Name: isolation of murine spermatogenic cells using a violet-excited cell-permeable dna binding dye
Uploaded: 2021-01-14T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Murine Spermatogenic Cells using a Violet-Excited Cell-Permeable DNA Binding Dye at JoVE.com

ونشكر أعضاء مختبرات "مامكاوا" و"يوشيدا" و"مايزاوا" على مساعدتهم؛ كاتي غيرهارت لتحرير المخطوطة؛ ماري آن هاندل لتقاسم الأجسام المضادة H1T, مركز مستشفى سينسيناتي للأطفال الطبي (CCHMC) البحوث تدفق Cytometry الأساسية لتقاسم معدات FACS بدعم من NIH S10OD023410; منحة في المعونة للبحوث العلمية (KAKENHI؛ 17K07424) إلى T.N.; زمالة ما بعد الدكتوراه في مؤسسة لالور؛ AMED-CREST (JP17gm1110005h0001) إلى S.Y.; منحة مشروع الأبحاث من قبل قسم خدمات البحوث بجامعة أزابو، وزارة التعليم والثقافة والرياضة والعلوم والتكنولوجيا (MEXT) - برنامج مدعوم لمشروع العلامات التجارية للبحوث الجامعية الخاصة (2016-2019)، منحة في المعونة لأنشطة البحوث الناشئة (19K21196)، مؤسسة تاكيدا للعلوم (2019)، ومنحة حوافز مؤسسة يوهارا التذكارية للأبحاث (2018) إلى S.M. المعهد الوطني للصحة R01 GM122776 إلى S.H.N.

ويتبع هذا البروتوكول المبادئ التوجيهية للجنة المؤسسية لرعاية الحيوانات واستخدامها (البروتوكول رقم 110). IACUC2018-0040) في المركز الطبي لمستشفى سينسيناتي للأطفال.
1. معدات والكواشف الإعداد لإعداد تعليق خلية الخصية
<ol><li>إعداد كل مخزون انزيم في 1x هانكس 'حل الملح المتوازن (HBSS) وتخزينه...

