska och trisynaptiska hämmande afferenta vägar som konvergerar på kontralaterala MOC nervceller. Inspelning utförs från MOC nervceller på den tunna sidan av skivan, där de visualiseras med hjälp av DIC optik för typiska patch-clamp experiment. Direkt stimulering av hörselnerven utförs när den kommer in i hörselhjärnstammen, vilket möjliggör inneboende CN-kretsaktivitet och synaptisk plasticitet att ske vid synapser uppströms MOC nervceller. Med denna teknik kan man härma in vivo kretsaktivering så nära som möjligt inom segmentet. Denna kil skiva beredning är tillämplig på andra hjärnkretsar där kretsanalyser skulle dra nytta av bevarande av uppströms anslutning och långväga ingångar, i kombination med de tekniska fördelarna med in vitro-skiva fysiologi.

Histologisk undersökning av kilskiva För vår undersökning av auditiva hjärnstammen neuron funktion, kil slice beredningen var utformad för att innehålla hörselnerven rot och CN kontralateral till MOC nervceller riktade för inspelningar (exempel skiva visas i figur 1B). Inledande histologisk undersökning av preparatet är viktigt att bekräfta att skiva innehåller de kärnor som är nödvändiga för kretsaktivering och att axonalprojektioner är intakta. Två c...

Watch this Scientific Journal Video about In Vitro Wedge Slice Preparation for Mimicking In Vivo Neuronal Circuit Connectivity at JoVE.com

In Vitro Wedge Slice Preparation for Mimicking In Vivo Neuronal Circuit Connectivity

Integration av olika synaptiska ingångar till nervceller mäts bäst i en beredning som bevarar alla pre-synaptiska kärnor för naturlig timing och krets plasticitet, men hjärnan skivor vanligtvis bryta många anslutningar. Vi utvecklade en modifierad hjärna skiva för att efterlikna in vivo krets verksamhet samtidigt som in vitro experimentförmåga.

In Vitro Wedge Slice Förberedelse för Härma In Vivo Neuronal Circuit Connectivity

In vitro slice electrophysiology techniques measure single-cell activity with precise electrical and temporal resolution. Brain slices must be relatively ...

