Name: isolation of murine spermatogenic cells using a violet-excited cell-permeable dna binding dye
Uploaded: 2021-01-14T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Murine Spermatogenic Cells using a Violet-Excited Cell-Permeable DNA Binding Dye at JoVE.com

אנו מודים לחברי מעבדות נמקאווה, יושידה ומזאווה על עזרתם; קייטי גרהרט לעריכת כתב היד; מרי אן הנדל לשיתוף הנוגדן H1T, המרכז הרפואי לילדים בסינסינטי (CCHMC) מחקר זרימה Cytometry Core לשיתוף ציוד FACS נתמך על ידי NIH S10OD023410; מענק בסיוע למחקר מדעי (KAKENHI; 17K07424) ל-T.N.; מלגת פוסט-ת'ורי של קרן ללור לא.ס.; AMED-CREST (JP17gm110005h0001) עד ס.י.; מענק פרויקט המחקר על ידי חטיבת שירותי המחקר של אוניברסיטת אזבו, משרד החינוך, התרבות, הספורט, המדע והטכנולוגיה (MEXT)-נתמך בתוכנית עבור פרויקט המיתוג של האוניברסיטה הפרטית למחקר (2016-2019), מענק-בסיוע לסטארט-אפ פעילות מחקרית (19K21196), קרן המדע טוקדה (2019) ומענק תמריץ המחקר של קרן אוהרה (2018) ל-S.M.; המכון הלאומי לבריאות R01 GM122776 ל S.H.N.

פרוטוקול זה פועל בהתאם להנחיות הוועדה המוסדית לטיפול בבעלי חיים ולשימוש (פרוטוקול מס'. IACUC2018-0040) במרכז הרפואי של בית החולים לילדים בסינסינטי.
1. ציוד והגדרת רייגנט להכנת מתלי תא האשכים
<ol><li>להכין כל מלאי אנזים 1x תמיסת מלח מאוזנת של הנקס (HBSS) ולאחסן ב -20 ° C.(Table1). הערה: ...

