Name: isolation of murine spermatogenic cells using a violet-excited cell-permeable dna binding dye
Uploaded: 2021-01-14T13:00:00
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名川、吉田、前沢の研究室のメンバーの皆さんに、ご協力いただき、ありがとうございました。原稿を編集するためのケイティ・ゲルハルト;H1T抗体を共有するためのメアリー・アン・ヘンデル、シンシナティ小児病院医療センター(CCHMC)研究フローサイトメトリーコアは、NIH S10OD023410がサポートするFACS機器を共有するための。科学研究のための助成(KAKENHI;17K07424)からT.N.へ。ラロール財団A.S.へのポスドクフェローシップ;アメド・クレスト(JP17gm1110005h00001)からS.Y.へ;麻布大学研究サービス部、文部科学省(MEXT)支援の私立大学研究ブランディング事業(2016~2019年)支援プログラム、研究活動立ち上げ助成(19K21196)、武田科学財団(2019年)、上原記念財団研究奨励助成(20.M 18)による研究プロジェクト助成金国立衛生研究所 R01 GM122776 to S.H.N.

このプロトコルは、制度的動物の世話と使用委員会のガイドラインに従います(プロトコルいいえ。IACUC2018-0040)シンシナティ小児病院医療センターで。
精巣細胞懸濁液の調製のための装置および試薬のセットアップ
<ol><li>各酵素ストックを1xハンクスバランスソルト溶液(HBSS)で準備し、-20°C(表1)に保管する。 注: 実験の前にいつでも準備してください。</li...

