Name: in vitro wedge slice preparation for mimicking in vivo neuronal circuit connectivity
Uploaded: 2020-08-18T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about In Vitro Wedge Slice Preparation for Mimicking In Vivo Neuronal Circuit Connectivity at JoVE.com

Bu araştırma NIH, NIDCD, Z01 DC000091 (CJCW) Intramural Araştırma Programı tarafından desteklenmiştir.

Tüm deneysel prosedürler Ulusal Nörolojik Bozukluklar Enstitüsü ve İnme/Ulusal Sağırlık ve Diğer İletişim Bozuklukları Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi Tarafından onaylandı.
1. Deneysel preparatlar
NOT: Dilimleme çözeltisi, dilimleme sıcaklığı, dilim kuluçka sıcaklığı ve aparatlar (vb.) dahil olmak üzere dilim hazırlama ile ilgili ayrıntılar bu deneyde yapılan beyin sapı hazırlığı için özeldir. Dilim kuluçka detayları laborat...

Burada bir kama dilimi olarak tanımlanan dilimleme prosedürü bozulmamış presinaptik nöronal devre korumak için güçlü, ancak nöronal fonksiyonun analizi için beyin dilimi deney erişilebilirliği ile. Devre analizine hazırlık kullanımını en üst düzeye çıkarmak için birkaç ilk adımda büyük özen gerekir. Kamanın boyutları, hem presinaptik çekirdeklerin hem de aksonal projeksiyonlarının hazırlanan kama dilimi içinde yer aldığını doğrulamak için integral olan histolojik inceleme kullan?...

