Name: isolation of murine spermatogenic cells using a violet-excited cell-permeable dna binding dye
Uploaded: 2021-01-14T13:00:00
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네카와, 요시다, 마에자와 연구소 회원들에게 도움을 주신 것에 감사드립니다. 원고편집을 위한 케이티 게르하르트; H1T 항체를 공유하기위한 메리 앤 헨델, 신시내티 아동 병원 의료 센터 (CCHMC) NIH S10OD023410에 의해 지원 되는 FACS 장비를 공유 하기 위한 연구 흐름 사이토 메 트리 코어; 과학 연구를 위한 보조금 지원 (KAKENHI; 17K07424) T.N.에; Lalor 재단 박사 후 A.S.에 대한 펠로우십; AMED-CREST (JP17gm110005h00001) - S.Y.; 아자부대학 연구서비스부, 교육부, 문화체육과학기술부(MEXT) 지원 프로그램 (2016~2019), 연구활동 스타트업 보조금 지원(19K21196), 다케다과학재단(2019), 우에하라재단(2019년.M) 건강의 국립 연구소 R01 GM122776 에 S.H.N.

이 프로토콜은 기관 동물 관리 및 사용 위원회의 지침을 따릅니다 (프로토콜 번호. IACUC2018-0040) 신시내티 아동 병원 의료 센터에서.
1. 고환 세포 현탁액의 준비를위한 장비 및 시약 설정
<ol><li>각 효소 육수를 1x 행크스의 균형 잡힌 소금 용액(HBSS)으로준비하고 -20°C(표1)에 보관하십시오. 참고: 실험 전에 언제든지 준비합니다.</li>
	<li>실험 하루 전: 하룻밤 4°C에...

