Name: isolation of murine spermatogenic cells using a violet-excited cell-permeable dna binding dye
Uploaded: 2021-01-14T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Murine Spermatogenic Cells using a Violet-Excited Cell-Permeable DNA Binding Dye at JoVE.com

Wir danken den Mitgliedern der Laboratorien Namekawa, Yoshida und Maezawa für ihre Hilfe; Katie Gerhardt für die Bearbeitung des Manuskripts; Mary Ann Händel für die gemeinsame Nutzung des H1T-Antikörpers, des Cincinnati Children es Hospital Medical Center (CCHMC) Research Flow Cytometry Core für die gemeinsame Nutzung der FACS-Ausrüstung, die von NIH S10OD023410 unterstützt wird; Grant-in-Aid for Scientific Research (KAKENHI; 17K07424) an T.N.; Lalor Foundation Postdoktorandenstipendium an A.S.; AMED-CREST (JP17gm1110005h0001) nach S.Y.; das Forschungsprojekt Grant von der Azabu University Research Services Division, Ministry of Education, Culture, Sports, Science and Technology (MEXT)-Supported Program for the Private University Research Branding Project (2016–2019), Grant-in-Aid for Research Activity Start-up (19K21196), the Takeda Science Foundation (2019) und dem Uehara Memorial Memorial Foundation Research Incentive Grant (2018) an S.M.; National Institute of Health R01 GM122776 bis S.H.N.

Dieses Protokoll folgt den Richtlinien des Institutionellen Ausschusses für Tierpflege und -nutzung (Protokoll Nr. IACUC2018-0040) im Cincinnati Children es Hospital Medical Center.
1. Ausrüstungs- und Reagenzaufbau zur Herstellung der Hodenzellsuspension
<ol><li>Bereiten Sie jeden Enzymbestand in 1x Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) vor und lagern Sie bei -20 °C . (Tabelle1). HINWEIS: Bereiten Sie jederzeit vor dem Experiment vor.</li>
	<li>Einen Tag vor dem Experi...