Nöral devrelerin aktivitesinin gözlemi ideal olarak doğal duyusal girişler ve geri bildirimler ile gerçekleştirilir, ve beyin bölgeleri arasında sağlam bağlantı, in vivo. Ancak, nöral devre fonksiyonunun tek hücreli çözünürlüğü veren deneylerin gerçekleştirilmesi, bozulmamış beyindeki teknik zorluklarla sınırlıdır. In vivo hücre dışı elektrofizyoloji veya multifoton görüntüleme yöntemleri bozulmamış sinir sistemlerindeki aktiviteyi araştırmak için kullanılabilirken, farklı girdilerin nasıl entegre olduğunu yorumlamak veya eşik altı sinaptik girdileri ölçmek zor olmaya devam etmektedir. In vivo bütün hücre kayıtları bu sınırlamaların üstesinden gelmek ama gerçekleştirmek için zor, kolayca erişilebilen beyin bölgelerinde bile. Tek hücreli çözümlü deneylerin teknik zorlukları, beynin derinliklerinde bulunan bazı nöron popülasyonlarında veya canlı hücreleri bulmak için genetik araçlar gerektiren mekansal olarak dağınık popülasyonlarda (örn. optrode kaydı yla eşleştirilmiş kanaloidofinin genetik ekspresyonu) veya site etiketlemesinden sonra post-hoc histokimyasal tanımlamada (örn. nörotransmisyona özgü belirteçlerle) daha da artırılır. Beyin sapı ventral yüzeyine yakın diffüz bulunan olmak, medial olivocochlear (MOC) nöronlar yukarıdaki sınırlamalar muzdarip1, onları in vivo deney için erişim son derece zor hale.
Beyin dilimleri (~ 100-500 μm kalınlığı) uzun beyin devreleri çalışmak için kullanılmıştır, işitsel beyin sapı devredahil, aynı dilim içinde bulunan bağlı nöronların fiziksel ayrımı nedeniyle2,3,4,5,6,7,8,9. Çok daha kalın dilimler (>1 mm) kullanarak deneyler, ikili girdilerin medial superior zeytin10,11dahil olmak üzere üstün olivary kompleksi (SOC) alanlarında nasıl entegre olduğunu anlamak için diğer laboratuvarlarda kullanılmıştır. Bu dilimler, işitsel sinirin aksonlari (AN) dilim içinde bozulmadan kaldı ve cn sinaptik nörotransmitter salınımını başlatmak için elektriksel olarak uyarıldı, ilk derecede işitsel nöronların aktivitesini taklit olarak sese tepki verecekti. Bu kalın dilimlerin en büyük dezavantajlarından biri yama-kelepçe elektrofizyolojik kayıtlar ("yama") için nöronların görünürlüğüdür. Bu alanda çok sayıda akson yaş 12 ile miyelinated hale olarak Patching giderek daha zor halegelir13,14,15, doku optik yoğun hale ve tipik bir, ince beyin dilimi bile nöronlar gizleme. Amacımız in vivo kayıtların devre bağlantısına daha çok benzeyen, ancak beyin dilimlerinde görsel güdümlü yama-kelepçe elektrofizyolojisinin yüksek verim ve yüksek çözünürlüklü kayıt yetenekleriyle in vitro preparatlar oluşturmaktır.
Laboratuvarımız, MOC nöronları da dahil olmak üzere işitsel efferent sistemin nöronların fizyolojisini araştırır. Bu kolinerjik nöronlar dış saç hücrelerinin aktivitesini modüle ederek koklea efferent geribildirim sağlamak (OHCs)16,17,18,19,20. Önceki çalışmalar da bu modülasyon koklea21,22,23,24,25,26 ve akustik travma27,28,29,30,31,32,33de kazanım kontrolü bir rol oynadığını göstermiştir . Farelerde, MOC nöronlar diffüz yamuk vücudun ventral çekirdeğinde yer almaktadır (VNTB) işitsel beyin sapı1. Grubumuz epifloresan aydınlatma altında beyin sapı dilimleri MOC nöronlar hedef tdTomato muhabiri fare hattı ile geçti ChAT-IRES-Cre fare hattı kullanmıştır. Biz MOC nöronlar trapez vücudun ipsilateral medial çekirdeğinden afferent inhibitör girdi almak gösterdi (MNTB), hangi heyecanlı, sırayla, küresel gür hücrelerden akson tarafından (GBC) kontralateral koklear çekirdeği (CN)34,35,36,37,38. Ayrıca, MOC nöronlar büyük olasılıkla kontralateral CN39,40,41T-stellat hücrelerinden uyarıcı giriş alırsınız. Birlikte ele alındığında, bu çalışmalar MOC nöronlar aynı (kontralateral) kulak tan türetilen hem uyarıcı ve inhibitör girdileri almak göstermektedir. Ancak, presinaptik nöronlar, ve MOC nöronlar üzerinde yakınsama aksonları, oldukça tipik bir koronal dilim hazırlanmasında tam olarak bozulmamış olması için birbirlerine yeterince yakın değildir. Sinaptik girdilerin MOC nöronlarına entegrasyonunun eylem potansiyeli ateşleme kalıplarını nasıl etkilediğini araştırmak için, yeni tanımlanan inhibisyona odaklanarak, bir kulaktan MOC nöronlarına kadar olan çeşitli afferentleri fizyolojik olarak en gerçekçi şekilde uyarabileceğimiz, ancak in vitro beyin dilimi deneylerinin teknik yararları ile birlikte bir hazırlık geliştirdik.
Kama dilimi, MOC nöronlarında devre entegrasyonunun araştırılması için tasarlanmış değiştirilmiş kalın bir dilim hazırlığıdır (Şekil 1A'daşematize). Dilimin kalın tarafında, kama işitsel sinir kopmuş aksonlar içerir (bundan sonra "işitsel sinir kökü" olarak adlandırılır) onlar CN çevre ve sinaps gelen beyin sapı girerken. İşitsel sinir kökü elektriksel nörotransmitter salınımı ve tamamen bozulmamış CN hücrelerinin sinaptik aktivasyon uyandırmak için uyarılmış olabilir42,43,44,45,46. Bu stimülasyon biçimi devre analizi için çeşitli faydaları vardır. İlk olarak, MOC nöronlarına afferent girdi sağlayan T-stellat ve GBC aksonları doğrudan uyarmak yerine, CN'de bol miktarda bulunan içsel devrelerin aktivasyonuna izin vermek için AN'yi uyarıyoruz. Bu devreler beyin boyunca hedeflerine CN nöronların çıkış modüle, MOC nöronlar dahil46,47,48,49,50,51. İkinci olarak, AN'den MOC nöronlarının CN upstream'ine kadar olan afferent devrelerin polisinetik aktivasyonu, işitsel stimülasyon sırasında in vivo olduğu gibi daha doğal aktivasyon zamanlaması na ve plastisitenin bu sinapslarda oluşmasına olanak sağlar. Üçüncü olarak, an aktivitesini taklit