<ol>
	<li>Griswold, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spermatogenesis:+The+Commitment+to+Meiosis.">Spermatogenesis: The Commitment to Meiosis.</a> Physiological Reviews. 96 (1), 1-17 (2016).</li><li>Yoshida, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+Spermatogenesis+Reflects+the+Unity+and+Diversity+of+Tissue+Stem+Cell+Niche+Systems.">Mouse Spermatogenesis Reflects the Unity and Diversity of Tissue Stem Cell Niche Systems.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. , 036186 (2020).</li><li>Rathke, C., Baarends, W. M., Awe, S., Renkawitz-Pohl, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromatin+dynamics+during+spermiogenesis.">Chromatin dynamics during spermiogenesis.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1839 (3), 155-168 (2014).</li><li>Maezawa, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SCML2+promotes+heterochromatin+organization+in+late+spermatogenesis.">SCML2 promotes heterochromatin organization in late spermatogenesis.</a> Journal of Cell Science. 131 (17), 217125 (2018).</li><li>Maezawa, S., Yukawa, M., Alavattam, K. G., Barski, A., Namekawa, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+reorganization+of+open+chromatin+underlies+diverse+transcriptomes+during+spermatogenesis.">Dynamic reorganization of open chromatin underlies diverse transcriptomes during spermatogenesis.</a> Nucleic Acids Research. 46 (2), 593-608 (2018).</li><li>Bellve, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification,+culture,+and+fractionation+of+spermatogenic+cells.">Purification, culture, and fractionation of spermatogenic cells.</a> Methods in Enzymology. 225, 84-113 (1993).</li><li>Bryant, J. M., Meyer-Ficca, M. L., Dang, V. M., Berger, S. L., Meyer, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Separation+of+spermatogenic+cell+types+using+STA-PUT+velocity+sedimentation.">Separation of spermatogenic cell types using STA-PUT velocity sedimentation.</a> Journal of Visualized Experiments. (80), e50648 (2013).</li><li>Gaysinskaya, V., Bortvin, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometry+of+murine+spermatocytes.">Flow cytometry of murine spermatocytes.</a> Current Protocols in Cytometry. 72, (2015).</li><li>Bastos, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometric+characterization+of+viable+meiotic+and+postmeiotic+cells+by+Hoechst+33342+in+mouse+spermatogenesis.">Flow cytometric characterization of viable meiotic and postmeiotic cells by Hoechst 33342 in mouse spermatogenesis.</a> Cytometry Part A. 65 (1), 40-49 (2005).</li><li>Getun, I. V., Torres, B., Bois, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometry+purification+of+mouse+meiotic+cells.">Flow cytometry purification of mouse meiotic cells.</a> Journal of Visualized Experimments. (50), e2602 (2011).</li><li>Gaysinskaya, V., Soh, I. Y., van der Heijden, G. W., Bortvin, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimized+flow+cytometry+isolation+of+murine+spermatocytes.">Optimized flow cytometry isolation of murine spermatocytes.</a> Cytometry Part A. 85 (6), 556-565 (2014).</li><li>Romer, K. A., de Rooiji, D. G., Kojima, M. L., Page, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolating+mitotic+and+meiotic+germ+cells+from+male+mice+by+developmental+synchronization,+staging,+and+sorting.">Isolating mitotic and meiotic germ cells from male mice by developmental synchronization, staging, and sorting.</a> Developmental Biology. 443 (1), 19-34 (2018).</li><li>Lam, K. G., Brick, K., Cheng, G., Pratto, F., Camerini-Otero, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-type-specific+genomics+reveals+histone+modification+dynamics+in+mammalian+meiosis.">Cell-type-specific genomics reveals histone modification dynamics in mammalian meiosis.</a> Nature Communications. 10 (1), 3821 (2019).</li><li>Geisinger, A., Rodriguez-Casuriaga, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+Cytometry+for+the+Isolation+and+Characterization+of+Rodent+Meiocytes.">Flow Cytometry for the Isolation and Characterization of Rodent Meiocytes.</a> Methods in Molecular Biology. 1471, 217-230 (2017).</li><li>da Cruz, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptome+analysis+of+highly+purified+mouse+spermatogenic+cell+populations:+gene+expression+signatures+switch+from+meiotic-to+postmeiotic-related+processes+at+pachytene+stage.">Transcriptome analysis of highly purified mouse spermatogenic cell populations: gene expression signatures switch from meiotic-to postmeiotic-related processes at pachytene stage.