<ol>
	<li>Griswold, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spermatogenesis:+The+Commitment+to+Meiosis.">Spermatogenesis: The Commitment to Meiosis.</a> Physiological Reviews. 96 (1), 1-17 (2016).</li><li>Yoshida, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+Spermatogenesis+Reflects+the+Unity+and+Diversity+of+Tissue+Stem+Cell+Niche+Systems.">Mouse Spermatogenesis Reflects the Unity and Diversity of Tissue Stem Cell Niche Systems.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. , 036186 (2020).</li><li>Rathke, C., Baarends, W. 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D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-type-specific+genomics+reveals+histone+modification+dynamics+in+mammalian+meiosis.">Cell-type-specific genomics reveals histone modification dynamics in mammalian meiosis.</a> Nature Communications. 10 (1), 3821 (2019).</li><li>Geisinger, A., Rodriguez-Casuriaga, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+Cytometry+for+the+Isolation+and+Characterization+of+Rodent+Meiocytes.">Flow Cytometry for the Isolation and Characterization of Rodent Meiocytes.</a> Methods in Molecular Biology. 1471, 217-230 (2017).</li><li>da Cruz, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptome+analysis+of+highly+purified+mouse+spermatogenic+cell+populations:+gene+expression+signatures+switch+from+meiotic-to+postmeiotic-related+processes+at+pachytene+stage.">Transcriptome analysis of highly purified mouse spermatogenic cell populations: gene expression signatures switch from meiotic-to postmeiotic-related processes at pachytene stage.</a> BMC Genomics. 17, 294 (2016).</li><li>Rodriguez-Casuriaga, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+preparation+of+rodent+testicular+cell+suspensions+and+spermatogenic+stages+purification+by+flow+cytometry+using+a+novel+blue-laser-excitable+vital+dye.">Rapid preparation of rodent testicular cell suspensions and spermatogenic stages purification by flow cytometry using a novel blue-laser-excitable vital dye.</a> MethodsX. 1, 239-243 (2014).</li><li>Trovero, M. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Revealing+stage-specific+expression+patterns+of+long+noncoding+RNAs+along+mouse+spermatogenesis.">Revealing stage-specific expression patterns of long noncoding RNAs along mouse spermatogenesis.</a> RNA Biology. 17 (3), 350-365 (2020).</li><li>Telford, W. G., Bradford, J., Godfrey, W., Robey, R. W., Bates, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Side+population+analysis+using+a+violet-excited+cell-permeable+DNA+binding+dye.">Side population analysis using a violet-excited cell-permeable DNA binding dye.</a> Stem Cells. 25 (4), 1029-1036 (2007).</li><li>Alavattam, K. G., Abe, H., Sakashita, A., Namekawa, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromosome+Spread+Analyses+of+Meiotic+Sex+Chromosome+Inactivation.">Chromosome Spread Analyses of Meiotic Sex Chromosome Inactivation.</a> Methods in Molecular Biology. 1861, 113-129 (2018).</li><li>Maezawa, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Super-enhancer+switching+drives+a+burst+in+gene+expression+at+the+mitosis-to-meiosis+transition.">Super-enhancer switching drives a burst in gene expression at the mitosis-to-meiosis transition.</a> Nature Structural &amp; Molecular Biology. , (2020).</li><li>Sakashita, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endogenous+retroviruses+drive+species-specific+germline+transcriptomes+in+mammals.">Endogenous retroviruses drive species-specific germline transcriptomes in mammals.</a> Nature Structural &amp; Molecular Biology. , (2020).</li><li>Agrimson, K. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterizing+the+Spermatogonial+Response+to+Retinoic+Acid+During+the+Onset+of+Spermatogenesis+and+Following+Synchronization+in+the+Neonatal+Mouse+Testis.">Characterizing the Spermatogonial Response to Retinoic Acid During the Onset of Spermatogenesis and Following Synchronization in the Neonatal Mouse Testis.</a> Biology of Reproduction. 95 (4), 81 (2016).</li><li>Hogarth, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Turning+a+spermatogenic+wave+into+a+tsunami:+synchronizing+murine+spermatogenesis+using+WIN+18,446.">Turning a spermatogenic wave into a tsunami: synchronizing murine spermatogenesis using WIN 18,446.</a> Biology of Reproduction. 88 (2), 40 (2013).</li><li>Patel, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+reorganization+of+the+genome+shapes+the+recombination+landscape+in+meiotic+prophase.">Dynamic reorganization of the genome shapes the recombination landscape in meiotic prophase.</a> Nature Structural &amp; Molecular Biology. 26 (3), 164-174 (2019).</li><li>Alavattam, K. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Attenuated+chromatin+compartmentalization+in+meiosis+and+its+maturation+in+sperm+development.">Attenuated chromatin compartmentalization in meiosis and its maturation in sperm development.</a> Nature Structural &amp; Molecular Biology. 26 (3), 175-184 (2019).</li><li>Adams, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNF8+and+SCML2+cooperate+to+regulate+ubiquitination+and+H3K27+acetylation+for+escape+gene+activation+on+the+sex+chromosomes.">RNF8 and SCML2 cooperate to regulate ubiquitination and H3K27 acetylation for escape gene activation on the sex chromosomes.</a> PLoS Genetics. 14 (2), 1007233 (2018).</li><li>Wiltshire, T., Park, C., Caldwell, K. A., Handel, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induced+premature+G2/M-phase+transition+in+pachytene+spermatocytes+includes+events+unique+to+meiosis.">Induced premature G2/M-phase transition in pachytene spermatocytes includes events unique to meiosis.</a> Developmental Biology. 169 (2), 557-567 (1995).</li></ol>

ここでは、単一の成人男性マウスから精子と精子の亜集団を分離するための実用的で簡単なプロトコルを提示する。このプロトコルの再現性を確保するために、注意が必要な重要な手順がいくつかあります。酵素消化の前に、洗浄ステップは間質細胞を除去することを目的としている。消化後、このステップは精子や破片を除去するのに役立ちます。洗浄/遠心分離3回が重要です。当社の解?...