<ol>
	<li>Griswold, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spermatogenesis:+The+Commitment+to+Meiosis.">Spermatogenesis: The Commitment to Meiosis.</a> Physiological Reviews. 96 (1), 1-17 (2016).</li><li>Yoshida, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+Spermatogenesis+Reflects+the+Unity+and+Diversity+of+Tissue+Stem+Cell+Niche+Systems.">Mouse Spermatogenesis Reflects the Unity and Diversity of Tissue Stem Cell Niche Systems.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. , 036186 (2020).</li><li>Rathke, C., Baarends, W. M., Awe, S., Renkawitz-Pohl, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromatin+dynamics+during+spermiogenesis.">Chromatin dynamics during spermiogenesis.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1839 (3), 155-168 (2014).</li><li>Maezawa, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SCML2+promotes+heterochromatin+organization+in+late+spermatogenesis.">SCML2 promotes heterochromatin organization in late spermatogenesis.</a> Journal of Cell Science. 131 (17), 217125 (2018).</li><li>Maezawa, S., Yukawa, M., Alavattam, K. G., Barski, A., Namekawa, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+reorganization+of+open+chromatin+underlies+diverse+transcriptomes+during+spermatogenesis.">Dynamic reorganization of open chromatin underlies diverse transcriptomes during spermatogenesis.</a> Nucleic Acids Research. 46 (2), 593-608 (2018).</li><li>Bellve, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification,+culture,+and+fractionation+of+spermatogenic+cells.">Purification, culture, and fractionation of spermatogenic cells.</a> Methods in Enzymology. 225, 84-113 (1993).</li><li>Bryant, J. M., Meyer-Ficca, M. L., Dang, V. M., Berger, S. L., Meyer, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Separation+of+spermatogenic+cell+types+using+STA-PUT+velocity+sedimentation.">Separation of spermatogenic cell types using STA-PUT velocity sedimentation.</a> Journal of Visualized Experiments. (80), e50648 (2013).</li><li>Gaysinskaya, V., Bortvin, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometry+of+murine+spermatocytes.">Flow cytometry of murine spermatocytes.</a> Current Protocols in Cytometry. 72, (2015).</li><li>Bastos, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometric+characterization+of+viable+meiotic+and+postmeiotic+cells+by+Hoechst+33342+in+mouse+spermatogenesis.">Flow cytometric characterization of viable meiotic and postmeiotic cells by Hoechst 33342 in mouse spermatogenesis.</a> Cytometry Part A. 65 (1), 40-49 (2005).</li><li>Getun, I. V., Torres, B., Bois, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometry+purification+of+mouse+meiotic+cells.">Flow cytometry purification of mouse meiotic cells.</a> Journal of Visualized Experimments. (50), e2602 (2011).</li><li>Gaysinskaya, V., Soh, I. Y., van der Heijden, G. W., Bortvin, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimized+flow+cytometry+isolation+of+murine+spermatocytes.">Optimized flow cytometry isolation of murine spermatocytes.</a> Cytometry Part A. 85 (6), 556-565 (2014).</li><li>Romer, K. A., de Rooiji, D. G., Kojima, M. L., Page, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolating+mitotic+and+meiotic+germ+cells+from+male+mice+by+developmental+synchronization,+staging,+and+sorting.">Isolating mitotic and meiotic germ cells from male mice by developmental synchronization, staging, and sorting.</a> Developmental Biology. 443 (1), 19-34 (2018).</li><li>Lam, K. G., Brick, K., Cheng, G., Pratto, F., Camerini-Otero, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-type-specific+genomics+reveals+histone+modification+dynamics+in+mammalian+meiosis.">Cell-type-specific genomics reveals histone modification dynamics in mammalian meiosis.</a> Nature Communications. 10 (1), 3821 (2019).</li><li>Geisinger, A., Rodriguez-Casuriaga, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+Cytometry+for+the+Isolation+and+Characterization+of+Rodent+Meiocytes.">Flow Cytometry for the Isolation and Characterization of Rodent Meiocytes.</a> Methods in Molecular Biology. 1471, 217-230 (2017).</li><li>da Cruz, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptome+analysis+of+highly+purified+mouse+spermatogenic+cell+populations:+gene+expression+signatures+switch+from+meiotic-to+postmeiotic-related+processes+at+pachytene+stage.">Transcriptome analysis of highly purified mouse spermatogenic cell populations: gene expression signatures switch from meiotic-to postmeiotic-related processes at pachytene stage.