</a> BMC Genomics. 17, 294 (2016).</li><li>Rodriguez-Casuriaga, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+preparation+of+rodent+testicular+cell+suspensions+and+spermatogenic+stages+purification+by+flow+cytometry+using+a+novel+blue-laser-excitable+vital+dye.">Rapid preparation of rodent testicular cell suspensions and spermatogenic stages purification by flow cytometry using a novel blue-laser-excitable vital dye.</a> MethodsX. 1, 239-243 (2014).</li><li>Trovero, M. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Revealing+stage-specific+expression+patterns+of+long+noncoding+RNAs+along+mouse+spermatogenesis.">Revealing stage-specific expression patterns of long noncoding RNAs along mouse spermatogenesis.</a> RNA Biology. 17 (3), 350-365 (2020).</li><li>Telford, W. G., Bradford, J., Godfrey, W., Robey, R. W., Bates, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Side+population+analysis+using+a+violet-excited+cell-permeable+DNA+binding+dye.">Side population analysis using a violet-excited cell-permeable DNA binding dye.</a> Stem Cells. 25 (4), 1029-1036 (2007).</li><li>Alavattam, K. G., Abe, H., Sakashita, A., Namekawa, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromosome+Spread+Analyses+of+Meiotic+Sex+Chromosome+Inactivation.">Chromosome Spread Analyses of Meiotic Sex Chromosome Inactivation.</a> Methods in Molecular Biology. 1861, 113-129 (2018).</li><li>Maezawa, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Super-enhancer+switching+drives+a+burst+in+gene+expression+at+the+mitosis-to-meiosis+transition.">Super-enhancer switching drives a burst in gene expression at the mitosis-to-meiosis transition.</a> Nature Structural &amp; Molecular Biology. , (2020).</li><li>Sakashita, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endogenous+retroviruses+drive+species-specific+germline+transcriptomes+in+mammals.">Endogenous retroviruses drive species-specific germline transcriptomes in mammals.</a> Nature Structural &amp; Molecular Biology. , (2020).</li><li>Agrimson, K. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterizing+the+Spermatogonial+Response+to+Retinoic+Acid+During+the+Onset+of+Spermatogenesis+and+Following+Synchronization+in+the+Neonatal+Mouse+Testis.">Characterizing the Spermatogonial Response to Retinoic Acid During the Onset of Spermatogenesis and Following Synchronization in the Neonatal Mouse Testis.</a> Biology of Reproduction. 95 (4), 81 (2016).</li><li>Hogarth, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Turning+a+spermatogenic+wave+into+a+tsunami:+synchronizing+murine+spermatogenesis+using+WIN+18,446.">Turning a spermatogenic wave into a tsunami: synchronizing murine spermatogenesis using WIN 18,446.</a> Biology of Reproduction. 88 (2), 40 (2013).</li><li>Patel, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+reorganization+of+the+genome+shapes+the+recombination+landscape+in+meiotic+prophase.">Dynamic reorganization of the genome shapes the recombination landscape in meiotic prophase.</a> Nature Structural &amp; Molecular Biology. 26 (3), 164-174 (2019).</li><li>Alavattam, K. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Attenuated+chromatin+compartmentalization+in+meiosis+and+its+maturation+in+sperm+development.">Attenuated chromatin compartmentalization in meiosis and its maturation in sperm development.</a> Nature Structural &amp; Molecular Biology. 26 (3), 175-184 (2019).</li><li>Adams, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNF8+and+SCML2+cooperate+to+regulate+ubiquitination+and+H3K27+acetylation+for+escape+gene+activation+on+the+sex+chromosomes.">RNF8 and SCML2 cooperate to regulate ubiquitination and H3K27 acetylation for escape gene activation on the sex chromosomes.</a> PLoS Genetics. 14 (2), 1007233 (2018).</li><li>Wiltshire, T., Park, C., Caldwell, K. A., Handel, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induced+premature+G2/M-phase+transition+in+pachytene+spermatocytes+includes+events+unique+to+meiosis.">Induced premature G2/M-phase transition in pachytene spermatocytes includes events unique to meiosis.</a> Developmental Biology. 169 (2), 557-567 (1995).</li></ol>