<ol>
	<li>Griswold, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spermatogenesis:+The+Commitment+to+Meiosis.">Spermatogenesis: The Commitment to Meiosis.</a> Physiological Reviews. 96 (1), 1-17 (2016).</li><li>Yoshida, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+Spermatogenesis+Reflects+the+Unity+and+Diversity+of+Tissue+Stem+Cell+Niche+Systems.">Mouse Spermatogenesis Reflects the Unity and Diversity of Tissue Stem Cell Niche Systems.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. , 036186 (2020).</li><li>Rathke, C., Baarends, W. M., Awe, S., Renkawitz-Pohl, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromatin+dynamics+during+spermiogenesis.">Chromatin dynamics during spermiogenesis.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1839 (3), 155-168 (2014).</li><li>Maezawa, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SCML2+promotes+heterochromatin+organization+in+late+spermatogenesis.">SCML2 promotes heterochromatin organization in late spermatogenesis.</a> Journal of Cell Science. 131 (17), 217125 (2018).</li><li>Maezawa, S., Yukawa, M., Alavattam, K. G., Barski, A., Namekawa, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+reorganization+of+open+chromatin+underlies+diverse+transcriptomes+during+spermatogenesis.">Dynamic reorganization of open chromatin underlies diverse transcriptomes during spermatogenesis.</a> Nucleic Acids Research. 46 (2), 593-608 (2018).</li><li>Bellve, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification,+culture,+and+fractionation+of+spermatogenic+cells.">Purification, culture, and fractionation of spermatogenic cells.</a> Methods in Enzymology. 225, 84-113 (1993).</li><li>Bryant, J. M., Meyer-Ficca, M. L., Dang, V. M., Berger, S. L., Meyer, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Separation+of+spermatogenic+cell+types+using+STA-PUT+velocity+sedimentation.">Separation of spermatogenic cell types using STA-PUT velocity sedimentation.</a> Journal of Visualized Experiments. (80), e50648 (2013).</li><li>Gaysinskaya, V., Bortvin, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometry+of+murine+spermatocytes.">Flow cytometry of murine spermatocytes.</a> Current Protocols in Cytometry. 72, (2015).</li><li>Bastos, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometric+characterization+of+viable+meiotic+and+postmeiotic+cells+by+Hoechst+33342+in+mouse+spermatogenesis.">Flow cytometric characterization of viable meiotic and postmeiotic cells by Hoechst 33342 in mouse spermatogenesis.</a> Cytometry Part A. 65 (1), 40-49 (2005).</li><li>Getun, I. V., Torres, B., Bois, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometry+purification+of+mouse+meiotic+cells.">Flow cytometry purification of mouse meiotic cells.</a> Journal of Visualized Experimments. (50), e2602 (2011).</li><li>Gaysinskaya, V., Soh, I. Y., van der Heijden, G. W., Bortvin, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimized+flow+cytometry+isolation+of+murine+spermatocytes.">Optimized flow cytometry isolation of murine spermatocytes.</a> Cytometry Part A. 85 (6), 556-565 (2014).</li><li>Romer, K. A., de Rooiji, D. G., Kojima, M. L., Page, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolating+mitotic+and+meiotic+germ+cells+from+male+mice+by+developmental+synchronization,+staging,+and+sorting.">Isolating mitotic and meiotic germ cells from male mice by developmental synchronization, staging, and sorting.</a> Developmental Biology. 443 (1), 19-34 (2018).</li><li>Lam, K. G., Brick, K., Cheng, G., Pratto, F., Camerini-Otero, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-type-specific+genomics+reveals+histone+modification+dynamics+in+mammalian+meiosis.">Cell-type-specific genomics reveals histone modification dynamics in mammalian meiosis.</a> Nature Communications. 10 (1), 3821 (2019).</li><li>Geisinger, A., Rodriguez-Casuriaga, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+Cytometry+for+the+Isolation+and+Characterization+of+Rodent+Meiocytes.">Flow Cytometry for the Isolation and Characterization of Rodent Meiocytes.</a> Methods in Molecular Biology. 1471, 217-230 (2017).</li><li>da Cruz, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptome+analysis+of+highly+purified+mouse+spermatogenic+cell+populations:+gene+expression+signatures+switch+from+meiotic-to+postmeiotic-related+processes+at+pachytene+stage.">Transcriptome analysis of highly purified mouse spermatogenic cell populations: gene expression signatures switch from meiotic-to postmeiotic-related processes at pachytene stage.