Name: isolation of murine spermatogenic cells using a violet-excited cell-permeable dna binding dye
Uploaded: 2021-01-14T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Murine Spermatogenic Cells using a Violet-Excited Cell-Permeable DNA Binding Dye at JoVE.com

Vi takker medlemmer af Namekawa, Yoshida og Maezawa laboratorier for deres hjælp; Katie Gerhardt til redigering af manuskriptet; Mary Ann Handel for deling af H1T antistof, Cincinnati Children's Hospital Medical Center (CCHMC) Research Flow Cytometri Core til deling af FACS udstyr støttet af NIH S10OD023410; Tilskud til videnskabelig forskning (KAKENHI; 17K07424) til T.N. Lalor Foundation Postdoctoral Fellowship til AS; AMED-CREST (JP17gm1110005h0001) til S.Y.; forskningsprojektet Grant af Azabu University Research Services Division, Ministry of Education, Culture, Sports, Science and Technology (MEXT)-Supported Program for The Private University Research Branding Project (2016-2019), Grant-in-Aid for Research Activity Start-up (19K21196), Takeda Science Foundation (2019) og Uehara Memorial Foundation Research Incentive Grant (2018) til S.M.; National Institute of Health R01 GM122776 til S.H.N.

Denne protokol følger retningslinjerne fra Udvalget for Institutionel Dyrepleje og -Anvendelse (protokol nr. IACUC2018-0040) på Cincinnati Children's Hospital Medical Center.
1. Opsætning af udstyr og reagens til fremstilling af testikelcelleaffjedring
<ol><li>Hver enzymbestand klargøres i 1x Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) og opbevares ved -20 °C. (Tabel1). BEMÆRK: Forbered når som helst før eksperimentet.</li>
	<li>En dag før forsøget: Coatopsamlingsrør ...