</a> BMC Genomics. 17, 294 (2016).</li><li>Rodriguez-Casuriaga, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+preparation+of+rodent+testicular+cell+suspensions+and+spermatogenic+stages+purification+by+flow+cytometry+using+a+novel+blue-laser-excitable+vital+dye.">Rapid preparation of rodent testicular cell suspensions and spermatogenic stages purification by flow cytometry using a novel blue-laser-excitable vital dye.</a> MethodsX. 1, 239-243 (2014).</li><li>Trovero, M. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Revealing+stage-specific+expression+patterns+of+long+noncoding+RNAs+along+mouse+spermatogenesis.">Revealing stage-specific expression patterns of long noncoding RNAs along mouse spermatogenesis.</a> RNA Biology. 17 (3), 350-365 (2020).</li><li>Telford, W. G., Bradford, J., Godfrey, W., Robey, R. W., Bates, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Side+population+analysis+using+a+violet-excited+cell-permeable+DNA+binding+dye.">Side population analysis using a violet-excited cell-permeable DNA binding dye.</a> Stem Cells. 25 (4), 1029-1036 (2007).</li><li>Alavattam, K. G., Abe, H., Sakashita, A., Namekawa, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromosome+Spread+Analyses+of+Meiotic+Sex+Chromosome+Inactivation.">Chromosome Spread Analyses of Meiotic Sex Chromosome Inactivation.</a> Methods in Molecular Biology. 1861, 113-129 (2018).</li><li>Maezawa, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Super-enhancer+switching+drives+a+burst+in+gene+expression+at+the+mitosis-to-meiosis+transition.">Super-enhancer switching drives a burst in gene expression at the mitosis-to-meiosis transition.</a> Nature Structural &amp; Molecular Biology. , (2020).</li><li>Sakashita, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endogenous+retroviruses+drive+species-specific+germline+transcriptomes+in+mammals.">Endogenous retroviruses drive species-specific germline transcriptomes in mammals.</a> Nature Structural &amp; Molecular Biology. , (2020).</li><li>Agrimson, K. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterizing+the+Spermatogonial+Response+to+Retinoic+Acid+During+the+Onset+of+Spermatogenesis+and+Following+Synchronization+in+the+Neonatal+Mouse+Testis.">Characterizing the Spermatogonial Response to Retinoic Acid During the Onset of Spermatogenesis and Following Synchronization in the Neonatal Mouse Testis.</a> Biology of Reproduction. 95 (4), 81 (2016).</li><li>Hogarth, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Turning+a+spermatogenic+wave+into+a+tsunami:+synchronizing+murine+spermatogenesis+using+WIN+18,446.">Turning a spermatogenic wave into a tsunami: synchronizing murine spermatogenesis using WIN 18,446.</a> Biology of Reproduction. 88 (2), 40 (2013).</li><li>Patel, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+reorganization+of+the+genome+shapes+the+recombination+landscape+in+meiotic+prophase.">Dynamic reorganization of the genome shapes the recombination landscape in meiotic prophase.</a> Nature Structural &amp; Molecular Biology. 26 (3), 164-174 (2019).</li><li>Alavattam, K. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Attenuated+chromatin+compartmentalization+in+meiosis+and+its+maturation+in+sperm+development.">Attenuated chromatin compartmentalization in meiosis and its maturation in sperm development.</a> Nature Structural &amp; Molecular Biology. 26 (3), 175-184 (2019).</li><li>Adams, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNF8+and+SCML2+cooperate+to+regulate+ubiquitination+and+H3K27+acetylation+for+escape+gene+activation+on+the+sex+chromosomes.">RNF8 and SCML2 cooperate to regulate ubiquitination and H3K27 acetylation for escape gene activation on the sex chromosomes.</a> PLoS Genetics. 14 (2), 1007233 (2018).</li><li>Wiltshire, T., Park, C., Caldwell, K. A., Handel, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induced+premature+G2/M-phase+transition+in+pachytene+spermatocytes+includes+events+unique+to+meiosis.">Induced premature G2/M-phase transition in pachytene spermatocytes includes events unique to meiosis.</a> Developmental Biology. 169 (2), 557-567 (1995).</li></ol>