<ol>
	<li>Griswold, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spermatogenesis:+The+Commitment+to+Meiosis.">Spermatogenesis: The Commitment to Meiosis.</a> Physiological Reviews. 96 (1), 1-17 (2016).</li><li>Yoshida, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+Spermatogenesis+Reflects+the+Unity+and+Diversity+of+Tissue+Stem+Cell+Niche+Systems.">Mouse Spermatogenesis Reflects the Unity and Diversity of Tissue Stem Cell Niche Systems.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. , 036186 (2020).</li><li>Rathke, C., Baarends, W. M., Awe, S., Renkawitz-Pohl, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromatin+dynamics+during+spermiogenesis.">Chromatin dynamics during spermiogenesis.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1839 (3), 155-168 (2014).</li><li>Maezawa, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SCML2+promotes+heterochromatin+organization+in+late+spermatogenesis.">SCML2 promotes heterochromatin organization in late spermatogenesis.</a> Journal of Cell Science. 131 (17), 217125 (2018).</li><li>Maezawa, S., Yukawa, M., Alavattam, K. G., Barski, A., Namekawa, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+reorganization+of+open+chromatin+underlies+diverse+transcriptomes+during+spermatogenesis.">Dynamic reorganization of open chromatin underlies diverse transcriptomes during spermatogenesis.</a> Nucleic Acids Research. 46 (2), 593-608 (2018).</li><li>Bellve, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification,+culture,+and+fractionation+of+spermatogenic+cells.">Purification, culture, and fractionation of spermatogenic cells.</a> Methods in Enzymology. 225, 84-113 (1993).</li><li>Bryant, J. M., Meyer-Ficca, M. L., Dang, V. M., Berger, S. L., Meyer, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Separation+of+spermatogenic+cell+types+using+STA-PUT+velocity+sedimentation.">Separation of spermatogenic cell types using STA-PUT velocity sedimentation.</a> Journal of Visualized Experiments. (80), e50648 (2013).</li><li>Gaysinskaya, V., Bortvin, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometry+of+murine+spermatocytes.">Flow cytometry of murine spermatocytes.</a> Current Protocols in Cytometry. 72, (2015).</li><li>Bastos, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometric+characterization+of+viable+meiotic+and+postmeiotic+cells+by+Hoechst+33342+in+mouse+spermatogenesis.">Flow cytometric characterization of viable meiotic and postmeiotic cells by Hoechst 33342 in mouse spermatogenesis.</a> Cytometry Part A. 65 (1), 40-49 (2005).</li><li>Getun, I. V., Torres, B., Bois, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometry+purification+of+mouse+meiotic+cells.">Flow cytometry purification of mouse meiotic cells.</a> Journal of Visualized Experimments. (50), e2602 (2011).</li><li>Gaysinskaya, V., Soh, I. Y., van der Heijden, G. W., Bortvin, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimized+flow+cytometry+isolation+of+murine+spermatocytes.">Optimized flow cytometry isolation of murine spermatocytes.</a> Cytometry Part A. 85 (6), 556-565 (2014).</li><li>Romer, K. A., de Rooiji, D. G., Kojima, M. L., Page, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolating+mitotic+and+meiotic+germ+cells+from+male+mice+by+developmental+synchronization,+staging,+and+sorting.">Isolating mitotic and meiotic germ cells from male mice by developmental synchronization, staging, and sorting.</a> Developmental Biology. 443 (1), 19-34 (2018).</li><li>Lam, K. G., Brick, K., Cheng, G., Pratto, F., Camerini-Otero, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-type-specific+genomics+reveals+histone+modification+dynamics+in+mammalian+meiosis.">Cell-type-specific genomics reveals histone modification dynamics in mammalian meiosis.</a> Nature Communications. 10 (1), 3821 (2019).</li><li>Geisinger, A., Rodriguez-Casuriaga, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+Cytometry+for+the+Isolation+and+Characterization+of+Rodent+Meiocytes.">Flow Cytometry for the Isolation and Characterization of Rodent Meiocytes.</a> Methods in Molecular Biology. 1471, 217-230 (2017).</li><li>da Cruz, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptome+analysis+of+highly+purified+mouse+spermatogenic+cell+populations:+gene+expression+signatures+switch+from+meiotic-to+postmeiotic-related+processes+at+pachytene+stage.">Transcriptome analysis of highly purified mouse spermatogenic cell populations: gene expression signatures switch from meiotic-to postmeiotic-related processes at pachytene stage.