여기에서 우리는 단일 성인 남성 마우스에서 정자 세포와 정자의 하위 인구를 격리하기 위하여 실용적이고 간단한 프로토콜을 제시합니다. 이 프로토콜의 재현성을 보장하기 위해 주의가 필요한 몇 가지 중요한 단계가 있습니다. 효소 소화 전에, 세척 단계는 간질 세포를 제거하는 것을 목표로; 소화 후,이 단계는 정자와 파편을 제거하는 데 도움이됩니다. 세탁/원심 분리는 3배나 중요합니다. 우?...

정자 발생은 정자 줄기 세포의 작은 인구가 성인 생활1,2에걸쳐 많은 수의 정자의 지속적인 생산을 유지하는 복잡한 과정이다. 정자 발생 동안, 동적 크로마틴 리모델링은 정자 세포가 혈전증을 유발하여3, 4,5를생성할 때 일어난다. 메이오혈 정자 세포의 분리는 분자 조사에 필수적이며, 퇴적물 계분리6,7 및 형광 활성화 세포 분류 (FACS)8,9,10,11,12,13,14, 14,16, 16, 16, 16, 16을포함하여 메이오틱 정자 세포를 분리하는 몇 가지 다른접근법이확립되었습니다. 그러나 이러한 방법에는 기술적 한계가 있습니다. 침전계 분리는 다수의세포를5,6,7을산출하지만, 노동집약적이다. 설립된 FACS 기반 방법은 Hoechst 33342(Ho342)를 사용하여 DNA 함량 및 광 산란 특성에 따라 메이오틱 정자세포를 분리하고 자외선(UV) 레이저8,9,10,11을갖춘 FACS 세포 선별기가 필요합니다. 대체 FACS 기반 방법은 생동성 단백질을 발현하는 형질전환 마우스 라인, 정자발생(12)의동기화, 또는 살아있는세포(13)의분리와 호환되지 않는 세포 고정 및 항체 라벨링을 필요로 한다. 세포 투과성 DNA 결합 염료, 염료 자전거 녹색 얼룩14,15,16,17을사용하는 또 다른 대안 방법이 있지만, 이 방법은 청소년 고환으로부터 정자 유발 세포의 분리를 위해 권장된다. 따라서, 모든 연령의 마우스 변형에 적용할 수 있고 어떤 FACS 세포 선별기를 사용하여 수행될 수 있는 살아있는 메이오성 정자 세포에 대한 간단하고 강력한 격리 방법을 개발할 필요가 있다.
여기서 우리는 염료 자전거 바이올렛 (DCV) 얼룩을 사용하여 이러한 오랫동안 추구 된 세포 격리 프로토콜을 설명합니다. DCV는 호342와 구조적으로 유사하지만 흡개 스펙트럼이 바이올렛범위(18)로이동한 낮은 세포 독성, 세포 투과성 DNA 결합 염료이다. 또한 DCV는 DCG에 비해 광범위한 배기가스 스펙트럼을 가지고 있습니다. 따라서 UV와 바이올렛 레이저가 모두 흥분할 수 있어 장비의 유연성을 향상시켜 UV 레이저가 장착되지 않은 FACS 셀 선별기를 사용할 수 있습니다. 여기에 제시된 DCV 프로토콜은 DCV 블루 및 DCV 빨간색으로 2차원 분리를 사용하여 Ho342 프로토콜의 이점을 모방합니다. 이러한 이점을 통해 DCV 프로토콜을 사용하면 고농축 세균 세포를 성인 고환으로부터 분리할 수 있습니다. 우리는 한 마우스 (두 개의 고환에서) 한 마우스의 성인 마우스 고환에서 살아있는 정자 세포를 격리하기 위하여 상세한 게이팅 프로토콜을 제공합니다. 우리는 또한 이 세포 격리를 위해 사용될 수 있는 마우스 고환에서 단세포 현탁액을 준비하는 효율적이고 빠른 프로토콜을 기술합니다. 절차는 완료하는 짧은 시간이 필요합니다 (단일 세포 현탁액의 준비 - 1 시간, 염색 염색 - 30 분 및 셀 정렬 - 2-3 시간 : 필요한 세포의 수에 따라 총 - 4-5 시간; 그림 1). 세포 격리에 따라 RNA-seq, ATAC-seq, ChIP-seq 및 세포 배양을 포함한 광범위한 다운스트림 응용 프로그램을 완료할 수 있습니다.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>1.5 ml tube</td>
			<td>Watson</td>
			<td>131-7155C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 mm Petri dish</td>
			<td>Corning, Falcon</td>
			<td>351029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL Centrifuge tube</td>
			<td>Watson</td>
			<td>1332-015S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 ml polystyrene tube with cell strainer snap cap (35 &#181;m nylon mesh)</td>
			<td>Corning, Falcon</td>
			<td>352235</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL Centrifuge tube</td>
			<td>Watson</td>
			<td>1342-050S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>60 mm Petri dish</td>
			<td>Corning, Falcon</td>
			<td>351007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70 &#181;m nylon mesh</td>
			<td>Corning, Falcon</td>
			<td>352350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell sorter</td>
			<td>Sony</td>
			<td>SH800S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase, recombinant, Animal-derived-free</td>
			<td>FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation</td>
			<td>036-23141</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase, Type 1</td>
			<td>Worthington</td>
			<td>LS004196</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cover glass</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>12-544-G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytospin 3</td>
			<td>Shandon</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI (4&#39;,6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride)</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>D1306</td>
			<td>working concentration: 0.1 &#956;g/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dnase I</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D5025-150KU</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey serum</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S30-M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s phosphate-buffered saline (DPBS)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium (DMEM)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11885076</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>16000044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hostone H1T antibody</td>
			<td>gift from Mary Ann Handel</td>
			<td></td>
			<td>1/2000 diluted</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hank&#8217;s balanced salt solution (HBSS)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14175095</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hyaluronidase from bovine testes</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H3506-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline (PBS)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P5493-4L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipettemen</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProLong Gold Antifade Mountant</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>P36930</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rH2AX antibody</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>05-635</td>
			<td>working concentration: 2 &#956;g/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sperm Fertilization Protein 56 (Sp56) antibody</td>
			<td>QED Bioscience</td>
			<td>55101</td>
			<td>working concentration: 0.5 &#956;g/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterilized forceps and scissors</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superfrost /Plus Microscope Slides</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>12-550-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYCP3 antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab205846</td>
			<td>working concentration: 5 &#956;g/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TWEEN 20 (Polysorbate 20)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P9416</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vybrant DyeCycle Violet Stain (DCV)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>V35003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of murine spermatogenic cells using a violet-excited cell-permeable dna binding dye