<ol>
	<li>Griswold, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spermatogenesis:+The+Commitment+to+Meiosis.">Spermatogenesis: The Commitment to Meiosis.</a> Physiological Reviews. 96 (1), 1-17 (2016).</li><li>Yoshida, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+Spermatogenesis+Reflects+the+Unity+and+Diversity+of+Tissue+Stem+Cell+Niche+Systems.">Mouse Spermatogenesis Reflects the Unity and Diversity of Tissue Stem Cell Niche Systems.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. , 036186 (2020).</li><li>Rathke, C., Baarends, W. M., Awe, S., Renkawitz-Pohl, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromatin+dynamics+during+spermiogenesis.">Chromatin dynamics during spermiogenesis.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1839 (3), 155-168 (2014).</li><li>Maezawa, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SCML2+promotes+heterochromatin+organization+in+late+spermatogenesis.">SCML2 promotes heterochromatin organization in late spermatogenesis.</a> Journal of Cell Science. 131 (17), 217125 (2018).</li><li>Maezawa, S., Yukawa, M., Alavattam, K. G., Barski, A., Namekawa, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+reorganization+of+open+chromatin+underlies+diverse+transcriptomes+during+spermatogenesis.">Dynamic reorganization of open chromatin underlies diverse transcriptomes during spermatogenesis.</a> Nucleic Acids Research. 46 (2), 593-608 (2018).</li><li>Bellve, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification,+culture,+and+fractionation+of+spermatogenic+cells.">Purification, culture, and fractionation of spermatogenic cells.</a> Methods in Enzymology. 225, 84-113 (1993).</li><li>Bryant, J. M., Meyer-Ficca, M. L., Dang, V. M., Berger, S. L., Meyer, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Separation+of+spermatogenic+cell+types+using+STA-PUT+velocity+sedimentation.">Separation of spermatogenic cell types using STA-PUT velocity sedimentation.</a> Journal of Visualized Experiments. (80), e50648 (2013).</li><li>Gaysinskaya, V., Bortvin, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometry+of+murine+spermatocytes.">Flow cytometry of murine spermatocytes.</a> Current Protocols in Cytometry. 72, (2015).</li><li>Bastos, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometric+characterization+of+viable+meiotic+and+postmeiotic+cells+by+Hoechst+33342+in+mouse+spermatogenesis.">Flow cytometric characterization of viable meiotic and postmeiotic cells by Hoechst 33342 in mouse spermatogenesis.</a> Cytometry Part A. 65 (1), 40-49 (2005).</li><li>Getun, I. V., Torres, B., Bois, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometry+purification+of+mouse+meiotic+cells.">Flow cytometry purification of mouse meiotic cells.</a> Journal of Visualized Experimments. (50), e2602 (2011).</li><li>Gaysinskaya, V., Soh, I. Y., van der Heijden, G. W., Bortvin, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimized+flow+cytometry+isolation+of+murine+spermatocytes.">Optimized flow cytometry isolation of murine spermatocytes.</a> Cytometry Part A. 85 (6), 556-565 (2014).</li><li>Romer, K. A., de Rooiji, D. G., Kojima, M. L., Page, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolating+mitotic+and+meiotic+germ+cells+from+male+mice+by+developmental+synchronization,+staging,+and+sorting.">Isolating mitotic and meiotic germ cells from male mice by developmental synchronization, staging, and sorting.</a> Developmental Biology. 443 (1), 19-34 (2018).</li><li>Lam, K. G., Brick, K., Cheng, G., Pratto, F., Camerini-Otero, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-type-specific+genomics+reveals+histone+modification+dynamics+in+mammalian+meiosis.">Cell-type-specific genomics reveals histone modification dynamics in mammalian meiosis.</a> Nature Communications. 10 (1), 3821 (2019).</li><li>Geisinger, A., Rodriguez-Casuriaga, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+Cytometry+for+the+Isolation+and+Characterization+of+Rodent+Meiocytes.">Flow Cytometry for the Isolation and Characterization of Rodent Meiocytes.</a> Methods in Molecular Biology. 1471, 217-230 (2017).</li><li>da Cruz, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptome+analysis+of+highly+purified+mouse+spermatogenic+cell+populations:+gene+expression+signatures+switch+from+meiotic-to+postmeiotic-related+processes+at+pachytene+stage.">Transcriptome analysis of highly purified mouse spermatogenic cell populations: gene expression signatures switch from meiotic-to postmeiotic-related processes at pachytene stage.