</a> BMC Genomics. 17, 294 (2016).</li><li>Rodriguez-Casuriaga, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+preparation+of+rodent+testicular+cell+suspensions+and+spermatogenic+stages+purification+by+flow+cytometry+using+a+novel+blue-laser-excitable+vital+dye.">Rapid preparation of rodent testicular cell suspensions and spermatogenic stages purification by flow cytometry using a novel blue-laser-excitable vital dye.</a> MethodsX. 1, 239-243 (2014).</li><li>Trovero, M. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Revealing+stage-specific+expression+patterns+of+long+noncoding+RNAs+along+mouse+spermatogenesis.">Revealing stage-specific expression patterns of long noncoding RNAs along mouse spermatogenesis.</a> RNA Biology. 17 (3), 350-365 (2020).</li><li>Telford, W. G., Bradford, J., Godfrey, W., Robey, R. W., Bates, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Side+population+analysis+using+a+violet-excited+cell-permeable+DNA+binding+dye.">Side population analysis using a violet-excited cell-permeable DNA binding dye.</a> Stem Cells. 25 (4), 1029-1036 (2007).</li><li>Alavattam, K. G., Abe, H., Sakashita, A., Namekawa, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromosome+Spread+Analyses+of+Meiotic+Sex+Chromosome+Inactivation.">Chromosome Spread Analyses of Meiotic Sex Chromosome Inactivation.</a> Methods in Molecular Biology. 1861, 113-129 (2018).</li><li>Maezawa, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Super-enhancer+switching+drives+a+burst+in+gene+expression+at+the+mitosis-to-meiosis+transition.">Super-enhancer switching drives a burst in gene expression at the mitosis-to-meiosis transition.</a> Nature Structural &amp; Molecular Biology. , (2020).</li><li>Sakashita, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endogenous+retroviruses+drive+species-specific+germline+transcriptomes+in+mammals.">Endogenous retroviruses drive species-specific germline transcriptomes in mammals.</a> Nature Structural &amp; Molecular Biology. , (2020).</li><li>Agrimson, K. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterizing+the+Spermatogonial+Response+to+Retinoic+Acid+During+the+Onset+of+Spermatogenesis+and+Following+Synchronization+in+the+Neonatal+Mouse+Testis.">Characterizing the Spermatogonial Response to Retinoic Acid During the Onset of Spermatogenesis and Following Synchronization in the Neonatal Mouse Testis.</a> Biology of Reproduction. 95 (4), 81 (2016).</li><li>Hogarth, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Turning+a+spermatogenic+wave+into+a+tsunami:+synchronizing+murine+spermatogenesis+using+WIN+18,446.">Turning a spermatogenic wave into a tsunami: synchronizing murine spermatogenesis using WIN 18,446.</a> Biology of Reproduction. 88 (2), 40 (2013).</li><li>Patel, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+reorganization+of+the+genome+shapes+the+recombination+landscape+in+meiotic+prophase.">Dynamic reorganization of the genome shapes the recombination landscape in meiotic prophase.</a> Nature Structural &amp; Molecular Biology. 26 (3), 164-174 (2019).</li><li>Alavattam, K. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Attenuated+chromatin+compartmentalization+in+meiosis+and+its+maturation+in+sperm+development.">Attenuated chromatin compartmentalization in meiosis and its maturation in sperm development.</a> Nature Structural &amp; Molecular Biology. 26 (3), 175-184 (2019).</li><li>Adams, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNF8+and+SCML2+cooperate+to+regulate+ubiquitination+and+H3K27+acetylation+for+escape+gene+activation+on+the+sex+chromosomes.">RNF8 and SCML2 cooperate to regulate ubiquitination and H3K27 acetylation for escape gene activation on the sex chromosomes.</a> PLoS Genetics. 14 (2), 1007233 (2018).</li><li>Wiltshire, T., Park, C., Caldwell, K. A., Handel, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induced+premature+G2/M-phase+transition+in+pachytene+spermatocytes+includes+events+unique+to+meiosis.">Induced premature G2/M-phase transition in pachytene spermatocytes includes events unique to meiosis.</a> Developmental Biology. 169 (2), 557-567 (1995).</li></ol>