هنا نقدم بروتوكول عملي وبسيط لعزل السكان الفرعية من الحيوانات المنوية والحيوانات المنوية من فأر ذكر بالغ واحد. ولضمان إمكانية استنساخ هذا البروتوكول، هناك بعض الخطوات الحاسمة التي تحتاج إلى الاهتمام. قبل هضم الإنزيم ، تهدف خطوة الغسيل إلى إزالة الخلايا الخلالية؛ بعد الهضم، وهذه الخطوة ي...

Spermatogenesis هي عملية معقدة حيث عدد قليل من الخلايا الجذعية spermatogonial الحفاظ على الإنتاج المستمر لعدد كبير من الحيوانات المنوية في جميع أنحاء حياة الكبار1,2. أثناء تكوين الحيوانات المنوية، chromatin الحيوية إعادة عرض يحدث عندما تخضع الخلايا المنوية meiosis لإنتاج الحيوانات المنوية haploid3,4,5. عزل الحيوانات المنوية meiotic ضروري للتحقيق الجزيئي، وقد أنشئت عدة طرق مختلفة لعزل الحيوانات المنوية meiotic، بما في ذلك الفصل القائم على الترسيب6،7 وفرز الخلايا المفلورة المنشطة (FACS)8،9،10،11،12،13،14،16،17. ومع ذلك، هذه الطرق لها قيود فنية. في حين أن فصل الترسب القائم على العائدين على عدد كبير من الخلايا5,6,7, فمن كثيفة العمالة. الأسلوب القائم على FACS المنشأة يستخدم Hoechst 33342 (Ho342) لفصل الحيوانات المنوية meiotic على أساس محتوى الحمض النووي وخصائص نثر الضوء ويتطلب FACS فرز الخلايا مجهزة الأشعة فوق البنفسجية (UV) ليزر8،9،10،11. تتطلب الطرق القائمة على FACS البديلة خطوط الماوس المعدلة وراثيا التي أعرب عن البروتينات الفلورية، وتزامن من الحيوانات المنوية12، أو تثبيت الخلايا ووضع العلامات الأجسام المضادة التي لا تتوافق مع عزل الخلايا الحية13. في حين أن هناك طريقة بديلة أخرى باستخدام صبغة ربط الحمض النووي القابلة للنفاذ الخلوية ، فإن صبغة DyeCycle Greenstain 14،15،16،17، يوصى بهذه الطريقة لعزل الخلايا المنوية من الخصية. لذلك، هناك حاجة ماسة لتطوير طريقة عزل بسيطة وقوية لـ الحيوانات المنوية النيوية الحية التي يمكن تطبيقها على أي سلالة فأرة من أي عمر ويمكن تنفيذها باستخدام أي فارز خلية FACS.
هنا نحن وصف مثل بروتوكول عزل الخلايا التي طال السعي باستخدام وصمة عار DyeCycle البنفسجي (DCV). DCV هو السمية الخلوية المنخفضة، خلية نفاذية صبغة ملزمة الحمض النووي مماثلة هيكليا لHo342 ولكن مع طيف الإثارة تحولت نحو نطاق البنفسجي18. وبالإضافة إلى ذلك، فإن DCV لديها طيف أوسع من الانبعاثات مقارنة بـ DCG. وهكذا، يمكن أن يكون متحمس من قبل كل من الأشعة فوق البنفسجية والأشعة الليزر البنفسجية، مما يحسن مرونة المعدات، مما يسمح باستخدام فارز خلية FACS غير مجهزة ليزر الأشعة فوق البنفسجية. يستخدم بروتوكول DCV المعروض هنا فصل ثنائي الأبعاد مع الأزرق DCV و DCV الأحمر، يحاكي ميزة بروتوكول Ho342. مع هذه الميزة، لدينا بروتوكول DCV يسمح لنا لعزل الخلايا الجرثومية المخصب للغاية من الخصية الكبار. نحن نقدم بروتوكول البوابات مفصلة لعزل الخلايا المنوية الحية من الخصيتين الماوس الكبار من فأر واحد (من اثنين من الخصيتين). كما أننا نتصف بروتوكولاً فعالاً وسريعاً لإعداد التعليق أحادي الخلية من الخصيص الماوس التي يمكن استخدامها لعزل الخلية هذه. يتطلب الإجراء وقتًا قصيرًا لإكماله (إعداد تعليق خلية واحدة - ساعة واحدة ، تلطيخ صبغ - 30 دقيقة ، وفرز الخلايا - 2-3 ساعات: المجموع - 4-5 ساعات اعتمادًا على عدد الخلايا اللازمة ؛ الشكل 1). بعد عزل الخلية، يمكن إكمال مجموعة واسعة من التطبيقات المصب بما في ذلك RNA-seq، ATAC-seq، ChIP-seq، والخلايا.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>1.5 ml tube</td>
			<td>Watson</td>
			<td>131-7155C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 mm Petri dish</td>
			<td>Corning, Falcon</td>
			<td>351029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL Centrifuge tube</td>
			<td>Watson</td>
			<td>1332-015S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 ml polystyrene tube with cell strainer snap cap (35 &#181;m nylon mesh)</td>
			<td>Corning, Falcon</td>
			<td>352235</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL Centrifuge tube</td>
			<td>Watson</td>
			<td>1342-050S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>60 mm Petri dish</td>
			<td>Corning, Falcon</td>
			<td>351007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70 &#181;m nylon mesh</td>
			<td>Corning, Falcon</td>
			<td>352350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell sorter</td>
			<td>Sony</td>
			<td>SH800S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase, recombinant, Animal-derived-free</td>
			<td>FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation</td>
			<td>036-23141</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase, Type 1</td>
			<td>Worthington</td>
			<td>LS004196</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cover glass</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>12-544-G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytospin 3</td>
			<td>Shandon</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI (4&#39;,6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride)</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>D1306</td>
			<td>working concentration: 0.1 &#956;g/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dnase I</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D5025-150KU</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey serum</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S30-M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s phosphate-buffered saline (DPBS)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium (DMEM)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11885076</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>16000044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hostone H1T antibody</td>
			<td>gift from Mary Ann Handel</td>
			<td></td>
			<td>1/2000 diluted</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hank&#8217;s balanced salt solution (HBSS)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14175095</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hyaluronidase from bovine testes</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H3506-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline (PBS)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P5493-4L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipettemen</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProLong Gold Antifade Mountant</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>P36930</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rH2AX antibody</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>05-635</td>
			<td>working concentration: 2 &#956;g/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sperm Fertilization Protein 56 (Sp56) antibody</td>
			<td>QED Bioscience</td>
			<td>55101</td>
			<td>working concentration: 0.5 &#956;g/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterilized forceps and scissors</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superfrost /Plus Microscope Slides</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>12-550-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYCP3 antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab205846</td>
			<td>working concentration: 5 &#956;g/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TWEEN 20 (Polysorbate 20)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P9416</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vybrant DyeCycle Violet Stain (DCV)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>V35003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of murine spermatogenic cells using a violet-excited cell-permeable dna binding dye