</a> BMC Genomics. 17, 294 (2016).</li><li>Rodriguez-Casuriaga, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+preparation+of+rodent+testicular+cell+suspensions+and+spermatogenic+stages+purification+by+flow+cytometry+using+a+novel+blue-laser-excitable+vital+dye.">Rapid preparation of rodent testicular cell suspensions and spermatogenic stages purification by flow cytometry using a novel blue-laser-excitable vital dye.</a> MethodsX. 1, 239-243 (2014).</li><li>Trovero, M. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Revealing+stage-specific+expression+patterns+of+long+noncoding+RNAs+along+mouse+spermatogenesis.">Revealing stage-specific expression patterns of long noncoding RNAs along mouse spermatogenesis.</a> RNA Biology. 17 (3), 350-365 (2020).</li><li>Telford, W. G., Bradford, J., Godfrey, W., Robey, R. W., Bates, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Side+population+analysis+using+a+violet-excited+cell-permeable+DNA+binding+dye.">Side population analysis using a violet-excited cell-permeable DNA binding dye.</a> Stem Cells. 25 (4), 1029-1036 (2007).</li><li>Alavattam, K. G., Abe, H., Sakashita, A., Namekawa, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromosome+Spread+Analyses+of+Meiotic+Sex+Chromosome+Inactivation.">Chromosome Spread Analyses of Meiotic Sex Chromosome Inactivation.</a> Methods in Molecular Biology. 1861, 113-129 (2018).</li><li>Maezawa, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Super-enhancer+switching+drives+a+burst+in+gene+expression+at+the+mitosis-to-meiosis+transition.">Super-enhancer switching drives a burst in gene expression at the mitosis-to-meiosis transition.</a> Nature Structural &amp; Molecular Biology. , (2020).</li><li>Sakashita, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endogenous+retroviruses+drive+species-specific+germline+transcriptomes+in+mammals.">Endogenous retroviruses drive species-specific germline transcriptomes in mammals.</a> Nature Structural &amp; Molecular Biology. , (2020).</li><li>Agrimson, K. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterizing+the+Spermatogonial+Response+to+Retinoic+Acid+During+the+Onset+of+Spermatogenesis+and+Following+Synchronization+in+the+Neonatal+Mouse+Testis.">Characterizing the Spermatogonial Response to Retinoic Acid During the Onset of Spermatogenesis and Following Synchronization in the Neonatal Mouse Testis.</a> Biology of Reproduction. 95 (4), 81 (2016).</li><li>Hogarth, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Turning+a+spermatogenic+wave+into+a+tsunami:+synchronizing+murine+spermatogenesis+using+WIN+18,446.">Turning a spermatogenic wave into a tsunami: synchronizing murine spermatogenesis using WIN 18,446.</a> Biology of Reproduction. 88 (2), 40 (2013).</li><li>Patel, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+reorganization+of+the+genome+shapes+the+recombination+landscape+in+meiotic+prophase.">Dynamic reorganization of the genome shapes the recombination landscape in meiotic prophase.</a> Nature Structural &amp; Molecular Biology. 26 (3), 164-174 (2019).</li><li>Alavattam, K. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Attenuated+chromatin+compartmentalization+in+meiosis+and+its+maturation+in+sperm+development.">Attenuated chromatin compartmentalization in meiosis and its maturation in sperm development.</a> Nature Structural &amp; Molecular Biology. 26 (3), 175-184 (2019).</li><li>Adams, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNF8+and+SCML2+cooperate+to+regulate+ubiquitination+and+H3K27+acetylation+for+escape+gene+activation+on+the+sex+chromosomes.">RNF8 and SCML2 cooperate to regulate ubiquitination and H3K27 acetylation for escape gene activation on the sex chromosomes.</a> PLoS Genetics. 14 (2), 1007233 (2018).</li><li>Wiltshire, T., Park, C., Caldwell, K. A., Handel, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induced+premature+G2/M-phase+transition+in+pachytene+spermatocytes+includes+events+unique+to+meiosis.">Induced premature G2/M-phase transition in pachytene spermatocytes includes events unique to meiosis.</a> Developmental Biology. 169 (2), 557-567 (1995).</li></ol>