메이오성 정자 세포의 격리는 meiosis 및 정자 발생의 근본적인 분자 기계장치를 조사하기 위하여 필수적입니다. Hoechst 33342를 사용하여 세포 격리 프로토콜이 확립되어 있지만 형광 활성화 셀 선별과 함께 염색되지만 자외선 레이저가 장착 된 세포 선별기가 필요합니다. 여기서 우리는 염료 자전거 바이올렛 (DCV) 얼룩을 사용하여 세포 격리 프로토콜을 설명, 낮은 세포 독성 DNA 결합 염료는 구조적으로 Hoechst 33342와 유사. DCV는 자외선과 보라색 레이저 모두에 의해 흥분 될 수 있으며, 자외선 레이저가 장착되지 않은 셀 선별기를 포함하여 장비 선택의 유연성을 향상시킵니다. 이 프로토콜을 사용하여, 하나는 렙토텐 / zygotene, pachytene 및 디플롯렌 정자 세포뿐만 아니라, 메이오틱 한 후 정자를 포함하여 메이오틱 프PHASE I에서 3 개의 라이브 셀 하위 집단을 격리 할 수 있습니다. 우리는 또한 마우스 고환에서 단세포 현탁액을 준비하는 프로토콜을 설명합니다. 전반적으로 이 절차는 완료하는 데 짧은 시간(필요한 셀 수에 따라 4-5시간)이 필요하며, 이는 많은 다운스트림 응용 프로그램을 용이하게 합니다.

이 정렬 프로토콜의 대표적인 결과는 그림 3에표시됩니다. 두 고환 (1 마우스)의 총 정렬 시간은 일반적으로 약 3 시간, 셀 서스펜션의 농도 및 선별 속도에 따라 달라집니다. 선별 후, 정자 세포의 순도는 SYCP3 및 γH2AX(도 3A)의면역 염색에 의해 확인된다. 정렬된 L/Z, P, D 정자세포 분획의 대표적인 순도는 각각 약 80.4%, 90.6%, 87.6%이다(그림3C)...

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Isolation of Murine Spermatogenic Cells using a Violet-Excited Cell-Permeable DNA Binding Dye

여기서 우리는 성인 마우스 고환에서 살아있는 메이오틱 및 후 메이오성 세균 세포를 격리하는 간단하고 효율적인 방법을 제시합니다. 낮은 세포 독성, 보라색 흥분 DNA 결합 염료 및 형광 활성화 세포 분류를 사용 하 여, 하나는 많은 다운 스트림 응용 프로그램에 대 한 고도로 농축 된 정자 세포 인구를 격리할 수 있습니다.

보라색 흥분 세포 투과성 DNA 결합 염료를 사용하여 뮤린 정자 세포의 격리

Isolation of meiotic spermatocytes is essential to investigate molecular mechanisms underlying meiosis and spermatogenesis. Although there are established ...