عزل الحيوانات المنوية meiotic ضروري للتحقيق في الآليات الجزيئية الكامنة في meiosis والحيوانات المنوية. على الرغم من وجود بروتوكولات عزل الخلايا المنشأة باستخدام Hoechst 33342 تلطيخ في تركيبة مع فرز الخلايا المنشطة بالفلور، فإنه يتطلب فرز الخلايا مجهزة ليزر الأشعة فوق البنفسجية. هنا وصف بروتوكول عزل الخلية باستخدام وصمة عار فيوليت DyeCycle (DCV)، وهو منخفض صبغة الحمض النووي ربط السامة للخلايا هيكليا مماثلة لHoechst 33342. يمكن أن يكون DCV متحمسًا من قبل كل من الأشعة فوق البنفسجية والأشعة البنفسجية ، مما يحسن مرونة اختيار المعدات ، بما في ذلك فرز الخلايا غير المجهزة بالليزر فوق البنفسجي. باستخدام هذا البروتوكول، يمكن للمرء أن يعزل ثلاثة من الخلايا الحية الفرعية في الطور الطوري meiotic الأول، بما في ذلك اللبتوتين / zygotene، pachytene، وseetocytes diplotene، فضلا عن الحيوانات المنوية جولة ما بعد الميوتيك. كما أننا نتصف بروتوكولًا لإعداد التعليق أحادي الخلية من الخصيص الماوس. عموما، يتطلب الإجراء وقتا قصيرا لإكمال (4-5 ساعات اعتمادا على عدد الخلايا اللازمة)، مما يسهل العديد من التطبيقات المصب.

تظهر نتيجة تمثيلية لبروتوكول الفرز هذا في الشكل 3. يبلغ إجمالي وقت الفرز لخصيتين (فأرة واحدة) عادة حوالي 3 ساعات، وهو ما يعتمد على تركيز تعليق الخلية وسرعة الفرز. بعد الفرز، يتم تأكيد نقاء الحيوانات المنوية عن طريق الكبت المناعي من SYCP3 و γH2AX (الشكل 3A). نقاء ممث?...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Murine Spermatogenic Cells using a Violet-Excited Cell-Permeable DNA Binding Dye at JoVE.com

Isolation of Murine Spermatogenic Cells using a Violet-Excited Cell-Permeable DNA Binding Dye

هنا نقدم طريقة بسيطة وفعالة لعزل الخلايا الجرثومية الحية الميوتيك وما بعد الومياء من الخصيات الماوس الكبار. باستخدام السمية الخلوية المنخفضة ، وصبغة ملزمة الحمض النووي ذات الحماس البنفسجي وفرز الخلايا المنشطة بالفلور ، يمكن للمرء عزل مجموعات الخلايا المنوية الغنية للغاية للعديد من تطبيقات المصب.

عزل الخلايا المنوية مورين باستخدام البنفسجي-متحمس خلية نفاذة صبغة ملزمة

Isolation of meiotic spermatocytes is essential to investigate molecular mechanisms underlying meiosis and spermatogenesis. Although there are established ...