Her præsenterer vi en praktisk og enkel protokol til at isolere subpopulationer af spermatocytter og spermatids fra en enkelt voksen mandlig mus. For at sikre reproducerbarheden af denne protokol er der nogle kritiske trin, der kræver opmærksomhed. Før enzym fordøjelsen, vaske trin har til formål at fjerne interstitielle celler; efter fordøjelsen, dette trin hjælper med at fjerne spermatozoer og snavs. Vask/centrifugering 3 gange er vigtigt. I vores dissociation buffer opskrift, kombinationen af flere forskellige...

Spermatogenese er en kompleksproces,hvor en lille population af spermatogoniale stamceller opretholde kontinuerlig produktion af et stort antal sædceller i hele voksenlivet1,2. Under spermatogenese, dynamisk kromatin remodeling finder sted, når spermatogene celler gennemgå meiose til at producere haploid spermatids3,4,5. Isolering af meiotiske spermatocytter er afgørende for molekylær undersøgelse, og der er etableret flere forskellige tilgange til isolering af meiotiske spermatocytter, herunder sedimentationsbaseret adskillelse6,7 og fluorescensaktiv sortering (FACS)8,9,10,11,12,13 , 14,15,16,17. Disse metoder har dog tekniske begrænsninger. Mens sedimentering-baseret adskillelse giver et stort antal celler5,6,7, det er arbejdskrævende. Den etablerede FACS-baserede metode bruger Hoechst 33342 (Ho342) til at adskille meiotiske spermatocytter baseret på DNA-indhold og lysspydende egenskaber og kræver FACS cellesorterer udstyret med en ultraviolet (UV) laser8,9,10,11. Alternative FACS-baserede metoder kræver transgene muselinjer, der udtrykker lysstofproteiner, synkronisering af spermatogenese12eller cellefiksering og antistofmærkning, der ikke er kompatibel med isolering af levende celler13. Mens der er en anden alternativ metode ved hjælp af en celle-permeable DNA bindende farvestof, DyeCycle Grøn plet14,15,16,17, denne metode anbefales til isolering af spermatogene celler fra unge testikler. Derfor er der et kritisk behov for at udvikle en enkel og robust isolationsmetode for levende meiotiske spermatocytter, der kan anvendes på enhver musestamme i alle aldre, og som kan udføres ved hjælp af enhver FACS cellesortering.
Her beskriver vi sådan en længe søgt celle isolation protokol ved hjælp af DyeCycle Violet (DCV) pletten. DCV er en lav cytotoksicitet, celle-gennemtrængelig DNA bindende farvestof strukturelt ligner Ho342, men med en excitation spektrum flyttet mod det violette område18. Desuden har DCV et bredere emissionsspektrum i forhold til DCG. Således kan det være ophidset af både UV og violet lasere, som forbedrer fleksibiliteten af udstyr, så brugen af en FACS celle sorterer ikke er udstyret med en UV-laser. DCV-protokollen præsenteret her bruger to-dimensionel adskillelse med DCV blå og DCV rød, efterligne fordelen ved Ho342-protokollen. Med denne fordel giver vores DCV-protokol os mulighed for at isolere højt berigede kimceller fra de voksne testikler. Vi leverer en detaljeret gating protokol til at isolere levende spermatogene celler fra voksne mus testikler af en mus (fra to testikler). Vi beskriver også en effektiv og hurtig protokol til at forberede encellet suspension fra museealtikere, der kan bruges til denne celleisolering. Proceduren kræver en kort tid at fuldføre (forberedelse af encelle suspension - 1 time, farvning af farvestoffer - 30 min, og celle sortering - 2-3 timer: i alt - 4-5 timer afhængigt af antallet af nødvendige celler; Figur 1). Efter celleisolering kan en lang række downstream-applikationer, herunder RNA-seq, ATAC-seq, ChIP-seq og cellekultur, afsluttes.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>1.5 ml tube</td>
			<td>Watson</td>
			<td>131-7155C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 mm Petri dish</td>
			<td>Corning, Falcon</td>
			<td>351029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL Centrifuge tube</td>
			<td>Watson</td>
			<td>1332-015S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 ml polystyrene tube with cell strainer snap cap (35 &#181;m nylon mesh)</td>
			<td>Corning, Falcon</td>
			<td>352235</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL Centrifuge tube</td>
			<td>Watson</td>
			<td>1342-050S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>60 mm Petri dish</td>
			<td>Corning, Falcon</td>
			<td>351007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70 &#181;m nylon mesh</td>
			<td>Corning, Falcon</td>
			<td>352350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell sorter</td>
			<td>Sony</td>
			<td>SH800S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase, recombinant, Animal-derived-free</td>
			<td>FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation</td>
			<td>036-23141</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase, Type 1</td>
			<td>Worthington</td>
			<td>LS004196</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cover glass</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>12-544-G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytospin 3</td>
			<td>Shandon</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI (4&#39;,6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride)</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>D1306</td>
			<td>working concentration: 0.1 &#956;g/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dnase I</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D5025-150KU</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey serum</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S30-M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s phosphate-buffered saline (DPBS)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium (DMEM)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11885076</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>16000044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hostone H1T antibody</td>
			<td>gift from Mary Ann Handel</td>
			<td></td>
			<td>1/2000 diluted</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hank&#8217;s balanced salt solution (HBSS)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14175095</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hyaluronidase from bovine testes</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H3506-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline (PBS)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P5493-4L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipettemen</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProLong Gold Antifade Mountant</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>P36930</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rH2AX antibody</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>05-635</td>
			<td>working concentration: 2 &#956;g/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sperm Fertilization Protein 56 (Sp56) antibody</td>
			<td>QED Bioscience</td>
			<td>55101</td>
			<td>working concentration: 0.5 &#956;g/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterilized forceps and scissors</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superfrost /Plus Microscope Slides</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>12-550-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYCP3 antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab205846</td>
			<td>working concentration: 5 &#956;g/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TWEEN 20 (Polysorbate 20)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P9416</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vybrant DyeCycle Violet Stain (DCV)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>V35003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of murine spermatogenic cells using a violet-excited cell-permeable dna binding dye