etmek için stimülasyon kalıplarımızı değiştirebiliriz. Son olarak, MOC nöronlar için hem uyarıcı ve inhibitör monaural projeksiyonlar kama dilim bozulmamış, ve bunların entegrasyonu yama-kelepçe elektrofizyoloji hassasiyeti ile bir MOC nöron ölçülebilir. Bir bütün olarak, bu aktivasyon şeması tipik bir beyin dilimi hazırlık ile karşılaştırıldığında MOC nöronlar için daha sağlam bir devre sağlar. Bu beyin sapı kama dilimi de lateral superior zeytin, üstün oliyum çekirdeği ve medial üstün zeytin10, 11,52,53,54,55,56dahil olmak üzere ipsilateral MNTB inhibitör girdi almak diğer işitsel alanları araştırmak için kullanılabilir. Bizim özel hazırlık ötesinde, bu dilimleme yöntemi kullanılabilir veya uzun menzilli girdilerin bağlantı bakımı ve tek hücreli çözünürlükte elektrofizyoloji veya görüntüleme teknikleri çeşitli nöronların görselleştirme iyileştirilmesi yararları ile diğer sistemleri değerlendirmek için değiştirilebilir.
Bu protokol yaklaşık 15 ° yatırılabilir bir vibratom sahne veya platform kullanımını gerektirir. Burada "sahne" bir içbükey manyetik "sahne tabanı yerleştirilir kavisli bir alt ile metal bir disk olduğu bir ticari olarak kullanılabilir 2 parçalı manyetik sahne kullanın." Daha sonra dilim açısını ayarlamak için aşama kaydırılabilir. Sahne tabanındaki eşmerkezli daireler açıyı tekrarlı olarak tahmin etmek için kullanılır. Sahne ve sahne tabanı dilimleme odasına yerleştirilir, burada manyetik sahne tabanı da döndürülebilir.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Experimental Preparations</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar, powder</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP1423500</td>
			<td>4% agar block used to stabilize brain tissue during vibratome sectioning</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AlexaFluor Hydrazide 488</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A10436</td>
			<td>Fluorophore used in internal solution to confirm successful MOC neuron patch</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Analytical Balance</td>
			<td>Geneses Scientific (Intramalls)</td>
			<td>AV114</td>
			<td>Weighing chemicals</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Double edged razor blade</td>
			<td>Ted Pella</td>
			<td>121-6</td>
			<td>Vibratome cutting blade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kynurenic acid (5g)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>K3375-5G</td>
			<td>Slicing ACSF additive used to reduce neuron activity during dissection and slicing in order to improve tissue health for patch clamping</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH Meter</td>
			<td>Fisher Scientific (Intramalls)</td>
			<td>13-620-451</td>
			<td>Solution pH tester</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic petri dishes 100mm dia X 20mm</td>
			<td>Fisher Scientific (Intramalls)</td>
			<td>12-556-002</td>
			<td>4% Agar Prep</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stirring Hotplate</td>
			<td>Fisher Scientific (Intramalls)</td>
			<td>11-500-150</td>
			<td>Heating for 4% Agar preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissection and Slicing</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biocytin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>B4261-250MG</td>
			<td>Chemical used for axonal tracing (conjugated to Streptavidin 488)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting Microscope</td>
			<td>Amscope</td>
			<td>SM-1BN</td>
			<td>For precision dissection during brain removal</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #5 Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11252-20</td>
			<td>Fine forceps dissection tool</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Economy tweezers #3</td>
			<td>WPI</td>
			<td>501976</td>
			<td>Forceps dissection tool</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Petri Dish 150mm dia x 15mm H</td>
			<td>Fisher Scientific (Intramalls)</td>
			<td>08-747E</td>
			<td>Dissection dish</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Interface paper (203 X 254mm PCTE Membrane 10um)</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td>1220823</td>
			<td>Slice incubation/biocytin application</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica VT1200S Vibratome</td>
			<td>Leica</td>
			<td>1491200S001</td>
			<td>Vibratome for wedge slice sectioning</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mayo scissors</td>
			<td>Roboz</td>
			<td>RS-6872</td>
			<td>Dissection tool</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Single-edged carbon steel blades</td>
			<td>Fisher Scientific (Intramalls)</td>
			<td>12-640</td>
			<td>Razor blade for dissection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Specimen disc, orienting</td>
			<td>Leica</td>
			<td>14048142068</td>
			<td>Specialized vibratome stage for reproducible tilting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spoonula</td>
			<td>FisherSci</td>
			<td>14-375-10</td>
			<td>Dissection tool</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Super Glue</td>
			<td>Newegg</td>
			<td>15187</td>
			<td>Used for glueing tissue to vibratome stage</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vannas Spring Scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>91500-09</td>
			<td>Dissection tool</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electrophysiology</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>A1R Upright Confocal Microscope</td>