精子形成は、精子幹細胞の小集団が成人期を通じて多数の精子の連続的産生を1,2に持続する複雑なプロセスである。精子形成の間に、動的クロマチンリモデリングは、精子原性細胞が子宮内膜を産生するために、3、4、5を産生するために、ミオサシスを受けたときに起こる。メオティック精子細胞の単離は分子学的調査に不可欠であり、沈め込みベースの分離6、7、蛍光活性化細胞選別(FACS)8、9、10、11、12、13、14、15、16、17を含む、複数の異なるアプローチが確立されている。ただし、これらの方法には技術的な制限があります。沈下法による分離は、5、6、7の細胞を多数生成する一方で、労働集約的である。確立されたFACSベースの方法は、DNA含有量および光散乱特性に基づいて微量精子細胞を分離するためにHoechst 33342(Ho342)を使用し、紫外線(UV)レーザー8、9、10、11を備えたFACS細胞選別機を必要とする。代替FACSベースの方法は、蛍光タンパク質を発現するトランスジェニックマウスライン、精子形成12の同期、または生細胞13の単離と互換性のない細胞固定および抗体標識を必要とする。細胞透過性DNA結合色素を用いた別の方法があるが、DyeCycleグリーン染色14、15、16、17のこの方法は、若年精巣から精子細胞を単離するために推奨される。したがって、任意の年齢の任意のマウス株に適用することができ、任意のFACS細胞選別機を使用して実行することができる生きている病変精子細胞のための単純で堅牢な分離方法を開発することが重要な必要性があります。
ここでは、DyeCycleバイオレット(DCV)染色を用いた、このような長い間求められていた細胞分離プロトコルについて説明する。DCVは、低細胞毒性、細胞透過性DNA結合色素はHo342に構造的に類似しているが、励起スペクトルが紫範囲18に向かってシフトしている。さらに、DCVはDCGに比べて広い発光スペクトルを有する。したがって、UVと紫の両方のレーザーで励起することができ、それは、UVレーザーを装備していないFACSセルソーターの使用を可能にする、機器の柔軟性を向上させます。ここで示すDCVプロトコルは、DCVブルーとDCVレッドとの2次元分離を使用し、Ho342プロトコルの利点を模倣しています。この利点により、当社のDCVプロトコルは、成人精巣から高度に濃縮された生殖細胞を分離することを可能にします。我々は、1匹のマウスの成体マウス精巣(2つの精巣から)から生きた精子細胞を分離するための詳細な格言プロトコルを提供する。また、この細胞分離に使用できるマウスのテストからの単一細胞の中断を準備するための効率的かつ迅速なプロトコルについても説明します。手順は、完了する短い時間を必要とします (単一細胞の懸濁液の調製 - 1時間、染料染色 - 30分、および細胞のソート - 2-3時間:合計 - 必要な細胞の数に応じて4〜5時間; 図 1)。細胞分離後、RNA-セク、ATAC-セク、ChIP-セク、および細胞培養を含む広範な下流アプリケーションを完了することができます。

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>1.5 ml tube</td>
			<td>Watson</td>
			<td>131-7155C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 mm Petri dish</td>
			<td>Corning, Falcon</td>
			<td>351029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL Centrifuge tube</td>
			<td>Watson</td>
			<td>1332-015S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 ml polystyrene tube with cell strainer snap cap (35 &#181;m nylon mesh)</td>
			<td>Corning, Falcon</td>
			<td>352235</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL Centrifuge tube</td>
			<td>Watson</td>
			<td>1342-050S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>60 mm Petri dish</td>
			<td>Corning, Falcon</td>
			<td>351007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70 &#181;m nylon mesh</td>
			<td>Corning, Falcon</td>
			<td>352350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell sorter</td>
			<td>Sony</td>
			<td>SH800S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase, recombinant, Animal-derived-free</td>
			<td>FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation</td>
			<td>036-23141</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase, Type 1</td>
			<td>Worthington</td>
			<td>LS004196</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cover glass</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>12-544-G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytospin 3</td>
			<td>Shandon</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI (4&#39;,6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride)</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>D1306</td>
			<td>working concentration: 0.1 &#956;g/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dnase I</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D5025-150KU</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey serum</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S30-M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s phosphate-buffered saline (DPBS)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium (DMEM)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11885076</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>16000044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hostone H1T antibody</td>
			<td>gift from Mary Ann Handel</td>
			<td></td>
			<td>1/2000 diluted</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hank&#8217;s balanced salt solution (HBSS)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14175095</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hyaluronidase from bovine testes</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H3506-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline (PBS)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P5493-4L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipettemen</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProLong Gold Antifade Mountant</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>P36930</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rH2AX antibody</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>05-635</td>
			<td>working concentration: 2 &#956;g/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sperm Fertilization Protein 56 (Sp56) antibody</td>
			<td>QED Bioscience</td>
			<td>55101</td>
			<td>working concentration: 0.5 &#956;g/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterilized forceps and scissors</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superfrost /Plus Microscope Slides</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>12-550-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYCP3 antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab205846</td>
			<td>working concentration: 5 &#956;g/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TWEEN 20 (Polysorbate 20)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P9416</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vybrant DyeCycle Violet Stain (DCV)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>V35003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of murine spermatogenic cells using a violet-excited cell-permeable dna binding dye