يمكن استخدام هذه الطريقة الفعالة الجديدة لعزل الاكتظاظ الفرعي لـ spermatocytes و spermatids من الفئران البالغة للتحقيق في الآليات الجزيئية الكامنة الكامنة في الداء والحيوانات المنوية. يستخدم هذا الأسلوب صبغة الحمض النووي المنخفضة السمية للخلايا مع طيف واسع من الإثارة التي يمكن تطبيقها على معظم أوامر FACS المستخدمة حاليًا. هذا الأسلوب هو مباشرة جداً.الجانب الأكثر تحديا هو جات عملية الجاتم للخلايا تدفق ولكن استراتيجية مفصلة الغات ينبغي أن تساعد في تكييف البروتوكول إلى غيرها من فرز الخلايا. ومن بين الاجراءات سيكون يو هان يه مساعد باحث من مختبر ساتوشي تمكاوا. بعد حصاد كل من الخصيتين من فأر ذكر عمره ثمانية أسابيع ، ضع الأنسجة في طبق بيتري 60 ملليمترًا يحتوي على ملليلترين من PBS البارد الجليدي وإزالة tunica albuginea.فصل بلطف الخصيتين مع ملقط لتفريق قليلا الأنابيب seminiferous. ونقل الأنابيب إلى قطرة من الجليد الطازج برنامج تلفزيوني الباردة في طبق بيتري 100 ملليمتر. استخدام ملقط لفك بلطف الأنابيب وغسل الأنابيب في ثلاث قطرات إضافية من برنامج تلفزيوني كما هو موضح للتو.بعد الغسيل الأخير ، ضع الأنابيب شبه المتحللة في أنبوب 15 ملليلتر ، يحتوي على ميليلترين من عازلة الانفصام لاحتضان لمدة 20 دقيقة عند درجة حرارة 37 درجة مئوية. في نهاية الحضانة، استخدم ماصة 1000 ميكرولتر لميصة بلطف الأنابيب 20 مرة، قبل إعادة الأنبوب إلى الحاضنة لمدة ست دقائق إضافية. في نهاية الحضانة ، الماصات الأنسجة 20 مرة إضافية ، قبل إعادة الأنبوب إلى الحاضنة.بعد ثلاث دقائق، الماصات بلطف الأنابيب 10 مرات أو حتى لا تبقى قطع الأنسجة مرئية، قبل وقف تفكك مع 10 ملليلتر من عازلة FACS. ثم، الطرد المركزي إلى تعليق الأنسجة مرتين باستخدام 10 ملليلتر إضافية لمخزن FACS الطازجة لغسل الثانية لإزالة الحيوانات المنوية والحطام أكبر قدر ممكن. لطخة الخلايا لتحليل تدفق cytometric، إعادة تعليق بيليه في ثلاثة ملليلتر من العازلة FACS.وتصفية تعليق الخلية من خلال مصفاة خلية النايلون 70 ميكرون، في أنبوب 50 ملليلتر. بعد العد، نقل 10٪ من الخلايا إلى أنبوب جديد على الجليد كتحكم سلبي غير مقع. وخلط دقيق ستة microliters من وصمة عار DCV في تعليق الخلية المتبقية.بعد حضانة لمدة 30 دقيقة في 37 درجة مئوية في الظلام مع اهتزاز لطيف كل 10 دقائق، إضافة خمسة ميكرولترات من DNase الأول إلى الخلايا. وتصفية الخلايا من خلال 35 ميكرون مصفاة شبكة النايلون في أنبوب FACS خمسة ملليلتر على الجليد. لتحليل تدفق الخلايا السيتوميترية، قم بإنشاء تجربة جديدة في برنامج تحليل التدفق، وتحت قائمة أدوات ورقة العمل، انقر فوق كثافة جديدة لإنشاء منطقة مبعثر إلى الأمام مقابل رسم كثافة المنطقة على مقياس خطي.انقر فوق مدرج التكراري الجديد لإنشاء رسم مدرج التكراري الأزرق DCV على مقياس لوغاريتمي. وانقر فوق ابدأ وسجل لبدء معالجة عينة غير الملطخة. أثناء تشغيل العينة، انقر فوق كشف وإعدادات العتبة لضبط كل من الفولتية PMT مبعثرة إلى الأمام والجانب لوضع الخلايا غير المطّلعة على مقياس المؤامرة مبعثر إلى الأمام والخلف.