כאן אנו מציגים פרוטוקול מעשי ופשוט לבודד תת-אוכלוסיות של spermatocytes וזרעון מעכבר זכר בוגר אחד. כדי להבטיח את האפשרות לשחזור של פרוטוקול זה, קיימים מספר שלבים קריטיים הזקוקים לתשומת לב. לפני עיכול אנזימים, שלב לשטוף שואף להסיר תאים interstitial; לאחר העיכול, שלב זה מסייע להסיר spermatozoa ופסולת. כביסה / צנ...

Spermatogenesis הוא תהליך מורכב שבו אוכלוסייה קטנה של תאי גזע spermatogonial לקיים ייצור רציף של מספר גדול של זרעלאורך החיים הבוגרים 1,2. במהלך spermatogenesis, שיפוץ כרומטין דינמי מתרחש כאשר תאי זרע עוברים meiosis לייצר זרעונים haploid3,4,5. בידוד זרעונים מיוטיים חיוני לחקירה מולקולרית, ונקבעו מספר גישות שונות לבידוד זרעון מיוטי, כולל הפרדה מבוססת מום6,7 ומיון תאים המופעל על-ידי פלואורסצנטיות (FACS)8,9,10,11,12,13,14,15,16,17. עם זאת, שיטות אלה כוללות מגבלות טכניות. בעוד שהפרדה מבוססת מום מניבה מספר גדול של תאים5,6,7, היא דורשת עבודה אינטנסיבית. השיטה מבוססת FACS הוקמה משתמשת Hoechst 33342 (Ho342) כדי להפריד spermatocytes meiotic מבוסס על תוכן DNA ומאפייני פיזור אור ודורש סדרני תאים FACS מצויד אולטרה סגול (UV)לייזר 8,9,10,11. שיטות חלופיות מבוססות FACS דורשות קווי עכבר טרנסגניים המבטאים חלבוני פלורסנט, סנכרון של spermatogenesis12, או קיבעון תאים ותווית נוגדנים שאינם תואמים לבידוד של תאיםחיים 13. אמנם יש שיטה חלופית אחרת באמצעות צבע מחייב DNA חרוש תא, DyeCycle גריןכתם 14,15,16,17, שיטה זו מומלצת לבידוד של תאי זרע מאסכים צעירים. לכן, יש צורך קריטי לפתח שיטת בידוד פשוטה וחזקה עבור spermatocytes meiotic חי שניתן להחיל על כל זן העכבר בכל גיל, כי ניתן לבצע באמצעות כל סדרן תאים FACS.
כאן אנו מתארים פרוטוקול כזה ארוך זמן בידוד תאים באמצעות כתם סיגלית DyeCycle (DCV). DCV הוא cytotoxicity נמוך, תא חיר DNA מחייב צבע דומה מבנית Ho342 אבל עם ספקטרום עירור נע לכיוון טווח סגול18. בנוסף, DCV יש ספקטרום פליטה רחב יותר בהשוואה DCG. לכן, זה יכול להיות נרגש על ידי לייזרים UV וסגול, אשר משפר את הגמישות של ציוד, המאפשר את השימוש של סדרן תאים FACS לא מצויד בלייזר UV. פרוטוקול DCV המוצג כאן משתמש בהפרדה דו-ממדית עם כחול DCV ואדום DCV, המחקה את היתרון של פרוטוקול Ho342. עם יתרון זה, פרוטוקול DCV שלנו מאפשר לנו לבודד תאי נבט מועשר מאוד מן האשכים למבוגרים. אנו מספקים פרוטוקול גתור מפורט כדי לבודד תאי זרע חיים מאסחי עכבר בוגרים של עכבר אחד (משני אשכים). כמו כן, אנו מתארים פרוטוקול יעיל ומהיר להכנת השעיה חד-תאית מכיסכי עכבר שניתן להשתמש בהם לבידוד תא זה. ההליך דורש זמן קצר כדי להשלים (הכנה של מתלה תא יחיד - 1 שעה, כתמי צבע - 30 דקות, ומיון תאים - 2-3 שעות: סה"כ - 4-5 שעות בהתאם למספר התאים הדרושים; איור 1). לאחר בידוד תאים, ניתן להשלים מגוון רחב של יישומים במורד הזרם, כולל RNA-seq, ATAC-seq, ChIP-seq ותרבות תאים.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>1.5 ml tube</td>
			<td>Watson</td>
			<td>131-7155C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 mm Petri dish</td>
			<td>Corning, Falcon</td>
			<td>351029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL Centrifuge tube</td>
			<td>Watson</td>
			<td>1332-015S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 ml polystyrene tube with cell strainer snap cap (35 &#181;m nylon mesh)</td>
			<td>Corning, Falcon</td>
			<td>352235</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL Centrifuge tube</td>
			<td>Watson</td>
			<td>1342-050S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>60 mm Petri dish</td>
			<td>Corning, Falcon</td>
			<td>351007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70 &#181;m nylon mesh</td>
			<td>Corning, Falcon</td>
			<td>352350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell sorter</td>
			<td>Sony</td>
			<td>SH800S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase, recombinant, Animal-derived-free</td>
			<td>FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation</td>
			<td>036-23141</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase, Type 1</td>
			<td>Worthington</td>
			<td>LS004196</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cover glass</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>12-544-G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytospin 3</td>
			<td>Shandon</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI (4&#39;,6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride)</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>D1306</td>
			<td>working concentration: 0.1 &#956;g/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dnase I</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D5025-150KU</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey serum</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S30-M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s phosphate-buffered saline (DPBS)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium (DMEM)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11885076</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>16000044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hostone H1T antibody</td>
			<td>gift from Mary Ann Handel</td>
			<td></td>
			<td>1/2000 diluted</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hank&#8217;s balanced salt solution (HBSS)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14175095</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hyaluronidase from bovine testes</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H3506-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline (PBS)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P5493-4L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipettemen</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProLong Gold Antifade Mountant</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>P36930</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rH2AX antibody</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>05-635</td>
			<td>working concentration: 2 &#956;g/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sperm Fertilization Protein 56 (Sp56) antibody</td>
			<td>QED Bioscience</td>
			<td>55101</td>
			<td>working concentration: 0.5 &#956;g/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterilized forceps and scissors</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superfrost /Plus Microscope Slides</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>12-550-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYCP3 antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab205846</td>
			<td>working concentration: 5 &#956;g/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TWEEN 20 (Polysorbate 20)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P9416</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vybrant DyeCycle Violet Stain (DCV)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>V35003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of murine spermatogenic cells using a violet-excited cell-permeable dna binding dye