Isolering af meiotiske spermatocytter er afgørende for at undersøge molekylære mekanismer, der ligger til grund for meiose og spermatogenese. Selv om der er etableret celle isolation protokoller ved hjælp af Hoechst 33342 farvning i kombination med fluorescens-aktiveret celle sortering, det kræver celle sorteringer udstyret med en ultraviolet laser. Her beskriver vi en celle isolation protokol ved hjælp af DyeCycle Violet (DCV) pletten, en lav cytotoksicitet DNA bindende farvestof strukturelt ligner Hoechst 33342. DCV kan være begejstret for både ultraviolette og violette lasere, hvilket forbedrer fleksibiliteten i udstyr valg, herunder en celle sorterer ikke er udstyret med en ultraviolet laser. Ved hjælp af denne protokol, kan man isolere tre levende celler subpopulationer i meiotiske prophase jeg, herunder leptotene / zygotene, pachytene, og diplotene spermatocytter, samt post-meiotiske runde spermatider. Vi beskriver også en protokol til fremstilling af encellet suspension fra museekrilerne. Samlet set kræver proceduren en kort tid at gennemføre (4-5 timer afhængigt af antallet af nødvendige celler), hvilket letter mange downstream-applikationer.

Et repræsentativt resultat af denne sorteringsprotokol er vist i figur 3. Den samlede sorteringstid for to testikler (en mus) er normalt omkring 3 timer, hvilket afhænger af koncentrationen af cellesuspension og sorteringshastigheden. Efter sortering bekræftes renheden af spermatocytter ved immunstaining af SYCP3 og γH2AX (Figur 3A). Den repræsentative renhed af sorterede L/Z-fraktioner, P, D spermatocytfraktioner er på henholdsvis 80,4 %, 90,6 % og 87,6 %...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Murine Spermatogenic Cells using a Violet-Excited Cell-Permeable DNA Binding Dye at JoVE.com

Isolation of Murine Spermatogenic Cells using a Violet-Excited Cell-Permeable DNA Binding Dye

Her præsenterer vi en enkel og effektiv metode til at isolere levende meiotiske og post-meiotiske kimceller fra voksne muse testes. Ved hjælp af en lav-cytotoksicitet, violet-ophidset DNA bindende farvestof og fluorescens-aktiveret celle sortering, kan man isolere højt beriget spermatogene cellepopulationer for mange downstream applikationer.

Isolering af murine spermatogene celler ved hjælp af en Violet-ophidset celle-permeable DNA bindende dye

Isolation of meiotic spermatocytes is essential to investigate molecular mechanisms underlying meiosis and spermatogenesis. Although there are established ...