</a> BMC Genomics. 17, 294 (2016).</li><li>Rodriguez-Casuriaga, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+preparation+of+rodent+testicular+cell+suspensions+and+spermatogenic+stages+purification+by+flow+cytometry+using+a+novel+blue-laser-excitable+vital+dye.">Rapid preparation of rodent testicular cell suspensions and spermatogenic stages purification by flow cytometry using a novel blue-laser-excitable vital dye.</a> MethodsX. 1, 239-243 (2014).</li><li>Trovero, M. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Revealing+stage-specific+expression+patterns+of+long+noncoding+RNAs+along+mouse+spermatogenesis.">Revealing stage-specific expression patterns of long noncoding RNAs along mouse spermatogenesis.</a> RNA Biology. 17 (3), 350-365 (2020).</li><li>Telford, W. G., Bradford, J., Godfrey, W., Robey, R. W., Bates, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Side+population+analysis+using+a+violet-excited+cell-permeable+DNA+binding+dye.">Side population analysis using a violet-excited cell-permeable DNA binding dye.</a> Stem Cells. 25 (4), 1029-1036 (2007).</li><li>Alavattam, K. G., Abe, H., Sakashita, A., Namekawa, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromosome+Spread+Analyses+of+Meiotic+Sex+Chromosome+Inactivation.">Chromosome Spread Analyses of Meiotic Sex Chromosome Inactivation.</a> Methods in Molecular Biology. 1861, 113-129 (2018).</li><li>Maezawa, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Super-enhancer+switching+drives+a+burst+in+gene+expression+at+the+mitosis-to-meiosis+transition.">Super-enhancer switching drives a burst in gene expression at the mitosis-to-meiosis transition.</a> Nature Structural &amp; Molecular Biology. , (2020).</li><li>Sakashita, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endogenous+retroviruses+drive+species-specific+germline+transcriptomes+in+mammals.">Endogenous retroviruses drive species-specific germline transcriptomes in mammals.</a> Nature Structural &amp; Molecular Biology. , (2020).</li><li>Agrimson, K. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterizing+the+Spermatogonial+Response+to+Retinoic+Acid+During+the+Onset+of+Spermatogenesis+and+Following+Synchronization+in+the+Neonatal+Mouse+Testis.">Characterizing the Spermatogonial Response to Retinoic Acid During the Onset of Spermatogenesis and Following Synchronization in the Neonatal Mouse Testis.</a> Biology of Reproduction. 95 (4), 81 (2016).</li><li>Hogarth, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Turning+a+spermatogenic+wave+into+a+tsunami:+synchronizing+murine+spermatogenesis+using+WIN+18,446.">Turning a spermatogenic wave into a tsunami: synchronizing murine spermatogenesis using WIN 18,446.</a> Biology of Reproduction. 88 (2), 40 (2013).</li><li>Patel, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+reorganization+of+the+genome+shapes+the+recombination+landscape+in+meiotic+prophase.">Dynamic reorganization of the genome shapes the recombination landscape in meiotic prophase.</a> Nature Structural &amp; Molecular Biology. 26 (3), 164-174 (2019).</li><li>Alavattam, K. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Attenuated+chromatin+compartmentalization+in+meiosis+and+its+maturation+in+sperm+development.">Attenuated chromatin compartmentalization in meiosis and its maturation in sperm development.</a> Nature Structural &amp; Molecular Biology. 26 (3), 175-184 (2019).</li><li>Adams, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNF8+and+SCML2+cooperate+to+regulate+ubiquitination+and+H3K27+acetylation+for+escape+gene+activation+on+the+sex+chromosomes.">RNF8 and SCML2 cooperate to regulate ubiquitination and H3K27 acetylation for escape gene activation on the sex chromosomes.</a> PLoS Genetics. 14 (2), 1007233 (2018).</li><li>Wiltshire, T., Park, C., Caldwell, K. A., Handel, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induced+premature+G2/M-phase+transition+in+pachytene+spermatocytes+includes+events+unique+to+meiosis.">Induced premature G2/M-phase transition in pachytene spermatocytes includes events unique to meiosis.</a> Developmental Biology. 169 (2), 557-567 (1995).</li></ol>