בידוד של spermatocytes מיוטי חיוני כדי לחקור מנגנונים מולקולריים הבסיסיים מיוזיס ו spermatogenesis. למרות שיש פרוטוקולי בידוד תאים הוקמה באמצעות ההכתמה Hoechst 33342 בשילוב עם מיון תאים המופעלים על-ידי פלואורסצנה, זה דורש סדרנים תא מצויד לייזר אולטרה סגול. כאן אנו מתארים פרוטוקול בידוד תאים באמצעות כתם סיגלית DyeCycle (DCV), צבע מחייב DNA cytotoxicity נמוך דומה מבנית Hoechst 33342. DCV יכול להתרגש הן על ידי לייזרים אולטרה סגולים והן סגול, אשר משפר את הגמישות של בחירת ציוד, כולל סדרן תאים לא מצויד בלייזר אולטרה סגול. באמצעות פרוטוקול זה, ניתן לבודד שלוש תת-אוכלוסיות של תאים חיים ב-prophase meiotic I, כולל לפטוטן/זיגוטן, פאצ'יטים, וזרעונים דיפלוטן, כמו גם זרעונים עגולים פוסט מיוטיים. אנו גם מתארים פרוטוקול להכנת השעיה חד-תאית מכיסכי עכבר. בסך הכל, ההליך דורש זמן קצר כדי להשלים (4-5 שעות בהתאם למספר התאים הדרושים), אשר מקל על יישומים רבים במורד הזרם.

תוצאה מייצגת של פרוטוקול מיון זה מוצגת באיון 3. זמן המיון הכולל של שני אשכים (עכבר אחד) הוא בדרך כלל סביב 3 שעות, אשר תלוי בריכוז של מתלי תא ומהירות המיון. לאחר מיון, הטוהר של spermatocytes מאושר על ידי immunostaining של SYCP3 ו ơH2AX (איור 3A). הטוהר המייצג של שברים של L/Z, P, D spermatocyte ?...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Murine Spermatogenic Cells using a Violet-Excited Cell-Permeable DNA Binding Dye at JoVE.com

Isolation of Murine Spermatogenic Cells using a Violet-Excited Cell-Permeable DNA Binding Dye

כאן אנו מציגים שיטה פשוטה ויעילה לבודד תאי חיידקים מיוטיים ופוסט-מיוטיים חיים מערכי עכבר בוגרים. באמצעות ציטוקסיות נמוכה, צבע מחייב DNA סגול-נרגש ומיון תאים המופעלים על-ידי פלואורסצנה, ניתן לבודד אוכלוסיות תאי זרע מועשרים מאוד עבור יישומים רבים במורד הזרם.

בידוד של תאי זרע מורין באמצעות צבע מחייב DNA סגול-נרגש תא חרוש

Isolation of meiotic spermatocytes is essential to investigate molecular mechanisms underlying meiosis and spermatogenesis. Although there are established ...