			<td>Nikon Instruments</td>
			<td></td>
			<td>Electrophysiology and imaging microscope, can be any microscope compatible with electrophysiology</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electrode Borosilicate glass w/ Filament OD 1.5mm, ID 1.1mm, 10 cm long</td>
			<td>Sutter Instrument</td>
			<td>BF150-110-10</td>
			<td>Patch clamping pipette glass</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electrode Filler MicroFil</td>
			<td>WPI</td>
			<td>CMF20G</td>
			<td>Patch electrode pipette filler</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>In-line solution heater</td>
			<td>Warner Instruments (GSAdvantage)</td>
			<td>SH-27B</td>
			<td>Slice perfusion system heater</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multi-Micromanipulator Systems</td>
			<td>Sutter Intruments</td>
			<td>MPC-200 with MP285</td>
			<td>Micromanipulators for patch clamp and stimulation electrode placement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P-1000 horizontal pipette puller for glass micropipettes</td>
			<td>Sutter instruments</td>
			<td>FG-P1000</td>
			<td>Patch clamp pipetter puller</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Patch-clamp amplifier and Software</td>
			<td>HEKA</td>
			<td>EPC-10 / Patchmaster Next</td>
			<td>Can be any amplifier/software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recording Chamber</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>RC26G</td>
			<td>Slice &#34;bath&#34; during recording</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recording Chamber Harp</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>640253</td>
			<td>Stablizes slice during electrophysiology recording</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slice Incubation Chamber</td>
			<td>Custom Build</td>
			<td></td>
			<td>Heated, oxygenated holding chamber for slices during recovery after slicing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stimulus isolation unit</td>
			<td>A.M.P.I.</td>
			<td>Iso-Flex</td>
			<td>Stimulus isolation unit for electrophysiology</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe 60CC</td>
			<td>Fischer Scientific (Intramalls)</td>
			<td>14-820-11</td>
			<td>Electrophysiology perfusion fluid handling</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Temperature controller</td>
			<td>Warner Instruments (GSAdvantage)</td>
			<td>TC-324C</td>
			<td>Slice perfusion system temperature controller</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tubing 1/8 OD 1/16 ID</td>
			<td>Fischer Scientific (Intramalls)</td>
			<td>14-171-129</td>
			<td>Electrophysiology perfusion fluid handling</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tugsten concentric bipolar microelectrode</td>
			<td>WPI</td>
			<td>TM33CCINS</td>
			<td>Stimulating electrode for electrophysiology</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Histology</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24 well Plate</td>
			<td>Fisher Scientific (Intramalls)</td>
			<td>12-556006</td>
			<td>Histology slice collection and immunostaining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 Streptavidin</td>
			<td>Jackson Immuno labs</td>
			<td>016-540-084</td>
			<td>Secondary antibody for biocytin visualization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning Orbital Shaker</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>CLS6780FP</td>
			<td>Shaker for immunohistochemistry agitation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cresyl Violet Acetate</td>
			<td>Sigma Aldrich (Intramalls)</td>
			<td>C5042-10G</td>
			<td>Cellular stain for histology</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable Microtome Blades</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>22-210-052</td>
			<td>Sliding microtome blade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter-syringe Nalgene 4mm Cellulose Acetate 0.2um</td>
			<td>Fisher Scientific (Intramalls)</td>
			<td>09-740-34A</td>
			<td>Syringe filter for filling recording pipettes with internal solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluoromount-G Slide Mounting Medium</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>OB100-01</td>
			<td>Immunohistochemistry fluorescence mounting medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glass slide staining dish with rack</td>
			<td>Fisher Scientific (Intramalls)</td>
			<td>08-812</td>
			<td>Cresyl Violet staining chamber</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microm HM450 Sliding Microtome</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>910020</td>
			<td>Freezing microtome for histology</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Cover Glasses: Rectangles 50mm X 24mm</td>
			<td>Fisher Scientific (Intramalls)</td>
			<td>12-543D</td>
			<td>Histochemistry slide cover glass</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Permount mounting medium</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>SP15-100</td>
			<td>Cresyl violet section mounting medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superfrost Slides</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>22-034980</td>
			<td>Histology slides</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vitro wedge slice preparation for mimicking in vivo neuronal circuit connectivity