メオティック精子細胞の単離は、疾患の根底にある分子メカニズムと精子形成を調べる上で不可欠である。蛍光活性化細胞選別と組み合わせてHoechst 33342染色を使用して確立された細胞分離プロトコルがありますが、紫外線レーザーを装備した細胞選別機が必要です。ここでは、ヘヒスト33342と構造的に類似した低細胞毒性DNA結合色素であるDyeCycle Violet(DCV)染色を用いた細胞分離プロトコルについて説明する。DCVは紫外線レーザーと紫レーザーの両方で励起することができ、紫外線レーザーを搭載していないセルソーターを含む機器の選択の柔軟性を向上させます。このプロトコルを使用すると、レプトテン/ジゴテン、パキテン、ジプロテン精子細胞、およびポストマイオティックラウンド精子を含む、マイオティックプロフェイズIの3つの生細胞亜集団を分離することができます。また、マウスの精巣からの単細胞の中断を準備するプロトコルについても述べた。全体的に見て、この手順は、多くの下流のアプリケーションを容易にする(必要な細胞の数に応じて4〜5時間)完了するまでに短い時間を必要とします。

この分類プロトコルの代表的な結果を図 3に示します。2つの精巣(1つのマウス)の総選別時間は、通常、細胞懸濁液の濃度と並べ替え速度に依存する約3時間である。選別後、SYCP3およびγH2AXの免疫染色により精子細胞の純度が確認される(図3A)。並べ替えられたL/Z、P、D精子の分画の代表純度は、それぞれ約80.4%、90.6%、および87.6%である(<strong class="xfi...

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Isolation of Murine Spermatogenic Cells using a Violet-Excited Cell-Permeable DNA Binding Dye

ここでは、成人マウス精巣から生の大腸および後の大動脈芽細胞を分離する簡単で効率的な方法を提示する。低細胞毒性、バイオレット励起DNA結合色素および蛍光活性化細胞選別を使用して、多くの下流用途に対して非常に富んだ精子細胞集団を単離することができる。

バイオレット励起細胞透過性DNA結合色素を用いたマウス精子細胞の分離

Isolation of meiotic spermatocytes is essential to investigate molecular mechanisms underlying meiosis and spermatogenesis. Although there are established ...