שיטה יעילה חדשה זו לבידוד subpopulations של spermatocytes ו spermatids מעכברים בוגרים ניתן להשתמש כדי לחקור את המנגנונים המולקולריים שבבסיס meiosis ו spermatogenesis. שיטה זו משתמשת בצבע מחייב DNA ציטוטוקסיות נמוך עם ספקטרום גירוי רחב שניתן להחיל על רוב ההזמנות המשמשות כיום FACS. שיטה זו היא פשוטה מאוד.ההיבט המאתגר ביותר הוא גתיון ציטומיית הזרימה, אך אסטרטגיית הגתות המפורטת אמורה לסייע בהתאמת הפרוטוקול למיון תאים אחרים. הפגנת ההליך תהיה יו-האן יה, עוזרת מחקר במעבדתו של סאטושי נמקאווה. לאחר קצירת שני האשכים מעכבר זכר בן שמונה שבועות, מניחים את הרקמות בצלחת פטרי 60 מילימטר המכיל שני מיליליטר של קרח קר PBS ולהסיר את אלבינאה טוניקה.מפרידים בעדינות את האשכים עם מדפים כדי לפזר מעט את הצינורות החצי-חצי-חצי. ולהעביר את הצינורות לתוך טיפה של PBS קר קרח טרי בצלחת פטרי 100 מילימטר. השתמש במטחנים כדי להתיר בעדינות את הצינוריות ולשטוף את הצינורות בשלוש טיפות נוספות של PBS כפי שהוכח רק.לאחר הכביסה האחרונה, מניחים את הצינורות החצי-חצי-בלתי-מגולסלים בצינור של 15 מיליליטר, המכיל שני מיליליטר של חיץ דיסוציאציה עבור דגירה של 20 דקות ב-37 מעלות צלזיוס. בסוף הדגירה, השתמש פיפיטה 1000 מיקרוליטר בעדינות pipette הצינורות 20 פעמים, לפני החזרת הצינור לאנקובטור במשך שש דקות נוספות. בסוף הדגירה, פיפטה את הרקמות 20 פעמים נוספות, לפני החזרת הצינור לאנקובטור.לאחר שלוש דקות, בעדינות pipette הצינורות 10 פעמים או עד לא חתיכות רקמה גלוי להישאר, לפני עצירת הדיסוציאציה עם 10 מיליליטר של חיץ FACS. לאחר מכן, צנטריפוגה ההשעיה רקמה פעמיים באמצעות 10 מיליליטר נוספים עבור חיץ FACS טרי עבור לשטוף השני כדי להסיר את spermatozoa וכמה שיותר פסולת ככל האפשר. כדי להכתים את התאים לניתוח ציטומטרי של זרימה, השהה מחדש את גלולת הכדור בשלושה מיליליטר של מאגר FACS.ולסנן את ההשעיה התא דרך מסננת תא ניילון 70 מיקרון, לתוך צינור 50 מיליליטר. לאחר הספירה, להעביר 10% מהתאים לתוך צינור חדש על הקרח כמו שליטה שלילית נגועה. ומערבבים ביסודיות שישה מיקרוליטרים של כתם DCV לתוך ההשעיה הנותרת של התא.לאחר דגירה של 30 דקות ב 37 מעלות צלזיוס בחושך עם רעידות עדינות כל 10 דקות, להוסיף חמישה microliters של DNase אני לתאים. ולסנן את התאים דרך מסננת רשת ניילון 35 מיקרון לתוך צינור FACS חמישה מיליליטר על קרח. לצורך ניתוח ציטומטרי של זרימה של התאים, צור ניסוי חדש בתוכנת ניתוח הזרימה ותחת תפריט כלי גליון העבודה, לחץ על צפיפות חדשה כדי ליצור אזור פיזור קדימה לעומת התוויית צפיפות אזור backscatter בקנה מידה ליניארי.לחץ על היסטוגרמה חדשה כדי ליצור התוויית היסטוגרמה בצבע כחול DCV בקנה מידה לוגריתמי. ולחץ על התחל והקליט כדי להתחיל לעבד את הדוגמה שאינה מוכתמת. בזמן שהדגימה פועלת, לחץ על הגדרות גלאי וסף כדי להתאים הן את מתחי PMT של פיזור קדימה והן לצד כדי למקם את התאים שאינם נגועים בסולם התוויית פיזור קדימה ואחיד.