In vitro dilim elektrofizyoloji teknikleri hassas elektriksel ve zamansal çözünürlük ile tek hücreli aktiviteölçmek. Beyin dilimleri düzgün görselleştirmek ve yama-kelepçeleme veya görüntüleme için nöronlar erişmek için nispeten ince olmalıdır, ve beyin devrelerinin in vitro muayene sadece fiziksel olarak akut dilim mevcut ne sınırlıdır. Presinaptik çekirdeklerin daha büyük bir kısmını korurken in vitro dilim denemenin faydalarını korumak için yeni bir dilim hazırlığı geliştirdik. Bu "kama dilimi" beyin sapındaki medial olivocochlear (MOC) nöronlara çeşitli monaural, ses odaklı girdileri karakterize etmek için yama-kelepçe elektrofizyoloji kayıtları için tasarlanmıştır. Bu nöronlar kontralateral kulak ve buna karşılık gelen koklear çekirdek (CN) uyaranlarla aktive nöronlardan birincil afferent uyarıcı ve inhibitör girdileri alırsınız. Asimetrik bir beyin dilimi, bir yarımkürenin lateral kenarında ki rostro-kaudal etki alanında en kalın olan ve daha sonra karşı yarımkürenin lateral kenarına doğru incelen tasarlanmıştır. Bu dilim içerir, kalın tarafında, işitsel sinir kökü beyne işitsel uyaranlar hakkında bilgi iletiyor, içsel CN devre, ve hem disynaptic uyarıcı ve trisinaptik inhibitör arayolları kontralateral MOC nöronlar üzerinde yakınsama. Kayıt, dilimin ince tarafındaki MOC nöronlarından gerçekleştirilir ve burada tipik yama-kıskaç deneyleri için DIC optikleri kullanılarak görselleştirilir. İşitsel sinirin doğrudan uyarılması, işitsel beyin sapına girerken yapılır, içsel CN devre aktivitesi ve sinaptik plastisite için MOC nöronların sinapsupstream meydana izin. Bu teknikle in vivo devre aktivasyonunu dilim içinde mümkün olduğunca yakından taklit edebilirsiniz. Bu kama dilimi hazırlığı, devre analizlerinin in vitro dilim fizyolojisinin teknik avantajlarıyla birlikte yukarı akım bağlantısının ve uzun menzilli girdilerin korunmasından yararlanacağı diğer beyin devreleri için geçerlidir.