Hjärnan skiva experiment tillåta förhör av neuronal funktion med hög elektrisk och tidsmässig upplösning, men dessa skivor vanligtvis bryta många presynaptic anslutningar. En kilformad skiva upprätthåller en mer intakt presynaptiska kretsar. Denna modifierade hjärnan skiva upprätthåller en mer komplett in vivo-liknande neuronal krets samtidigt som fördelarna med in vitro-experiment, såsom visuellt guidade patch clamp inspelningar, farmakologi, och aktivitet bildbehandling.Exakt kil skivad geometri kan uppskattas baserat på atlas platser av nervceller inom kretsen, men integriteten hos presynaptiska schemata och axoner bör bestämmas med hjälp av histologi. Börja med att använda ett rakblad för att skära huden vid mittlinjen av skallen från näsan till baksidan av halsen. Skala tillbaka huden för att exponera skallen och börjar vid basen av skallen och fortsätter mot näsan, använd små saxar för att göra ett snitt i skallen genom mittlinjen.Vid lambda sutur, gör nedskärningar i skallen från mittlinjen i laterled mot örat på båda sidor för att skala tillbaka skallen för att exponera hjärnan. Börjar vid rostral slutet, använd en liten lab spatel för att försiktigt lyfta hjärnan från skallen så att synnerverna att vara avskurna. Fortsätt att försiktigt arbeta hjärnan bakåt, utsätta den ventrala ytan och använda fina tång för att försiktigt nypa trigeminal nerver nära den ventrala ytan av hjärnstammen att skära dem.Placera preparatet i en petriskål av glas fylld med kall skivningslösning och placera skålen under ett dissekerande mikroskop. Trimma ansiktsnerverna nära hjärnstammen för att exponera nerverna i Vestibulocochlear. Använd fina tänjningar för att trycka in spetsarna i foramina där den vestibulocochlear nerven lämnar skallen så långt som möjligt.Nypa för att bryta nerverna på båda sidor, lämnar nervroten fäst vid hjärnstammen. Ta bort hjärnhinnorna och vasculaturen från hjärnstammens ventrala yta nära trapetskroppen. Sedan nypa de återstående kranialnerverna och bindväven för att frigöra hjärnan helt från skallen, var noga med att bevara den återstående ryggmärgen, om möjligt.För att förbereda ytan av hjärnan för fixtur till scenen placera hjärnan ventrala sidan upp och använda ett trubbigt verktyg för att försiktigt immobilisera ryggmärgen för att stabilisera hjärnvävnaden. Sätt in öppna tång i en cirka 20 graders vinkel genom hjärnan till botten av skålen så att spetsarna lämnar dorsala ytan av hjärnan caudal till optik chiasm och använda ett rakblad för att skära längs tång. Därefter förbereder en en kubikcentimeter block på 4%agar och sprida en liten droppe lim i en rektangel på scenen.Använd forceps för att försiktigt lyfta hjärnan och försiktigt badda överflödig vätska med kanten av en pappershandduk. Placera sedan den blockerade ytan på limmet så att den ventrala ytan kommer att vara vänd mot bladets riktning under skivning och tryck agarblocket försiktigt mot ryggytan som stöd. Att förvärva kilskivor med cochlear nerv rot på den tjocka sidan och den mediala olivocochlear nervceller och den mediala kärnan i trapetsoid kroppen på den tunna sidan, placera den magnetiska skivan med den bifogade hjärnan på scenen innehavaren och placera innehavaren i skivningskammaren av en vibratom med den ventrala ytan av hjärnan orienterad mot bladet.Fyll kammaren med iskall skivningslösning och sänk bladet i karbiogenbubbade lösningen. Skär skivor caudal till regionen av intresse för att se till att skivorna är symmetriska. För sedan stadiet cirka 15 grader åt ena sidan.Fortsätt skära försiktigt tills hörselnerven roten är nära ytan på ena sidan och ansiktsnerven kan ses vid ytan av den andra sidan av skivan. Förskjut scenen 15 grader tillbaka till ursprungsläget och flytta bladet bort från vävnaden. Snurra på scenbasen 90 grader så att den tunna sidans sidokant är vänd mot bladet och sänker bladet flera hundra mikron innan du långsamt för bladet nära vävnadens kant.Med bladet indraget sänks bladet något till önskad tjocklek av den tunna kanten av skivan. Flytta bladet tillbaka från vävnaden och snurra scenen basen tillbaka så att den ventrala ytan är vänd mot scenen bas. Gör ett snitt för att beteckna den rostrala ytan av kilskivan och överför skiva till en en kvadratcentimeter bit gränssnitt papper caudle yta ner.Ansiktsnerven ska vara synlig på båda halvkloten av skivan på rostral yta. Flytta sedan skivan till en 35 grader Celsius inkubation kammare för att återhämta sig i 30 minuter. För att ställa in kilskivan för elektrofysiologi analys placera provet i en inspelningskammare som kontinuerligt perfunderas med 35 grader Celsius ACSF och stabilisera skivan.Med hjälp av DIC optik, fokusera på hörselnerven rot på den tjocka sidan av skivan och använda en micromanipulator för att flytta den bipolär volfram stimulerande elektrod till hörselnerven rot och försiktigt in i ytan av vävnaden. Flytta synfältet till den ventrala kärnan i trapetsoidkroppen på den tunna sidan och välj en medial olivocochlear neuron som mål för patch clamp elektrofysiologi under epifluorescens med hjälp av en 561 nanometer utsläppsfilter. Fyll en inspelning pipett med lämplig intern lösning för det föreslagna experimentet och under DIC optik patch och spela in från den mediala olivocochlear neuron i hela cellen konfiguration.Justera den elektriska stimulering amplituden av hörselnerven roten för att få konsekventa postynaptic händelser i den mediala olivocochlear neuron. Sedan köra lämpliga stimulering protokoll att observera framkallat synaptic strömmar i mediala olivocochlear nervceller. Denna kil skiva beredning är utformad för att innehålla hörselnerven rot och cochlear kärnan kontralateral till den mediala olivocochlear nervceller riktade för inspelningar.I denna cresyl violett färgade resektionerade kil skiva cochlear kärnan är närvarande i nästan sin fulla rostral-caudal omfattning. Och hörselnerven roten observeras in i cochlear kärnan. Dessutom innehåller kilskivan nervceller av den mediala kärnan i den trapetsoidkroppen ipsilateral till de mediala olivocochlear nervceller från vilka inspelningar utförs.För att bekräfta neuronala anslutning inom en kil skiva presynaptic ingångar stimuleras på två sätt. Först är ventrala akustiska stria vid mittlinjen elektriskt stimuleras, aktivera T-stellate axons direkt och den mediala kärnan i trapetsoid kroppen nervceller via klotformiga buskiga cell axon stimulering och resulterar i postynaptic strömmar som mäts vid den mediala olivocochlear neuron. Hörselnerven roten stimuleras sedan att aktivera hela monaural stigande hjärnstammen kretsar och att framkalla postynaptic svar.Jämförelse av instövning latens åtgärder av den första postynaptic ström framkallat med direkt stimulering av ventrala akustiska stria med de framkallat med auditiva nerv stimulering avslöjar en betydligt längre latens i den auditiva nerv stimulering händelse, vägledande för synaptiska dröjsmål som följer av den ytterligare cochlear nucleus synapse aktiveras under auditiva nerv stimulering. Användningen av anatomiska landmärken och noggrann manövrering av den magnetiska skivan scenen är kritiska för att skapa kil skivor med intakt neuronal kretsar och pålitliga framkallat post synaptic svar. Denna skivningsteknik ger en plattform för att använda ytterligare in vitro elektrofysiologi verktyg inklusive kalcium eller spänning imaging, optogenetik, signalsubstans uncaging, och både intracellulära och extracellulära farmakologi.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