התאם את מתח PMT עבור ערוץ jappy כדי לאתר את המיקום של האוכלוסייה השלילית DCV בעשור הראשון של העלילה לוגריתמית היסטוגרמה כחול DCV. לאחר מכן, לחץ על עצור כדי לבטל את טעינת הדגימה שאינה נגועה. לאחר מערבולת קצרה וטעינת המדגם המוכתם, לחץ על הצינור הבא כדי ליצור גליון עבודה חדש עבור המדגם.הגדר את הציטרומטר לרכוש לפחות פעם אחת 10 עד ששת האירועים, ולחץ על התחל והקליט. לאחר מכן, לחץ על צפיפות חדשה כדי ליצור גובה פיזור קדימה לעומת רוחב פיזור קדימה. ו DCV כחול לעומת DCV צפיפות אדומה חלקות בקנה מידה ליניארי.באזור פיזור קדימה לעומת התוויית צפיפות אזור backscatter, השתמש בכלי מצולע כדי לצייר שער שנקרא תאים כדי לכלול את רוב התאים ולא לכלול פסולת קטנה. החל שער זה על גובה פיזור קדימה לעומת התוויית רוחב פיזור קדימה ולהשתמש בכלי המלבן כדי לצייר שער של תא בודד כדי לא לכלול תאים שאינם בודדים. החל את שער התא הבודד על התוויית הצפיפות האדומה DCV כחול לעומת DCV והתאם את קנה המידה כדי ללכוד פרופיל מורחב.השתמש בכלי מצולע כדי לצייר שער DCV כדי לא לכלול את התאים שאינם נגועים ואת אוכלוסיית הצד, ולהחיל את השער על התוויית היסטוגרמה כחולה DCV בקנה מידה ליניארי. שלוש הפסגות העיקריות מתייחסות לתכולת הדנ"א השונה של 1C, 2C ו- 4C. צור תרשים צפיפות אדום DCV שני לעומת DCV בקנה מידה ליניארי.ושער אחורי שער DCV על החלקה כדי לאתר את אוכלוסיות 1C ו 4C. צור תרשים נוסף של צפיפות אדומה בצבע כחול DCV לעומת DCV בקנה מידה ליניארי. ולהשתמש בכלי אליפסה כדי לצייר שער על האוכלוסייה 1C.השתמש בכלי מצולע כדי לשער את אוכלוסיית 4C עם עקומה רציפה. וליצור עוד התוויית צפיפות אדומה DCV כחול לעומת DCV בקנה מידה ליניארי. השתמש בכלי מצולע כדי ליצור שער אחד 4C.בחלקת פיזור חדשה קדימה, השתמש בכלי האליפסה כדי ליצור שערי פצ'יטן, דיפלוטן ולפטוטן, זיגוטן זרע. כאשר כל השערים צוירו, צור עלילה חדשה של נקודה בצבע כחול DCV לעומת DCV בצבע אדום בקנה מידה ליניארי כדי להחיל את השער עבור 4C כדי להבטיח ששלוש האוכלוסיות נמצאות בסדר מתמשך בתוך השער. לאחר מכן, צור אזור פיזור קדמי חדש לעומת התוויית צפיפות אזור backscatter בקנה מידה ליניארי, ובחר את הגודל המאוחד של תאים כאוכלוסיית זרע עגולה טהורה.לאחר המיון, הטהרונים הייצוגיים של שברי הלפטוטן המופרד, הזיגוטן, הפצ'יטן והדיפלוטן הם בדרך כלל בין 80% ל -90% כפי שאושרו על ידי SYCP3 ו- Gamma H2AX immunostaining. הטוהר של סיעת spermatid עגול יכול להיות מאושר על ידי כתמי גרעין עם DCV בשילוב עם Sp56 וכתמים H1t, והוא גם בדרך כלל סביב 90%הכדאיות של אוכלוסיות התאים המבודדים הוא בדרך כלל מעל 95%ואת התשואה הכוללת הממוצעת של כל שבר מעכבר מבוגר אחד הוא בדרך כלל מספיק לניתוח במורד הזרם שונים. התאים ממוינים יכול לשמש לניתוח רצף הדור הבא שונים כדי לחקור טוב יותר ביטוי גנים ורגולציה במהלך spermatogenesis.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Dual Labeling of Neural Crest Cells and Blood Vessels Within Chicken Embryos Using ChickGFP Neural Tube Grafting and Carbocyanine Dye DiI Injection