Hier stellen wir ein praktisches und einfaches Protokoll vor, um Subpopulationen von Spermatozyten und Spermatoren aus einer einzigen erwachsenen männlichen Maus zu isolieren. Um die Reproduzierbarkeit dieses Protokolls zu gewährleisten, gibt es einige wichtige Schritte, die Aufmerksamkeit erfordern. Vor der Enzymverdauung, Waschschritt zielt darauf ab, interstitielle Zellen zu entfernen; nach der Verdauung hilft dieser Schritt, Spermatozoen und Schmutz zu entfernen. Waschen/Zentrieren ist wichtig. In unserem Dissoziat...

Spermatogenese ist ein komplexer Prozess, bei dem eine kleine Population von SpermatogonialStammzellen die kontinuierliche Produktion einer großen Anzahl von Spermien während des Erwachsenenlebens1,2aufrechterhält. Während der Spermatogenese findet die dynamische Chromatin-Remodellierung statt, wenn spermatogene Zellen einer Meiose unterzogen werden, um haploide Spermaatiden3,4,5zu produzieren. Die Isolierung meiotischer Spermatozyten ist für die molekulare Untersuchung von wesentlicher Bedeutung, und es wurden verschiedene Ansätze zur Isolierung meiotischer Spermatozyten etabliert, einschließlich sedimentationsbasierter Trennung6,7 und fluoreszenzaktivierter Zellsortierung (FACS)8,9,10,11,12,13,14,15,16,17. Diese Methoden haben jedoch technische Einschränkungen. Während sedimentationsbasierte Trennung eine große Anzahl von Zellenergibt 5,6,7, ist es arbeitsintensiv. Die etablierte FACS-basierte Methode verwendet Hoechst 33342 (Ho342), um meiotische Spermatozyten basierend auf DNA-Gehalt und Lichtstreuungseigenschaften zu trennen und erfordert FACS-Zellsortierer, die mit einem ultravioletten (UV) Laser8,9,10,11ausgestattet sind. Alternative FACS-basierte Methoden erfordern transgene Mauslinien, die floreszierende Proteine ausdrücken, Synchronisation von Spermatogenese12oder Zellfixierung und Antikörperkennzeichnung, die nicht mit der Isolierung von lebenden Zellen kompatibel ist13. Zwar gibt es eine andere alternative Methode mit einem zelldurchlässigen DNA-Bindungsfarbstoff, DyeCycle Green Stain14,15,16,17, Diese Methode wird für die Isolierung von spermaatogenen Zellen aus juvenilen Hoden empfohlen. Daher besteht die kritische Notwendigkeit, eine einfache und robuste Isolationsmethode für lebende meiotische Spermatozyten zu entwickeln, die auf jeden Mausstamm jeden Alters angewendet werden können und mit jedem FACS-Zellsortierer durchgeführt werden können.
Hier beschreiben wir ein so lang ersehntes Zellisolationsprotokoll mit dem DyeCycle Violet (DCV) Fleck. DCV ist ein geringer Zytotoxizität, zelldurchlässiger DNA-Bindungsfarbstoff strukturell ähnlich Ho342, aber mit einem Anregungsspektrum in Richtung des violetten Bereichs18verschoben. Darüber hinaus verfügt DCV über ein breiteres Emissionsspektrum im Vergleich zu DCG. So kann es sowohl durch UV- als auch violette Laser angeregt werden, was die Flexibilität der Geräte verbessert, so dass ein FACS-Zellsortierer nicht mit einem UV-Laser ausgestattet ist. Das hier vorgestellte DCV-Protokoll verwendet eine zweidimensionale Trennung mit DCV-Blau und DCV-Rot, was den Vorteil des Ho342-Protokolls nachahmt. Mit diesem Vorteil ermöglicht uns unser DCV-Protokoll, hoch angereicherte Keimzellen aus den adulten Hoden zu isolieren. Wir bieten ein detailliertes Gating-Protokoll, um lebende spermatogene Zellen von erwachsenen Maushoden einer Maus (aus zwei Hoden) zu isolieren. Wir beschreiben auch ein effizientes und schnelles Protokoll zur Vorbereitung einer einzelzelligen Suspension aus Maushoden, die für diese Zellisolierung verwendet werden können. Das Verfahren erfordert eine kurze Zeit zu vervollständigen (Vorbereitung der einzelzelligen Suspension - 1 Stunde, Farbstoff Färbung - 30 min, und Zellsortierung - 2-3 Stunden: insgesamt - 4-5 Stunden abhängig von der Anzahl der benötigten Zellen; Abbildung 1). Nach der Zellisolation kann eine breite Palette von nachgelagerten Anwendungen wie RNA-seq, ATAC-seq, ChIP-seq und Zellkultur abgeschlossen werden.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>1.5 ml tube</td>
			<td>Watson</td>
			<td>131-7155C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 mm Petri dish</td>
			<td>Corning, Falcon</td>
			<td>351029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL Centrifuge tube</td>
			<td>Watson</td>
			<td>1332-015S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 ml polystyrene tube with cell strainer snap cap (35 &#181;m nylon mesh)</td>
			<td>Corning, Falcon</td>
			<td>352235</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL Centrifuge tube</td>
			<td>Watson</td>
			<td>1342-050S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>60 mm Petri dish</td>
			<td>Corning, Falcon</td>
			<td>351007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70 &#181;m nylon mesh</td>
			<td>Corning, Falcon</td>
			<td>352350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell sorter</td>
			<td>Sony</td>
			<td>SH800S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase, recombinant, Animal-derived-free</td>
			<td>FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation</td>
			<td>036-23141</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase, Type 1</td>
			<td>Worthington</td>
			<td>LS004196</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cover glass</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>12-544-G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytospin 3</td>
			<td>Shandon</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI (4&#39;,6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride)</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>D1306</td>
			<td>working concentration: 0.1 &#956;g/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dnase I</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D5025-150KU</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey serum</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S30-M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s phosphate-buffered saline (DPBS)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium (DMEM)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11885076</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>16000044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hostone H1T antibody</td>
			<td>gift from Mary Ann Handel</td>
			<td></td>
			<td>1/2000 diluted</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hank&#8217;s balanced salt solution (HBSS)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14175095</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hyaluronidase from bovine testes</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H3506-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline (PBS)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P5493-4L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipettemen</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProLong Gold Antifade Mountant</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>P36930</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rH2AX antibody</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>05-635</td>
			<td>working concentration: 2 &#956;g/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sperm Fertilization Protein 56 (Sp56) antibody</td>
			<td>QED Bioscience</td>
			<td>55101</td>
			<td>working concentration: 0.5 &#956;g/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterilized forceps and scissors</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superfrost /Plus Microscope Slides</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>12-550-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYCP3 antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab205846</td>
			<td>working concentration: 5 &#956;g/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TWEEN 20 (Polysorbate 20)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P9416</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vybrant DyeCycle Violet Stain (DCV)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>V35003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of murine spermatogenic cells using a violet-excited cell-permeable dna binding dye