The Organotypic Hippocampal Slice Culture Model for Examining Neuronal Injury

Den Organotypic hippocampus Slice Kultur Modell för prövningen Neuronal skada

Organotypic hippocampal slice culture is an in vitro method to examine mechanisms of neuronal injury in which the basic architecture and composition of ...

Organotypic Slice Cultures of Embryonic Ventral Midbrain: A System to Study Dopaminergic Neuronal Development in vitro

Organotypic Slice Cultures of Embryonic Ventral Midbrain: A System to Study Dopaminergic Neuronal Development in vitro

Organotypic Slice kulturer av embryonala på magen mitthjärnan: Ett system att studera Dopaminerga nervsystemets utveckling In vitro</em

The  mouse is an excellent model organism to study mammalian brain development due  to the abundance of molecular and genetic data. However, the ...

Functional Neuroimaging Using Ultrasonic Blood-brain Barrier Disruption and Manganese-enhanced MRI

Funktionell hjärnavbildning med ultraljud Blod-hjärnbarriären störningar och mangan-förstärkt MRT

Although mice are the dominant model system for studying the genetic and molecular underpinnings of neuroscience, functional neuroimaging in mice remains ...

Dual Electrophysiological Recordings of Synaptically-evoked Astroglial and Neuronal Responses in Acute Hippocampal Slices

Dubbla Elektrofysiologiska Inspelningar av synaptiskt-framkallade astrogliala och neuronala svar i akut hippocampus skivor

Astrocytes form together with neurons tripartite synapses, where they integrate and modulate neuronal activity. Indeed, astrocytes sense neuronal inputs ...

In vivo Neuronal Calcium Imaging in C. elegans

In vivo Neuronal Calcium Imaging in C. elegans

In vivo Neuronal kalcium Imaging i C. elegans

The nematode worm C. elegans is an ideal model organism  for relatively simple, low cost neuronal imaging in vivo. Its small transparent body and simple, ...

Fast Micro-iontophoresis of Glutamate and GABA: A Useful Tool to Investigate Synaptic Integration

Snabb Micro-iontophoresis av glutamat och GABA: Ett användbart verktyg för att undersöka Synaptic Integration

One of the fundamental interests in neuroscience is to understand the integration of excitatory and inhibitory inputs along the very complex structure of ...

Genetic Manipulation of Cerebellar Granule Neurons In Vitro and In Vivo to Study Neuronal Morphology and Migration

Genetic Manipulation of Cerebellar Granule Neurons In Vitro and In Vivo to Study Neuronal Morphology and Migration

Genetic Manipulation av Cerebellar granulneuroner<em&gt; In Vitro</em&gt; Och<em&gt; In Vivo</em&gt; Att studera neuronal morfologi och migration

Developmental events in the brain including neuronal morphogenesis and migration are highly orchestrated processes. In vitro and in vivo analyses allow ...

Brain Slice Biotinylation: An Ex Vivo Approach to Measure Region-specific Plasma Membrane Protein Trafficking in Adult Neurons

Brain Slice Biotinylation: An Ex Vivo Approach to Measure Region-specific Plasma Membrane Protein Trafficking in Adult Neurons

Brain Slice Biotinylering: An<em&gt; Ex vivo</em&gt; Metoden att mäta Region specifika Plasma membranprotein handel med vuxna nervceller

Regulated endocytic trafficking is the central mechanism facilitating a variety of neuromodulatory events, by dynamically controlling receptor, ion ...

Inducing Plasticity of Astrocytic Receptors by Manipulation of Neuronal Firing Rates

Induktion Plasticitet hos astrocytiska Receptorer genom manipulering av neuron priser

Close to two decades of research has established that astrocytes in situ and in vivo express numerous G protein-coupled receptors (GPCRs) that can be ...

In Utero Electroporation Approaches to Study the Excitability of Neuronal Subpopulations and Single-cell Connectivity

In Utero Electroporation Approaches to Study the Excitability of Neuronal Subpopulations and Single-cell Connectivity

I livmodern elektroporering Approaches att studera retbarhet av neuronala Subpopulationer och encelliga Connectivity

The nervous system is composed of an enormous range of distinct neuronal types. These neuronal subpopulations are characterized by, among other features, ...