성인 마우스에서 정자 세포와 정자의 하위 집단을 격리하기위한이 새로운 효율적인 방법은 meiosis 및 정자 발생의 기본 분자 메커니즘을 조사하는 데 사용할 수 있습니다. 이 방법은 현재 사용되는 대부분의 FACS 주문에 적용 할 수있는 넓은 여기 스펙트럼을 가진 낮은 세포 독성 DNA 결합 염료를 사용합니다. 이 방법은 매우 간단합니다.가장 어려운 측면은 유동 세포측정 제비이지만 상세한 게이팅 전략은 프로토콜을 다른 세포 선별기에 적응시키는 데 도움이 되어야 합니다. 이 절차를 시연하는 것은 네카와 사토시 연구소의 연구 조교인 유한 예(Yu-Han Yeh)입니다. 8주 된 수컷 마우스에서 두 고환을 수확한 후, 얼음 차가운 PBS 2밀리리터가 들어있는 60mm 페트리 접시에 티슈를 놓고 튜니카 알부기네아를 제거합니다.고환을 집게로 부드럽게 분리하여 반열구를 약간 분산시합니다. 그리고 100mm 페트리 접시에 신선한 얼음 차가운 PBS 한 방울로 튜블러를 옮춥시다. 집게를 사용하여 튜블을 부드럽게 풀고 방금 입증된 것처럼 PBS의 세 방울로 튜룰을 씻습니다.마지막 세척 후, 15 밀리리터 튜브에 얽힌 반열성 튜블을 넣고 섭씨 37도에서 20 분 배양을 위해 2 밀리리터의 해리 버퍼를 포함합니다. 인큐베이션이 끝나면 1000 마이크로리터 파이펫을 사용하여 튜벌레를 20번 부드럽게 피펫한 후 튜브를 인큐베이터로 6분 더 돌려보냅니다. 인큐베이션이 끝나면 튜브를 인큐베이터로 되돌리기 전에 조직을 20회 추가로 피펫합니다.3분 후, 뚜미가 보이지 않는 조직 조각이 남아 있지 않고 FACS 버퍼 10밀리리터로 해리를 멈추기 전에, 튜블러를 10번 또는 뚜피할 때까지 부드럽게 피펫을 한다. 이어서, 조직 현탁액에 원심분리기는 두 번째 세척을 위한 신선한 FACS 완충제에 대해 10밀리리터를 추가로 사용하여 가능한 한 많은 이물질을 제거한다. 흐름 세포 측정 분석을 위해 세포를 염색하려면 FACS 버퍼의 3 밀리리터에서 펠릿을 다시 중단하십시오.그리고 70 미크론 나일론 세포 여과기를 통해 세포 현탁액을 50 밀리리터 튜브로 필터링합니다. 계산 후, 스테인드 네거티브 컨트롤로 얼음에 새로운 튜브로 세포의 10 %를 전송합니다. 그리고 DCV 얼룩의 6 마이크로리터를 나머지 세포 현탁액에 철저히 혼합합니다.어둠 속에서 섭씨 37도에서 30분 간 잠복한 후 10분마다 부드러운 흔들림으로 DNase I의 마이크로리터 5개를 세포에 추가합니다. 그리고 35 미크론 나일론 메쉬 스트레이너를 통해 세포를 얼음 위에 5 밀리리터 FACS 튜브로 필터링합니다. 셀의 흐름 사이토메트릭 분석을 위해 흐름 분석 소프트웨어에서 새 실험을 만들고 워크시트 도구 메뉴에서 새 밀도를 클릭하여 선형 배율의 백스캐터 영역 밀도 플롯과 비교하여 전방 분산 영역을 만듭니다.새로운 히스토그램을 클릭하여 로그자리믹 스케일에서 DCV 파란색 히스토그램 플롯을 만듭니다. 시작 및 기록을 클릭하여 스테인이없는 샘플 처리를 시작합니다. 샘플이 실행되는 동안 검출기 및 임계값 설정을 클릭하여 전방 및 측면 분산 PMT 전압을 모두 조정하여 스테인드 셀을 앞뒤로 분산된 플롯의 배율에 배치합니다.Jappy 채널의 PMT 전압을 조정하여 DCV 블루 히스토그램 로사스믹 플롯의 첫 10년 동안 DCV 음성 모집단의 위치를 찾습니다. 그런 다음 정지를 클릭하여 얼룩진 샘플을 언로드합니다. 스테인드 샘플을 잠시 소용돌이게 하고 적재한 후 다음 튜브를 클릭하여 샘플에 대한 새 워크시트를 만듭니다.사이토미터를 설정하여 6개의 이벤트에 10회 이상 획득하고 시작 및 기록을 클릭합니다. 