Kama diliminin histolojik incelemesi İşitsel beyin sapı nöron fonksiyonunun araştırılması için, kama dilimi hazırlığı, kayıtlar için hedeflenen MOC nöronların işitsel sinir kökü ve CN kontralateralini içerecek şekilde tasarlanmıştır (Şekil 1B'degösterilen örnek dilim). Preparatın ilk histolojik incelemesi, dilimin devre aktivasyonu için gerekli çekirdekleri içerdiğini ve aksonal projeksiyonların sağlam olduğunu doğrulamak için önemli...

Watch this Scientific Journal Video about In Vitro Wedge Slice Preparation for Mimicking In Vivo Neuronal Circuit Connectivity at JoVE.com

In Vitro Wedge Slice Preparation for Mimicking In Vivo Neuronal Circuit Connectivity

Nöronlar için çeşitli sinaptik girdilerin entegrasyonu en iyi doğal zamanlama ve devre plastisite için tüm pre-sinaptik çekirdekleri koruyan bir hazırlık ölçülür, ancak beyin dilimleri genellikle birçok bağlantıları sever. In vitro deney yeteneğini korurken in vivo devre aktivitesini taklit etmek için değiştirilmiş bir beyin dilimi geliştirdik.

In Vitro Kama Dilimi In Vivo Nöronal Devre Bağlantısı Nın TaklitI Için Hazırlık

In vitro slice electrophysiology techniques measure single-cell activity with precise electrical and temporal resolution. Brain slices must be relatively ...