この新しい効率的な方法は、成人マウスから精子細胞および精子の亜集団を単離するために使用され、明腫および精子形成の根底にある分子メカニズムを調べることができる。この方法は、現在使用されているFACSオーダーのほとんどに適用できる広い励起スペクトルを有する低細胞毒性DNA結合色素を使用する。この方法は非常に簡単です。最も困難な側面はフローサイトメトリー格子測定ですが、詳細な格子戦略は、プロトコルを他の細胞選別機に適応させるのに役立つはずです。この手順のデモンストレーションは、名川聡研究室の研究助手、ユハン・イェです。生後8週間の雄マウスから両方の精巣を採取した後、2ミリリットルの氷冷PBSを含む60ミリメートルのペトリ皿に組織を入れ、チュニカアルブギネアを取り除きます。精巣を鉗子でそっと分離し、半細管をわずかに分散させます。そして、100ミリメートルペトリ皿で新鮮な氷冷PBSの滴に尿細管を転送します。鉗子を使用して管状をそっと解き、ちょうど実証したようにPBSの3つの追加の液滴で管を洗います。最後の洗浄の後、37°Cで20分のインキュベーションのために解離緩衝液の2ミリリットルを含む15ミリリットルのチューブに解離されていない半細管を置きます。インキュベーションの最後に、1000マイクロリットルのピペットを使用して細管を20回軽くピペットし、チューブをインキュベーターにさらに6分間戻します。インキュベートの終わりに、チューブをインキュベーターに戻す前に、さらに20回組織をピペットする。3分後、10ミリリットルのFACSバッファーとの解離を停止する前に、尿細管を10回、または目に見えない組織片が残らないまで静かにピペットします。次いで、2回目の洗浄のために新しいFACSバッファーに対して追加の10ミリリットルを使用して組織懸濁液に遠心分離し、精子およびできるだけ多くの破片を除去する。フローサイトメトリック解析のために細胞を染色するには、ペレットをFACSバッファーの3ミリリットルに再懸濁します。そして、70ミクロンのナイロンセルストレーナーを通して、50ミリリットルのチューブに細胞懸濁液をろ過します。カウント後、細胞の10%を氷上の新しいチューブに移し、染色されていない陰性対照として。そして、DCV染色の6マイクロリットルを残りの細胞懸濁液に十分に混合する。暗闇の中で摂氏37度で30分のインキュベーションを行い、10分ごとに穏やかな揺れを起わせた後、5マイクロリットルのDNase Iを細胞に加えます。そして、氷の上の5ミリリットルのFACSチューブに35ミクロンのナイロンメッシュストレーナーを通して細胞をフィルタリングします。セルのフローサイトメトリック解析では、フロー解析ソフトウェアで新しい実験を作成し、ワークシート ツール メニューで新しい密度をクリックして、線形スケールで前方散乱領域と後方散乱領域密度プロットを作成します。新しいヒストグラムをクリックして、対数スケール上に DCV ブルーヒストグラム プロットを作成します。そして、開始と記録をクリックして、染色されていないサンプルの処理を開始します。サンプルの実行中に、検出器としきい値の設定をクリックして、前方散乱と側面の両方の散乱PMT電圧を調整して、未染色セルを前方および背面散乱プロットのスケールに配置します。DCVブルーヒストグラム対数プロットの最初の10年間にDCV負母集団の位置を見つけるには、ジャッピーチャンネルのPMT電圧を調整します。次に、[停止] をクリックして、染色されていないサンプルをアンロードします。染色したサンプルを短時間でボルテックスしてロードした後、次のチューブをクリックして、サンプル用の新しいワークシートを作成します。6つのイベントに対して少なくとも10回取得するようにサイトメーターを設定し、[開始]と[記録]をクリックします。次に、[新しい密度] をクリックして、前方スキャッタの高さと前方のスキャッタ幅を作成します。そして、線形スケールでDCVブルー対DCV赤色密度プロット。前方散乱領域と後方散乱領域密度プロットでは、ポリゴンツールを使用してセルと呼ばれるゲートを描画し、ほとんどのセルを含め、小さな破片を除外します。このゲートを前方散乱高さプロットと前方散乱幅プロットに適用し、長方形ツールを使用して単一セルのゲートを描画し、単一セル以外のセルを除外します。単一セルのゲートをDCVブルーとDCVの赤色密度プロットに適用し、拡張プロファイルをキャプチャするようにスケールを調整します。ポリゴン ツールを使用して DCV ゲートを描画し、染色されていないセルとサイドの母集団を除外し、ゲートを線形スケールで DCV ブルーヒストグラム プロットに適用します。3つの主要なピークは、異なる1C、2Cおよび4C DNA内容物を指す。線形スケールで、第2のDCVブルーとDCV赤色密度プロットを作成します。そして、1Cと4Cの集団を見つけるためにプロットにDCVゲートをバックゲートします。線形スケールで別のDCVブルーとDCV赤色密度プロットを作成します。楕円ツールを使用して、1C の人口にゲートを描画します。ポリゴン ツールを使用して、4C の人口を連続曲線でゲートします。そして線形スケールで別のDCVブルー対DCV赤色密度プロットを作成します。ポリゴン ツールを使用して、4C の 1 つのゲートを作成します。新しい前方散布図では、楕円ツールを使用して、パキテン、ジプロテン、レプトテン、ジゴテン精子細胞のゲートを作成します。すべてのゲートが描画されたら、線形スケールで新しい DCV ブルーと DCV の赤色のカラー ドット プロットを作成し、4C ゲートを適用して、3 つの母集団がゲート内で連続した順序になるようにします。次に、線形スケールで新しい前方散乱面積対後散乱面積密度プロットを作成し、純粋な円形の精子集団として細胞の統一サイズを選択します。選別後、分離されたレプトテン、ジゴテン、パキテンおよびジプロテン精子細胞画の代表的な純粋度は、典型的には、SYCP3およびΓH2AX免疫染色によって確認されるように80%〜90%の間である。丸い精子の固さを確認するには、Sp56およびH1t染色と組み合わせてDCVによる核染色を行い、また、通常90%程度であり、単離細胞集団の生存率は通常95%を超えており、一つの成体マウスからの各分画の平均総収量は、通常、様々な下流分析に十分である。ソートされた細胞は、精子形成中の遺伝子発現および調節をよりよく探求するために、様々な次世代シーケンシング分析に使用することができる。