ضبط الجهد PMT لقناة jappy لتحديد موقع السكان السلبي DCV في العقد الأول من مؤامرة DCV الرسم البياني الأزرق لوغاريتمي. ثم انقر فوق إيقاف لإلغاء تحميل نموذج غير المُطَعَى. بعد دوامة لفترة وجيزة وتحميل العينة الملطخة، انقر فوق أنبوب المقبل لإنشاء ورقة عمل جديدة للعينة.تعيين مقياس السيتا للحصول على ما لا يقل عن واحد مرات 10 للأحداث الستة، وانقر فوق ابدأ وسجل. بعد ذلك، انقر فوق كثافة جديدة لإنشاء ارتفاع مبعثر إلى الأمام مقابل عرض التشتت الأمامي. وDCV الأزرق مقابل DCV الحمراء كثافة المؤامرات على مقياس خطي.على منطقة التشتت الأمامية مقابل مؤامرة كثافة المنطقة الخلفية، استخدم أداة المضلع لرسم بوابة تسمى الخلايا لتشمل معظم الخلايا واستبعاد الحطام الصغير. تطبيق هذه البوابة إلى ارتفاع مبعثر إلى الأمام مقابل رسم عرض مبعثر إلى الأمام واستخدام أداة المستطيل لرسم بوابة خلية واحدة لاستبعاد الخلايا المفردة غير. تطبيق بوابة الخلية المفردة على مخطط الكثافة اللون الأزرق DCV مقابل DCV وضبط المقياس لالتقاط ملف تعريف موسع.استخدم أداة المضلع لرسم بوابة DCV لاستبعاد الخلايا غير المُطَفَقة وفئات الجانب، وتطبيق البوابة على رسم مدرج التكراري الأزرق DCV على مقياس خطي. تشير القمم الرئيسية الثلاث إلى محتويات الحمض النووي المختلفة 1C و 2C و 4C. إنشاء الأزرق DCV الثاني مقابل مؤامرة DCV الكثافة الحمراء على مقياس خطي.وبوابة العودة بوابة DCV على المؤامرة لتحديد موقع السكان 1C و 4C. إنشاء الأزرق DCV آخر مقابل مؤامرة الكثافة الحمراء DCV على مقياس خطي. واستخدام أداة القطع الناقص لرسم بوابة على السكان 1C.استخدام أداة المضلع لبوابة السكان 4C مع منحنى مستمر. وخلق آخر DCV الأزرق مقابل مؤامرة الكثافة الحمراء DCV على مقياس خطي. استخدام أداة المضلع لإنشاء بوابة واحدة 4C.في مؤامرة جديدة إلى الأمام إلى جانب مبعثر، واستخدام أداة القطع الناقص لإنشاء pachytene، diplotene واللبيتوتين، وبوابات zygotene spermatocyte. عندما تم رسم جميع البوابات ، قم بإنشاء DCV الأزرق الجديد مقابل مؤامرة نقطة اللون الأحمر DCV على مقياس خطي لتطبيق بوابة 4C لضمان أن السكان الثلاثة في ترتيب مستمر داخل البوابة. بعد ذلك، قم بإنشاء منطقة جديدة للأمام مبعثر مقابل مؤامرة كثافة المنطقة الخلفية على مقياس خطي، وحدد الحجم الموحد للخلايا كسكان من الحيوانات المنوية المستديرة النقية.بعد الفرز، و purities ممثل من اللبوتين المنفصلة، zygotene، pachytene وdelotene كسور الحيوانات المنوية وعادة ما تكون بين 80٪ إلى 90٪كما أكد SYCP3 وغاما H2AX المناعة. ويمكن تأكيد نقاء فصيل الحيوانات المنوية جولة من نواة تلطيخ مع DCV في تركيبة مع Sp56 وH1t تلطيخ، وأيضا عادة حول 90٪ قابلية بقاء مجموعات الخلايا المعزولة عادة ما تكون أكثر من 95٪، ومتوسط الغلة الإجمالية لكل جزء من فأرة الكبار واحد عادة ما تكون كافية لتحليل المصب المختلفة. يمكن استخدام الخلايا المفرزة لتحليل تسلسل الجيل التالي المتنوع لاستكشاف التعبير الجيني والتنظيم أثناء تكوين الحيوانات المنوية بشكل أفضل.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Dual Labeling of Neural Crest Cells and Blood Vessels Within Chicken Embryos Using ChickGFP Neural Tube Grafting and Carbocyanine Dye DiI Injection