Beyin dilimi deneyleri yüksek elektriksel ve zamansal çözünürlük ile nöronal fonksiyon sorgulama sağlar, ama bu dilimler genellikle birçok presinaptik bağlantıları sever. Kama şeklindeki bir dilim daha sağlam bir presinaptik devre korur. Bu modifiye beyin dilimi in vitro deney yararları sağlarken vivo benzeri nöronal devre daha eksiksiz korur, görsel güdümlü yama kıskaç kayıtları gibi, farmakoloji, ve aktivite görüntüleme.Doğru kama dilimlenmiş geometri devre içindeki nöronların atlas konumlarına göre tahmin edilebilir, ancak presinaptik şema ve aksonların bütünlüğü histoloji kullanılarak belirlenmelidir. Burundan boynun arkasına kadar kafatasının orta ucundaki deriyi kesmek için bir jilet kullanarak başlayın. Kafatası nı ortaya çıkarmak için ve kafatasının tabanından başlayıp buruna doğru devam etmek için derini geri soyun, orta hattan kafatasında bir kesi yapmak için küçük makas kullanın.Lambda sütür de, beyin ortaya çıkarmak için kafatası geri soymak için her iki tarafta kulak doğru yanal orta hattan kafatası nda kesikler yapmak. Rostral ucundan başlayarak, optik sinirlerin kesilmesine izin vermek için beyni kafatasından hafifçe kaldırmak için küçük bir laboratuvar spatulası kullanın. Yavaşça geriye doğru beyin çalışmaya devam, ventral yüzey açığa ve dikkatle onları kesmek için beyin sapı ventral yüzeye yakın trigeminal sinirleri çimdik için ince forceps kullanın.Soğuk dilimleme çözeltisi ile dolu bir cam Petri kabına preparat yerleştirin ve bir kesme mikroskobu altında çanak yerleştirin. Vestibulocochlear sinirleri ortaya çıkarmak için beyin sapına yakın yüz sinirleri kırpın. Vestibulocochlear sinir mümkün olduğunca kafatası çıkar foramina içine ipuçları itmek için ince forseps kullanın.Çimdik her iki tarafta sinirleri kesmek için, beyin sapı bağlı sinir kökü bırakarak. Menenjler ve yamuk vücut yakınındaki beyin sapı ventral yüzeyinden vaskülatür çıkarın. Sonra kalan kranial sinirler ve bağ dokusu kafatası tamamen beyin serbest bırakmak için çimdik, kalan omurilik korumak için özen, mümkünse.Sahne fikstür için beyin yüzeyini hazırlamak için beyin ventral tarafı kadar yerleştirin ve yavaşça beyin dokusu stabilize etmek için omurilik hareketsizleştirmek için künt bir araç kullanın. Uçları optik kiasm için beyin kaudal sırt yüzeyinden çıkmak ve forceps boyunca kesmek için bir jilet kullanın böylece çanak altına beyin yoluyla yaklaşık 20 derecelik bir açıyla açık forceps yerleştirin. Sonra, % 4 agar bir metreküp blok hazırlamak ve sahnede bir dikdörtgen içine tutkal küçük bir damla yayıldı.Dikkatle beyin kaldırmak ve nazikçe bir kağıt havlu kenarı ile aşırı sıvı dab forseps kullanın. Daha sonra bloke yüzeyi tutkal üzerine yerleştirin, böylece ventral yüzey dilimleme sırasında bıçağın yönüne bakacak ve agar bloğunu destek olarak sırt yüzeyine hafifçe itin. Kalın tarafında koklear sinir kökü ve medial olivocochlear nöronlar ve ince tarafta trapez vücudun medial çekirdeği ile kama dilimleri elde etmek için, sahne tutucu üzerine bağlı beyin ile manyetik disk yerleştirin ve bıçak doğru doğru beynin ventral yüzeyi ile bir vibratom dilimleme odasına tutucu yerleştirin.Buz gibi dilimleme çözeltisi ile hazneyi doldurun ve bıçağı karbogen kabarcıklı çözeltiye indirin. Dilimlerin simetrik olduğundan emin olmak için dilimleri ilgi çekici bölgeye kesin. Sonra sahneyi yaklaşık 15 derece bir tarafa kaydırın.İşitsel sinir kökü bir tarafta yüzeye yakın olana ve yüz siniri dilimin diğer tarafında ki yüzeyde görülene kadar dikkatlice dilimleme devam edin. Sahne yi 15 derece geri orijinal konuma kaydırın ve bıçağı dokudan uzaklaştırın. Sahne tabanını 90 derece döndürün, böylece ince tarafın yanal kenarı bıçakla karşı karşıya dır ve bıçağı yavaşça dokunun kenarına yaklaştırmadan önce bıçağı birkaç yüz mikron düşürün.Bıçak ile biraz dilim ince kenarına istenilen kalınlıkta bıçak daha düşük geri çekilir. Bıçağı dokudan geri hareket ettirin ve sahne tabanını geri döndürün, böylece ventral yüzey sahne tabanına dönük. Kama diliminin rostral yüzeyini belirlemek için bir kesim yapın ve dilimi bir santimetre karelik bir arayüz kağıdı caudle yüzeyine aktarın.Yüz siniri, rostral yüzeydeki dilimin her iki hemisferinde de görülmelidir. Sonra 30 dakika kurtarmak için 35 derece santigrat santigrat kuluçka odasına dilim taşıyın. Elektrofizyoloji analizi için kama dilimini ayarlamak için numuneyi sürekli olarak 35 santigrat derece ACSF ile perfüze olan bir kayıt odasına yerleştirin ve dilimi stabilize edin.DIC optik kullanarak, dilimin kalın tarafında işitsel sinir kökü odaklanmak ve işitsel sinir kökü ve yavaşça doku yüzeyine bipolar tungsten uyarıcı elektrot taşımak için bir mikromanipülatör kullanın. İnce tarafta trapez vücudun ventral çekirdeğine görüş alanı taşıyın ve bir 561 nanometre emisyon filtresi kullanarak epifloresan altında yama kıskaç elektrofizyolojisi için hedef olarak bir medial olivocochlear nöron seçin. Bir kayıt pipetini önerilen deney için uygun dahili çözümle doldurun ve DIC optik yama altında ve tüm hücre yapılandırmasında medial olivocochlear nörondan gelen kayıt.Medial olivocochlear nöronda tutarlı postsinaptik olaylar elde etmek için işitsel sinir kökünün elektriksel stimülasyon genliğini ayarlayın. Sonra medial olivocochlear nöronlarda uyarılmış sinaptik akımları gözlemlemek için uygun stimülasyon protokolleri çalıştırın. Bu kama dilimi hazırlama işitsel sinir kökü ve koklear çekirdek kontralateral medial olivocochlear nöronlar kayıtları için hedeflenen içerecek şekilde tasarlanmıştır.Bu terosyl menekşe lekeli kama dilimi koklear çekirdek neredeyse tam rostral-kaudal ölçüde mevcuttur. Ve işitsel sinir kökü koklear çekirdeğin girerken gözlenir. Buna ek olarak, kama dilimi kayıtları yapılır medial olivocochlear nöronlar için trapezoid vücut ipsilateral medial çekirdeğin nöronlar içerir.Bir kama dilimi presinaptik girişleri içinde nöronal bağlantı onaylamak için iki şekilde uyarılır. İlk olarak, orta hattaki ventral akustik stria elektriksel olarak uyarılır, doğrudan T-stellat aksonları aktive ve küresel gür hücreli akson stimülasyonu ile trapezvücut nöronlarının medial çekirdeği ve medial olivocochlear nöron ölçülür postsinaptik akımlar sonuçlanan. İşitsel sinir kökü daha sonra tüm monaural yükselen beyin sapı devreetkinleştirmek ve postsinaptik yanıtları uyandırmak için uyarılır.Ventral akustik strianın doğrudan uyarılması ile uyandırılabilen ilk postsinaptik akımın, işitsel sinir stimülasyonu ile uyarılmış olanlarla karşılaştırılması, işitsel sinir stimülasyonu olayında önemli ölçüde daha uzun bir gecikme yitirir, işitsel sinir stimülasyonu sırasında aktive edilen ek koklear çekirdek sinapsin den kaynaklanan sinaptik gecikmenin göstergesidir. Anatomik yerlerin kullanımı ve manyetik disk aşamasının dikkatli manevra bozulmamış nöronal devre ve güvenilir uyarılmış sonrası sinaptik tepkiler ile kama dilimleri oluşturmak için önemlidir. Bu dilimleme tekniği kalsiyum veya voltaj görüntüleme, optogenetik, nörotransmitter uncaging ve hem hücre içi hem de hücre dışı farmakoloji dahil olmak üzere ek in vitro elektrofizyoloji araçları kullanmak için bir platform sağlar.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