Dual Labeling of Neural Crest Cells and Blood Vessels Within Chicken Embryos Using ChickGFP Neural Tube Grafting and Carbocyanine Dye DiI Injection

תיוג כפול של תאי ציצה עצבית וכלי דם בתוך עוברי עוף באמצעות שתל צינור עצביGFP אפרוח והזרקת צבע DiI Carbocyanine

All developing organs need to be connected to both the nervous system (for sensory and motor control) as well as the vascular system (for gas exchange, ...

Murine Dermal Fibroblast Isolation by FACS

עכברי Dermal פיברובלסטים בידוד על ידי FACS

Fibroblasts are the principle cell type responsible for secreting extracellular matrix and are a critical component of many organs and tissues. Fibroblast ...

Isolation of Murine Embryonic Hemogenic Endothelial Cells

בידוד של Murine העוברי Hemogenic לתאי אנדותל

The specification of hemogenic endothelial cells from embryonic vascular endothelium occurs during brief developmental periods within distinct tissues, ...

Isolation and Expansion of Mesenchymal Stem/Stromal Cells Derived from Human Placenta Tissue

בידוד הרחבת גזע mesenchymal / תאי סטרומה נגזרו רקמה אנושית שליה

Mesenchymal stem/stromal cells (MSC) are promising candidates for use in cell-based therapies. In most cases, therapeutic response appears to be cell-dose ...

The Production of Pluripotent Stem Cells from Mouse Amniotic Fluid Cells Using a Transposon System

את ייצור תאי גזע פלוריפוטנטיים מתאי מי שפירים עכבר באמצעות מערכת transposon

Induced pluripotent stem (iPS) cells are generated from mouse and human somatic cells by forced expression of defined transcription factors using ...

Horizontal Whole Mount: A Novel Processing and Imaging Protocol for Thick, Three-dimensional Tissue Cross-sections of Skin

אופקי הר שלם: עיבוד רומן פרוטוקול הדמיה על רקמה עבה, תלת מימדי חתכים של העור

Processing a tissue of interest to generate a microscopic image that supports a scientific argument can be challenging. The acquisition of high-quality ...

Isolation of Human Endometrial Stromal Cells for In Vitro Decidualization

Isolation of Human Endometrial Stromal Cells for In Vitro Decidualization

לבידוד של תאי סטרומה רירית הרחם אדם במבחנה Decidualization

The differentiation of human endometrial stromal cells (HESC) from fibroblast-like appearance into secretory decidua is a transformation required for ...

Computational Analysis of the Caenorhabditis elegans Germline to Study the Distribution of Nuclei, Proteins, and the Cytoskeleton

Computational Analysis of the Caenorhabditis elegans Germline to Study the Distribution of Nuclei, Proteins, and the Cytoskeleton

ניתוח חישובית של Germline Caenorhabditis elegans ללמוד הפצה של גרעינים, חלבונים ו את שלד התא

The Caenorhabditis elegans (C. elegans) germline is used to study several biologically important processes including stem cell development, apoptosis, and ...

In Vitro Generation of Somite Derivatives from Human Induced Pluripotent Stem Cells

בדור חוץ גופית של Somite נגזרים מן האדם המושרה בתאי גזע Pluripotent

In response to signals such as WNTs, bone morphogenetic proteins (BMPs), and sonic hedgehog (SHH) secreted from surrounding tissues, somites (SMs) give ...

Three-dimensional Angiogenesis Assay System using Co-culture Spheroids Formed by Endothelial Colony Forming Cells and Mesenchymal Stem Cells

3-מימדי אנגיוגנזה שיטת מערכת באמצעות Spheroids שיתוף תרבות נוצר על ידי ויוצרים מושבת המושבה תאים ותאי גזע Mesenchymal

Studies in the field of angiogenesis have been aggressively growing in the last few decades with the recognition that angiogenesis is a hallmark of more ...