Dual Labeling of Neural Crest Cells and Blood Vessels Within Chicken Embryos Using ChickGFP Neural Tube Grafting and Carbocyanine Dye DiI Injection

وضع العلامات المزدوجة من خلايا كريست العصبية والأوعية الدموية داخل أجنة الدجاج باستخدام الفرخGFP تطعيم الأنبوب العصبي وكاروتشيانين صبغ DiI حقن

All developing organs need to be connected to both the nervous system (for sensory and motor control) as well as the vascular system (for gas exchange, ...

Murine Dermal Fibroblast Isolation by FACS

الفئران عن طريق الجلد الخلايا الليفية العزلة التي FACS

Fibroblasts are the principle cell type responsible for secreting extracellular matrix and are a critical component of many organs and tissues. Fibroblast ...

Isolation of Murine Embryonic Hemogenic Endothelial Cells

عزل خلايا الفئران الجنينية مكون للدم غشائي

The specification of hemogenic endothelial cells from embryonic vascular endothelium occurs during brief developmental periods within distinct tissues, ...

Isolation and Expansion of Mesenchymal Stem/Stromal Cells Derived from Human Placenta Tissue

العزل والتوسع في الجذعية الوسيطة / خلايا انسجة مشتقة من المشيمة البشرية الأنسجة

Mesenchymal stem/stromal cells (MSC) are promising candidates for use in cell-based therapies. In most cases, therapeutic response appears to be cell-dose ...

The Production of Pluripotent Stem Cells from Mouse Amniotic Fluid Cells Using a Transposon System

إنتاج الخلايا الجذعية المحفزة من الفأر الأمنيوسي الخلايا السوائل عن طريق نظام ينقول

Induced pluripotent stem (iPS) cells are generated from mouse and human somatic cells by forced expression of defined transcription factors using ...

Horizontal Whole Mount: A Novel Processing and Imaging Protocol for Thick, Three-dimensional Tissue Cross-sections of Skin

أفقي جبل كامل: A معالجة الرواية والتصوير بروتوكول للثدي، ثلاثة-- الأبعاد الأنسجة عبر-- أقسام الجلد

Processing a tissue of interest to generate a microscopic image that supports a scientific argument can be challenging. The acquisition of high-quality ...

Isolation of Human Endometrial Stromal Cells for In Vitro Decidualization

Isolation of Human Endometrial Stromal Cells for In Vitro Decidualization

عزل الخلايا اللحمية الرحم البشرية في المختبر ديسيدواليزيشن

The differentiation of human endometrial stromal cells (HESC) from fibroblast-like appearance into secretory decidua is a transformation required for ...

Computational Analysis of the Caenorhabditis elegans Germline to Study the Distribution of Nuclei, Proteins, and the Cytoskeleton

Computational Analysis of the Caenorhabditis elegans Germline to Study the Distribution of Nuclei, Proteins, and the Cytoskeleton

التحليل الحسابي ل Germline ايليجانس كاينورهابديتيس دراسة توزيع الأنوية، والبروتينات، وسيتوسكيليتون

The Caenorhabditis elegans (C. elegans) germline is used to study several biologically important processes including stem cell development, apoptosis, and ...

In Vitro Generation of Somite Derivatives from Human Induced Pluripotent Stem Cells

في المختبر توليد المشتقات سميط من البشرية التي يسببها الخلايا الجذعية Pluripotent

In response to signals such as WNTs, bone morphogenetic proteins (BMPs), and sonic hedgehog (SHH) secreted from surrounding tissues, somites (SMs) give ...

Three-dimensional Angiogenesis Assay System using Co-culture Spheroids Formed by Endothelial Colony Forming Cells and Mesenchymal Stem Cells

نظام فحص تكوين الأوعية ثلاثي الأبعاد باستخدام Spheroids الثقافة المشتركة التي شكلتها الخلايا المكونة للمستعمرة البطانية والخلايا الجذعية Mesenchymal

Studies in the field of angiogenesis have been aggressively growing in the last few decades with the recognition that angiogenesis is a hallmark of more ...