The Organotypic Hippocampal Slice Culture Model for Examining Neuronal Injury

Nöronal Sakatlık incelenmesi için Organotipik Hipokampal Dilim Kültür Modeli

Organotypic hippocampal slice culture is an in vitro method to examine mechanisms of neuronal injury in which the basic architecture and composition of ...

Organotypic Slice Cultures of Embryonic Ventral Midbrain: A System to Study Dopaminergic Neuronal Development in vitro

Organotypic Slice Cultures of Embryonic Ventral Midbrain: A System to Study Dopaminergic Neuronal Development in vitro

Embriyonik ventral orta beyin Organotipik Dilim Kültürler: dopaminerjik Nöronal Gelişim Eğitim Bir Sistem In vitro</em

The  mouse is an excellent model organism to study mammalian brain development due  to the abundance of molecular and genetic data. However, the ...

Functional Neuroimaging Using Ultrasonic Blood-brain Barrier Disruption and Manganese-enhanced MRI

Ultrasonik Kan-beyin bariyeri bozulması ve Manganez kontrastlı MRG kullanma İşlevsel beyin görüntüleme

Although mice are the dominant model system for studying the genetic and molecular underpinnings of neuroscience, functional neuroimaging in mice remains ...

Dual Electrophysiological Recordings of Synaptically-evoked Astroglial and Neuronal Responses in Acute Hippocampal Slices

Akut Hipokampal Dilimler içinde Synaptically-uyarılmış astroglial ve Nöronal Cevaplarının İkili Elektrofizyolojik Kayıtlar

Astrocytes form together with neurons tripartite synapses, where they integrate and modulate neuronal activity. Indeed, astrocytes sense neuronal inputs ...

In vivo Neuronal Calcium Imaging in C. elegans

In vivo Neuronal Calcium Imaging in C. elegans

C. vivo Nöronal Kalsiyum Imaging&#39;de elegans

The nematode worm C. elegans is an ideal model organism  for relatively simple, low cost neuronal imaging in vivo. Its small transparent body and simple, ...

Fast Micro-iontophoresis of Glutamate and GABA: A Useful Tool to Investigate Synaptic Integration

Glutamat ve GABA hızlı Micro-iyontoforez: Synaptic Entegrasyon Araştırma yararlı bir araç

One of the fundamental interests in neuroscience is to understand the integration of excitatory and inhibitory inputs along the very complex structure of ...

Genetic Manipulation of Cerebellar Granule Neurons In Vitro and In Vivo to Study Neuronal Morphology and Migration

Genetic Manipulation of Cerebellar Granule Neurons In Vitro and In Vivo to Study Neuronal Morphology and Migration

Serebellar Granül Nöronlar Genetik Manipülasyon<em&gt; In Vitro</em&gt; Ve<em&gt; In Vivo</em&gt; Nöronal morfoloji ve Göç Eğitim için

Developmental events in the brain including neuronal morphogenesis and migration are highly orchestrated processes. In vitro and in vivo analyses allow ...

Brain Slice Biotinylation: An Ex Vivo Approach to Measure Region-specific Plasma Membrane Protein Trafficking in Adult Neurons

Brain Slice Biotinylation: An Ex Vivo Approach to Measure Region-specific Plasma Membrane Protein Trafficking in Adult Neurons

Beyin Dilim Biyotinilasyonu: An<em&gt; Ex Vivo</emYetişkin Nöronlar Bölge özgü Plazma Membran Protein Ticaretiyle Tedbir&gt; Yaklaşım

Regulated endocytic trafficking is the central mechanism facilitating a variety of neuromodulatory events, by dynamically controlling receptor, ion ...

Inducing Plasticity of Astrocytic Receptors by Manipulation of Neuronal Firing Rates

Nöronal Ateşleme Oranlarının Manipülasyon tarafından Astrositik reseptörleri Plastisite Inducing

Close to two decades of research has established that astrocytes in situ and in vivo express numerous G protein-coupled receptors (GPCRs) that can be ...

In Utero Electroporation Approaches to Study the Excitability of Neuronal Subpopulations and Single-cell Connectivity

In Utero Electroporation Approaches to Study the Excitability of Neuronal Subpopulations and Single-cell Connectivity

Rahimde Elektroporasyon Nöronal alt popülasyonlar heyecanlanma ve Tek hücreli Bağlantı Eğitim Yaklaşımları

The nervous system is composed of an enormous range of distinct neuronal types. These neuronal subpopulations are characterized by, among other features, ...