Denne nye effektive metode til isolering af subpopulationer af spermatocytter og spermatids fra voksne mus kan bruges til at undersøge de molekylære mekanismer, der ligger til grund for meiose og spermatogenese. Denne metode bruger en lav cytotoksicitet DNA bindende farvestof med en bred excitation spektrum, der kan anvendes på de fleste aktuelt anvendte FACS ordrer. Denne metode er meget ligetil.Det mest udfordrende aspekt er flow cytometri gating men den detaljerede gating strategi bør hjælpe med at tilpasse protokollen til andre celler sorteringer. Demonstration af proceduren vil være Yu-Han Yeh, en forskningsassistent fra Satoshi Namekawa's Laboratory. Efter høst begge testikler fra en otte uger gammel mandlig mus, placere væv i en 60 millimeter petriskål indeholdende to milliliter iskold PBS og fjerne tunica albuginea.Adskære forsigtigt testiklerne med snævler for at sprede de seminiferøse tubuli lidt. Og overfør tubuli i en dråbe frisk iskold PBS i en 100 millimeter petriskål. Brug vicesspællerne til forsigtigt at rede tubullerne ud og vaske tubuliene i yderligere tre dråber PBS, som det netop er påvist.Efter den sidste vask anbringes de udtrukne halvniferede tubuli i et 15 milliliterrør, der indeholder to milliliter dissociation buffer til en 20-minutters inkubation ved 37 grader Celsius. Ved slutningen af inkubationen skal du bruge en 1000 mikroliterpipette til forsigtigt at pipette tubulerne 20 gange, før røret returneres til inkubatoren i yderligere seks minutter. Ved slutningen af inkubationen pipettes vævene yderligere 20 gange, før røret returneres til inkubatoren.Efter tre minutter pipettes tubullerne forsigtigt 10 gange, eller indtil der ikke er synlige vævsstykker tilbage, før dissociationen stoppes med 10 milliliter FACS-buffer. Derefter centrifuge til væv suspension to gange ved hjælp af en ekstra 10 milliliter for frisk FACS buffer for den anden vask for at fjerne spermatozoer og så meget snavs som muligt. For at plette cellerne til flow cytometrisk analyse, re-suspendere pellet i tre milliliter FACS buffer.Og filtrer cellesuspensionen gennem en 70 mikron nyloncelles si i et 50 milliliterrør. Efter optælling overføres 10% af cellerne til et nyt rør på is som den uhæmmede negative kontrol. Og bland grundigt seks mikroliter DCV plet i den resterende celleaffjedring.Efter en 30-minutters inkubation ved 37 grader Celsius i mørke med blid omrystning hvert 10. Og filtrer cellerne gennem en 35 mikron nylon mesh si i en fem milliliter FACS rør på is. Hvis du vil foretage cytometrisk flowanalyse af cellerne, skal du oprette et nyt eksperiment i flowanalysesoftwaren, og klik på ny tæthed under menuen regnearksværktøjer for at oprette et fremadrettet scatter-område versus backscatter-områdetæthedsplot på en lineær skala.Klik på nyt histogram for at oprette et DCV-blåt histogramplot på en logaritmisk skala. Og klik på start og post for at begynde at behandle den ikke-tilbageholdte prøve. Mens prøven kører, skal du klikke på detektor- og tærskelindstillinger for at justere både pmt-spændingerne fremad og side scatter for at placere de uhæmmede celler på skalaen af frem- og tilbage scatter-plottet.Juster PMT-spændingen for den jappy-kanal for at finde placeringen af dcv-negative population i det første årti af DCV blå histogramlogaritmisk plot. Klik derefter på Stop for at fjerne den ikke-indgroede prøve. Efter kort vortexing og lastning af farvede prøve, skal du klikke på næste rør for at oprette et nyt regneark til prøven.Indstil cytometeret til at anskaffe mindst én gang 10 til de seks hændelser, og klik på start og optag. Klik derefter på ny tæthed for at oprette fremadgående punkthøjde i forhold til fremadgående punktbredde. Og DCV blå versus DCV rød tæthed plots på en lineær skala.På den forreste scatter område versus backscatter område tæthed plot, skal du bruge polygon værktøj til at tegne en port kaldet celler til at omfatte de fleste af cellerne og til at udelukke små snavs. Anvend denne port på den fremadrettede punkthøjde i forhold til det fremadrettede punktbreddeplot, og brug rektangelværktøjet til at tegne en enkelt celles port for at udelade ikke-enkelte celler. Anvend den enkelte celles port på DCV-plottet for rød i forhold til DCV-rød tæthed, og juster skalaen for at registrere en udvidet profil.Brug polygonværktøjet til at tegne en DCV-port for at udelade de uhæmmede celler og sidepopulationen, og anvend porten på et DCV-blåt histogramplot på en lineær skala. De tre store toppe refererer til de forskellige 1C, 2C og 4C DNA indhold. Opret et andet DCV-blåt versus DCV-rød tæthedsplot på en lineær skala.Og bagporten DCV porten på plottet for at finde 1C og 4C populationer. Opret et andet DCV-blåt versus DCV-rødtæthedsplot på en lineær skala. Og brug ellipseværktøjet til at tegne en port på 1C-populationen.Brug polygonværktøjet til at gate 4C-populationen med en kontinuerlig kurve. Og oprette en anden DCV blå versus DCV rød tæthed plot på en lineær skala. Brug polygonværktøjet til at oprette en 4C én port.I en ny frem side scatter plot, bruge ellipse værktøj til at skabe pachytene, diplotene og leptotene, zygotene spermatocyte porte. Når alle portene er tegnet, skal du oprette et nyt DCV blåt versus DCV rød farvepunkt på en lineær skala for at anvende for 4C-porten for at sikre, at de tre populationer er i kontinuerlig rækkefølge inden for porten. Dernæst skal du oprette et nyt fremadsprætområde versus backscatter områdetæthed plot på en lineær skala, og vælg den samlede størrelse af celler som en ren rund spermatid befolkning.Efter sortering, de repræsentative renhed af de separerede leptotene, zygotene, pachytene og diplotene spermatocyte fraktioner er typisk mellem 80% til 90% som bekræftet af SYCP3 og Gamma H2AX immunostaining. Renheden af den runde spermatid fraktion kan bekræftes ved kerne farvning med DCV i kombination med Sp56 og H1t farvning, og er også typisk omkring 90% Levedygtigheden af de isolerede cellepopulationer er normalt over 95%Og den gennemsnitlige samlede udbytter af hver fraktion fra en enkelt voksen mus er typisk tilstrækkelig til forskellige downstream analyse. De sorterede celler kan bruges til forskellige næste generations sekventeringsanalyse for bedre at udforske genekspression og regulering under spermatogenese.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Dual Labeling of Neural Crest Cells and Blood Vessels Within Chicken Embryos Using ChickGFP Neural Tube Grafting and Carbocyanine Dye DiI Injection