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Dual Labeling of Neural Crest Cells and Blood Vessels Within Chicken Embryos Using ChickGFP Neural Tube Grafting and Carbocyanine Dye DiI Injection

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鶏の胚内の神経堤細胞と血管の二重標識は、ひよこGFP 神経管移植とカルボシアニンDyI注射を用いた

All developing organs need to be connected to both the nervous system (for sensory and motor control) as well as the vascular system (for gas exchange, ...

Murine Dermal Fibroblast Isolation by FACS

FACSによるマウス皮膚線維芽細胞の分離

Fibroblasts are the principle cell type responsible for secreting extracellular matrix and are a critical component of many organs and tissues. Fibroblast ...

Isolation of Murine Embryonic Hemogenic Endothelial Cells

マウス胚性造血内皮細胞の単離

The specification of hemogenic endothelial cells from embryonic vascular endothelium occurs during brief developmental periods within distinct tissues, ...

Isolation and Expansion of Mesenchymal Stem/Stromal Cells Derived from Human Placenta Tissue

単離およびヒト胎盤組織由来の間葉系幹/間質細胞の増殖

Mesenchymal stem/stromal cells (MSC) are promising candidates for use in cell-based therapies. In most cases, therapeutic response appears to be cell-dose ...

The Production of Pluripotent Stem Cells from Mouse Amniotic Fluid Cells Using a Transposon System

トランスポゾンのシステムを用いたマウスの羊水細胞から多能性幹細胞の作製

Induced pluripotent stem (iPS) cells are generated from mouse and human somatic cells by forced expression of defined transcription factors using ...

Horizontal Whole Mount: A Novel Processing and Imaging Protocol for Thick, Three-dimensional Tissue Cross-sections of Skin

水平全マウント：皮膚の厚い3次元組織断面のための新規処理および画像化プロトコール

Processing a tissue of interest to generate a microscopic image that supports a scientific argument can be challenging. The acquisition of high-quality ...

Isolation of Human Endometrial Stromal Cells for In Vitro Decidualization

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エストロージェン体外用ひと子宮内膜間質細胞の分離

The differentiation of human endometrial stromal cells (HESC) from fibroblast-like appearance into secretory decidua is a transformation required for ...

Computational Analysis of the Caenorhabditis elegans Germline to Study the Distribution of Nuclei, Proteins, and the Cytoskeleton

Computational Analysis of the Caenorhabditis elegans Germline to Study the Distribution of Nuclei, Proteins, and the Cytoskeleton

核の分布、蛋白質および細胞骨格を研究する線虫生殖細胞の解析

The Caenorhabditis elegans (C. elegans) germline is used to study several biologically important processes including stem cell development, apoptosis, and ...

In Vitro Generation of Somite Derivatives from Human Induced Pluripotent Stem Cells

体節誘導体誘導される人間からの体外世代多能性幹細胞します。

In response to signals such as WNTs, bone morphogenetic proteins (BMPs), and sonic hedgehog (SHH) secreted from surrounding tissues, somites (SMs) give ...

Three-dimensional Angiogenesis Assay System using Co-culture Spheroids Formed by Endothelial Colony Forming Cells and Mesenchymal Stem Cells

内皮コロニー形成細胞と間葉系幹細胞によって形成された共培養スフェロイドを用いた3次元血管新生アッセイ系

Studies in the field of angiogenesis have been aggressively growing in the last few decades with the recognition that angiogenesis is a hallmark of more ...