Die Isolierung meiotischer Spermatozyten ist wichtig, um molekulare Mechanismen zu untersuchen, die der Meiose und Spermatogenese zugrunde liegen. Obwohl es etablierte Zellisolationsprotokolle mit Hoechst 33342 Färbung in Kombination mit fluoreszenzaktivierter Zellsortierung gibt, sind Zellsortierer mit einem ultravioletten Laser erforderlich. Hier beschreiben wir ein Zellisolationsprotokoll mit dem DyeCycle Violet (DCV) Fleck, einem DNA-Bindungsfarbstoff mit geringer Zytotoxizität, der Hoechst 33342 strukturell ähnelt. DCV kann sowohl von ultravioletten als auch von violetten Lasern angeregt werden, was die Flexibilität der Geräteauswahl verbessert, einschließlich eines Zellsortierers, der nicht mit einem ultravioletten Laser ausgestattet ist. Mit diesem Protokoll kann man drei lebende Zellsubpopulationen in der meiotischen Prophase I isolieren, einschließlich Leptotene/Zygoten, Pachyten und Diploten-Spermatozyten sowie postmetiotische runde Spermatien. Wir beschreiben auch ein Protokoll zur Vorbereitung der einzelzelligen Suspension von Maushoden. Insgesamt benötigt das Verfahren eine kurze Zeit (4-5 Stunden abhängig von der Anzahl der benötigten Zellen), was viele nachgelagerte Anwendungen erleichtert.

Ein repräsentatives Ergebnis dieses Sortierprotokolls ist in Abbildung 3dargestellt. Die Gesamtsortierzeit von zwei Hoden (eine Maus) beträgt in der Regel etwa 3 Stunden, was von der Konzentration der Zellsuspension und der Sortiergeschwindigkeit abhängt. Nach der Sortierung wird die Reinheit der Spermatozyten durch Immunfärbung von SYCP3 und H2AX bestätigt (Abbildung 3A). Die repräsentative Reinheit der sortierten L/Z-, P-, D-Spermatozytenfraktionen betr?...

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Isolation of Murine Spermatogenic Cells using a Violet-Excited Cell-Permeable DNA Binding Dye

Hier präsentieren wir eine einfache und effiziente Methode, um lebende meiotische und postmeiotische Keimzellen von erwachsenen Maushoden zu isolieren. Mit einem zytotoxischen, violett-erregten DNA-Bindungsfarbstoff und fluoreszenzaktivierter Zellsortierung kann man hoch angereicherte spermatogene Zellpopulationen für viele nachgelagerte Anwendungen isolieren.

Isolierung von murinen Spermatogenic Cells mit einem violett-erregten Zellpermeable DNA Binding Dye

Isolation of meiotic spermatocytes is essential to investigate molecular mechanisms underlying meiosis and spermatogenesis. Although there are established ...