Dual Labeling of Neural Crest Cells and Blood Vessels Within Chicken Embryos Using ChickGFP Neural Tube Grafting and Carbocyanine Dye DiI Injection

Dobbelt mærkning af neurale crest celler og blodkar i kyllingembryoner ved hjælp af ChickGFP Neural Tube Poding og Carbocyanine Dye DiI Injection

All developing organs need to be connected to both the nervous system (for sensory and motor control) as well as the vascular system (for gas exchange, ...

Murine Dermal Fibroblast Isolation by FACS

Murine Dermal Fibroblast Isolation ved FACS

Fibroblasts are the principle cell type responsible for secreting extracellular matrix and are a critical component of many organs and tissues. Fibroblast ...

Isolation of Murine Embryonic Hemogenic Endothelial Cells

Isolering af murint embryonale Hemogenic endotelceller

The specification of hemogenic endothelial cells from embryonic vascular endothelium occurs during brief developmental periods within distinct tissues, ...

Isolation and Expansion of Mesenchymal Stem/Stromal Cells Derived from Human Placenta Tissue

Isolation og udvidelse af mesenchymstamceller / stromacellers afledt af humane Placenta Tissue

Mesenchymal stem/stromal cells (MSC) are promising candidates for use in cell-based therapies. In most cases, therapeutic response appears to be cell-dose ...

The Production of Pluripotent Stem Cells from Mouse Amniotic Fluid Cells Using a Transposon System

Produktionen af ​​pluripotente stamceller fra mus fostervand Celler Ved hjælp af en Transposon System

Induced pluripotent stem (iPS) cells are generated from mouse and human somatic cells by forced expression of defined transcription factors using ...

Horizontal Whole Mount: A Novel Processing and Imaging Protocol for Thick, Three-dimensional Tissue Cross-sections of Skin

Horisontal Hel Mount: En Novel Processing and Imaging Protocol for Tykke, Tredimensionale Tissue Tværsnit af Skin

Processing a tissue of interest to generate a microscopic image that supports a scientific argument can be challenging. The acquisition of high-quality ...

Isolation of Human Endometrial Stromal Cells for In Vitro Decidualization

Isolation of Human Endometrial Stromal Cells for In Vitro Decidualization

Isolering af menneskelige endometrie stromale celler til In vitro- Decidualization

The differentiation of human endometrial stromal cells (HESC) from fibroblast-like appearance into secretory decidua is a transformation required for ...

Computational Analysis of the Caenorhabditis elegans Germline to Study the Distribution of Nuclei, Proteins, and the Cytoskeleton

Computational Analysis of the Caenorhabditis elegans Germline to Study the Distribution of Nuclei, Proteins, and the Cytoskeleton

Beregningsmæssige analyse af Caenorhabditis elegans kønscelleoverførsel at studere Distribution kerner, proteiner og cytoskelettet

The Caenorhabditis elegans (C. elegans) germline is used to study several biologically important processes including stem cell development, apoptosis, and ...

In Vitro Generation of Somite Derivatives from Human Induced Pluripotent Stem Cells

I Vitro Generation af Somite derivater fra menneskelige induceret celler pluripotente stamceller

In response to signals such as WNTs, bone morphogenetic proteins (BMPs), and sonic hedgehog (SHH) secreted from surrounding tissues, somites (SMs) give ...

Three-dimensional Angiogenesis Assay System using Co-culture Spheroids Formed by Endothelial Colony Forming Cells and Mesenchymal Stem Cells

Tredimensionalt Angiogeneseanalysesystem ved hjælp af co-Culture Sfæroider dannet af Endotelkoloni dannende celler og mesenchymale stamceller

Studies in the field of angiogenesis have been aggressively growing in the last few decades with the recognition that angiogenesis is a hallmark of more ...