Diese neue effiziente Methode zur Isolierung von Subpopulationen von Spermatozyten und Spermatoiden von erwachsenen Mäusen kann verwendet werden, um die molekularen Mechanismen zu untersuchen, die der Meiose und Spermatogenese zugrunde liegen. Diese Methode verwendet einen DNA-Bindungsfarbstoff mit geringer Zytotoxizität mit einem breiten Anregungsspektrum, das auf die meisten derzeit verwendeten FACS-Aufträge angewendet werden kann. Diese Methode ist sehr einfach.Der schwierigste Aspekt ist die Flusszytometrie-Gating, aber die detaillierte Gating-Strategie sollte bei der Anpassung des Protokolls an andere Zellensortierer helfen. Demonstriert wird das Verfahren von Yu-Han Yeh, einem wissenschaftlichen Mitarbeiter des Satoshi Namekawa Labors. Nach der Ernte beider Hoden von einer acht Wochen alten männlichen Maus, legen Sie das Gewebe in eine 60 Millimeter Petrischale mit zwei Millilitereeis PBS und entfernen Sie die Tunika albuginea.Trennen Sie die Hoden vorsichtig mit Zangen, um die seminiferen Tubuli leicht zu zerstreuen. Und die Tubuli in einen Tropfen frische eiskalte PBS in einer 100-Millimeter-Petrischale übertragen. Verwenden Sie die Zange, um die Tubuli sanft zu entwirren und die Tubuli in drei zusätzlichen Tröpfchen PBS zu waschen, wie gerade gezeigt.Nach der letzten Wäsche die entwirrten seminiferen Tubuli in ein 15-Milliliter-Rohr geben, das zwei Milliliter Dissoziationspuffer für eine 20-minütige Inkubation bei 37 Grad Celsius enthält. Verwenden Sie am Ende der Inkubation eine 1000-Mikroliter-Pipette, um die Tubuli 20 Mal sanft zu pipetten, bevor Sie das Rohr für weitere sechs Minuten zum Inkubator zurückgeben. Am Ende der Inkubation, Pipette das Gewebe zusätzlich 20 Mal, bevor die Röhre zum Inkubator zurück.Nach drei Minuten die Tubuli 10 Mal sanft pipetten oder bis keine sichtbaren Gewebestücke übrig bleiben, bevor die Dissoziation mit 10 MilliliterN FACS-Puffer gestoppt wird. Dann Zentrifuge zur Gewebesuspension zweimal mit einem zusätzlichen 10 Milliliter für frischen FACS Puffer für die zweite Wäsche, um die Spermatozoen und so viel Schmutz wie möglich zu entfernen. Um die Zellen für die zytometrische Durchflussanalyse zu färben, setzen Sie das Pellet in drei Milliliter FACS-Puffer wieder auf.Und filtern Sie die Zellsuspension durch ein 70 Mikron Nylon-Zellsieb in ein 50-Milliliter-Rohr. Nach dem Zählen, übertragen Sie 10% der Zellen in eine neue Röhre auf Eis als die ungefärbte negative Kontrolle. Und mischen Sie sechs Mikroliter DCV-Färbung gründlich in die verbleibende Zellsuspension.Nach einer 30-minütigen Inkubation bei 37 Grad Celsius im Dunkeln mit sanftem Schütteln alle 10 Minuten fünf Mikroliter DNase I in die Zellen geben. Und filtern Sie die Zellen durch ein 35 Mikron Nylon-Netzsieb in eine fünf Milliliter FACS-Röhre auf Eis. Erstellen Sie für die zytometrische Flussanalyse der Zellen ein neues Experiment in der Strömungsanalysesoftware, und klicken Sie im Menü Arbeitsblattwerkzeuge auf neue Dichte, um einen Vorwärtsstreubereich im Vergleich zum Diagramm der Rückstreuflächendichte auf einer linearen Skala zu erstellen.Klicken Sie auf neues Histogramm, um ein blaues DCV-Histogrammdiagramm auf einer logarithmischen Skala zu erstellen. Klicken Sie auf Start und Datensatz, um mit der Verarbeitung der unbefleckten Probe zu beginnen. Während die Probe ausgeführt wird, klicken Sie auf Detektor- und Schwellenwerteinstellungen, um sowohl die vor- als auch die seitenseitige Streu-PMT-Spannung anzupassen, um die ungefärbten Zellen auf der Skala des Vorwärts- und Zurück-Streudiagramms zu platzieren.Passen Sie die PMT-Spannung für den Jappy-Kanal an, um die Position der DCV-negativen Population im ersten Jahrzehnt des dCV-blauen Histogramm-Logarithmischen Diagramms zu lokalisieren. Klicken Sie dann auf Stopp, um die unbefleckte Probe zu entladen. Nachdem Sie die gebeizte Probe kurz gewirbelt und geladen haben, klicken Sie auf das nächste Rohr, um ein neues Arbeitsblatt für die Probe zu erstellen.Legen Sie das Zytometer fest, um mindestens ein mal 10 für die sechs Ereignisse zu erfassen, und klicken Sie auf Start und Record. Klicken Sie als Nächstes auf neue Dichte, um die Vorwärtsstreuhöhe im Vergleich zur Streubreite nach vorne zu erstellen. Und DCV blau im Vergleich zu DCV rote Dichte Diagramme auf einer linearen Skala.Verwenden Sie im Vorwärtsstreubereich im Vergleich zum Diagramm der Rückstreuflächendichte das Polygonwerkzeug, um ein Tor namens Zellen zu zeichnen, um die meisten Zellen einzubeziehen und kleine Trümmer auszuschließen. Wenden Sie dieses Tor auf die Vorwärtsstreuhöhe im Vergleich zum Diagramm der Streuungsbreite nach vorne an, und verwenden Sie das Rechteckwerkzeug, um das Tor einer einzelnen Zelle zu zeichnen, um nicht einzelne Zellen auszuschließen. Wenden Sie das Tor der einzelnen Zelle auf das DCV-Blau- und DCV-Diagramm mit roter Dichte an, und passen Sie die Skala an, um ein erweitertes Profil zu erfassen.Verwenden Sie das Polygonwerkzeug, um ein DCV-Gate zu zeichnen, um die unbefleckten Zellen und die Seitenpopulation auszuschließen, und wenden Sie das Tor auf ein blaues Histogrammdiagramm des DCV auf einem linearen Maßstab an. Die drei Hauptspitzen beziehen sich auf die verschiedenen 1C-, 2C- und 4C-DNA-Inhalte. Erstellen Sie ein zweites DCV-Blau-DCV-Diagramm mit roter Dichte auf einer linearen Skala.Und hinter dem Tor das DCV-Tor auf das Grundstück, um die 1C und 4C Populationen zu lokalisieren. Erstellen Sie ein weiteres DCV-Blau- im DCV-Diagramm mit roter Dichte auf einer linearen Skala. Und verwenden Sie das Ellipsenwerkzeug, um ein Tor auf die 1C-Population zu zeichnen.Verwenden Sie das Polygonwerkzeug, um die 4C-Population mit einer kontinuierlichen Kurve zu bewirten. Erstellen Sie ein weiteres DCV-Blau-DCV-Diagramm mit roter Dichte auf einer linearen Skala. Verwenden Sie das Polygonwerkzeug, um ein 4C-Tor zu erstellen.Verwenden Sie in einem neuen vorwärts-nebeneinander gerichteten Streudiagramm das Ellipsenwerkzeug, um Pachyten, Diploten und Leptoten, zygoten Spermatozytentore zu erstellen. Wenn alle Tore gezeichnet wurden, erstellen Sie ein neues DCV-Blau- im DCV-Rot-Farbe-Punkt-Diagramm auf einer linearen Skala, um das für 4C-Tor anzuwenden, um sicherzustellen, dass sich die drei Populationen in einer kontinuierlichen Reihenfolge innerhalb des Gates befinden. Erstellen Sie als Nächstes einen neuen Vorwärtsstreubereich im Vergleich zum Diagramm der Rückstreuflächendichte auf einer linearen Skala, und wählen Sie die einheitliche Größe der Zellen als reine runde Spermienpopulation aus.Nach der Sortierung liegen die repräsentativen Reinheitsfraktionen der abgetrennten Leptoten, Zygoten, Pachyten und Diploten-Spermatozytenfraktionen typischerweise zwischen 80% und 90%, wie sYCP3 und Gamma H2AX Immunostaining bestätigen. Die Reinheit der runden Spermafraktion kann durch Kernfärbung mit DCV in Kombination mit Sp56 und H1t Färbung bestätigt werden, und ist auch in der Regel um 90%Die Lebensfähigkeit der isolierten Zellpopulationen ist in der Regel über 95%und die durchschnittlichen Gesamterträge jeder Fraktion aus einer einzelnen erwachsenen Maus ist in der Regel ausreichend für verschiedene nachgeschaltete Analyse. Die sortierten Zellen können für verschiedene Sequenzierungsanalysen der nächsten Generation verwendet werden, um die Genexpression und -regulation während der Spermatogenese besser zu erforschen.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Dual Labeling of Neural Crest Cells and Blood Vessels Within Chicken Embryos Using ChickGFP Neural Tube Grafting and Carbocyanine Dye DiI Injection

Dual Labeling of Neural Crest Cells and Blood Vessels Within Chicken Embryos Using ChickGFP Neural Tube Grafting and Carbocyanine Dye DiI Injection

Dual-Kennzeichnung von neuralen Kammzellen und Blutgefäßen innerhalb von Hühnerembryonen mit ChickGFP Neural Tube Grafting und Carbocyanin Dye DiI Injektion

All developing organs need to be connected to both the nervous system (for sensory and motor control) as well as the vascular system (for gas exchange, ...

Forschung

Entwicklungsbiologie

Murine Dermal Fibroblast Isolation by FACS

Murine Hautfibroblasten-Isolation durch FACS

Fibroblasts are the principle cell type responsible for secreting extracellular matrix and are a critical component of many organs and tissues. Fibroblast ...

Isolation of Murine Embryonic Hemogenic Endothelial Cells

Isolierung von murinen embryonalen Hemogenic Endothelial Cells

The specification of hemogenic endothelial cells from embryonic vascular endothelium occurs during brief developmental periods within distinct tissues, ...

Isolation and Expansion of Mesenchymal Stem/Stromal Cells Derived from Human Placenta Tissue

Isolierung und Expansion von mesenchymalen Stamm- / Stroma-Zellen aus humanen Placenta Gewebe gewonnen

Mesenchymal stem/stromal cells (MSC) are promising candidates for use in cell-based therapies. In most cases, therapeutic response appears to be cell-dose ...

The Production of Pluripotent Stem Cells from Mouse Amniotic Fluid Cells Using a Transposon System

Die Herstellung von pluripotenten Stammzellen aus Maus Fruchtwasserzellen ein Transposon-System verwenden

Induced pluripotent stem (iPS) cells are generated from mouse and human somatic cells by forced expression of defined transcription factors using ...

Horizontal Whole Mount: A Novel Processing and Imaging Protocol for Thick, Three-dimensional Tissue Cross-sections of Skin

Horizontale Ganze Mount: Ein neuartiges Verarbeitungs- und Imaging-Protokoll für dickes, dreidimensionales Gewebequerschnitt der Haut

Processing a tissue of interest to generate a microscopic image that supports a scientific argument can be challenging. The acquisition of high-quality ...

Isolation of Human Endometrial Stromal Cells for In Vitro Decidualization

Isolation of Human Endometrial Stromal Cells for In Vitro Decidualization

Isolation von menschlichen endometrialen Stromazellen Zellen für In-vitro- Decidualization

The differentiation of human endometrial stromal cells (HESC) from fibroblast-like appearance into secretory decidua is a transformation required for ...

Computational Analysis of the Caenorhabditis elegans Germline to Study the Distribution of Nuclei, Proteins, and the Cytoskeleton

Computational Analysis of the Caenorhabditis elegans Germline to Study the Distribution of Nuclei, Proteins, and the Cytoskeleton

Computergestützte Analyse der Keimbahn Caenorhabditis Elegans , die Verteilung der Kerne, Proteine und das Zytoskelett zu studieren

The Caenorhabditis elegans (C. elegans) germline is used to study several biologically important processes including stem cell development, apoptosis, and ...

In Vitro Generation of Somite Derivatives from Human Induced Pluripotent Stem Cells

In vitro-Generation der Somiten Derivate aus menschlichen induzierten Zellen pluripotenten Stammzellen

In response to signals such as WNTs, bone morphogenetic proteins (BMPs), and sonic hedgehog (SHH) secreted from surrounding tissues, somites (SMs) give ...

Three-dimensional Angiogenesis Assay System using Co-culture Spheroids Formed by Endothelial Colony Forming Cells and Mesenchymal Stem Cells

Dreidimensionales Angiogenese-Assay-System mit Co-Culture-Spheroiden, die von endotheliaalen Koloniebildenden Zellen und mesenchymalen Stammzellen gebildet werden

Studies in the field of angiogenesis have been aggressively growing in the last few decades with the recognition that angiogenesis is a hallmark of more ...