다음으로 새 밀도를 클릭하여 앞으로 분산 높이와 전방 분산 폭을 만듭니다. 그리고 선형 축척에서 DCV 파란색 대 DCV 적색 밀도 플롯을 플롯합니다.전방 분산 영역 대 백스캐터 영역 밀도 플롯에서 다각형 도구를 사용하여 셀이라는 게이트를 그리며 대부분의 세포를 포함하고 작은 이물질을 제외합니다. 이 게이트를 전방 분산 높이대 전방 분산 너비 플롯에 적용하고 사각형 도구를 사용하여 단일 셀의 게이트를 그려 단일 셀의 게이트를 그려 단일 셀이 아닌 단일 셀을 제외합니다. 단일 셀의 게이트를 DCV 블루 대 DCV 적밀도 플롯에 적용하고 스케일을 조정하여 확장 된 프로파일을 캡처합니다.다각형 도구를 사용하여 DCV 게이트를 그려 스테인드 셀 및 측면 모집단을 배제하고 선형 스케일의 DCV 파란색 히스토그램 플롯에 게이트를 적용합니다. 3개의 주요 봉우리들은 다른 1C, 2C 및 4C DNA 내용을 지칭합니다. 선형 축척에서 두 번째 DCV 파란색 대 DCV 적색 밀도 플롯을 만듭니다.그리고 다시 게이트 1C및 4C 인구를 찾기 위해 플롯에 DCV 게이트. 선형 축척에서 DCV 빨간색 밀도 플롯과 다른 DCV 파란색을 만듭니다. 그리고 타원 도구를 사용하여 1C 인구에 게이트를 그립니다.다각형 도구를 사용하여 연속 곡선으로 4C 모집단을 게이트합니다. 그리고 선형 축척에서 DCV 적색 밀도 플롯과 다른 DCV 블루를 만듭니다. 다각형 도구를 사용하여 4C 하나의 게이트를 만듭니다.나란히 흩어져 있는 플롯에 의해 새로운 앞으로, 파시텐, 디플롯렌과 렙토텐, zygotene 정자 세포 게이트를 만들기 위해 타원 도구를 사용합니다. 모든 게이트가 그려진 경우 선형 축척으로 새 DCV 파란색 대 DCV 빨간색 도트 플롯을 만들어 4C 게이트에 대한 게이트를 적용하여 세 모집단이 게이트 내에서 연속 순서를 유지할 수 있도록 합니다. 다음으로, 선형 척도에서 백스캐터 영역 밀도 플롯에 비해 새로운 전방 분산 영역을 만들고, 순수한 둥근 정자 집단으로서 세포의 통합 크기를 선택한다.선별 후, 분리된 렙토텐, zygotene, pachytene 및 디플롯렌 정자 분획의 대표적인 순수성은 SYCP3 및 감마 H2AX 면역염색에 의해 확인된 바와 같이 전형적으로 80%에서 90% 사이이다. 둥근 정자 파면의 순도는 Sp56 및 H1t 염색과 함께 DCV와 함께 염색하는 핵에 의해 확인될 수 있으며, 또한 일반적으로 약 90%이며 고립 된 세포 집단의 생존율은 일반적으로 95 %이상이며 단일 성인 마우스로부터각 분수의 평균 총 수율은 일반적으로 다양한 다운스트림 분석에 충분하다. 정렬된 세포는 정자 발생 시 유전자 발현 및 조절을 더 잘 탐구하기 위해 다양한 차세대 염기서열 분석에 사용될 수 있다.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Dual Labeling of Neural Crest Cells and Blood Vessels Within Chicken Embryos Using ChickGFP Neural Tube Grafting and Carbocyanine Dye DiI Injection

Dual Labeling of Neural Crest Cells and Blood Vessels Within Chicken Embryos Using ChickGFP Neural Tube Grafting and Carbocyanine Dye DiI Injection

병아리GFP 신경관 이식 및 카르보시아닌 염료 DiI 주입을 사용하여 닭 배아 내신경염 세포 및 혈관의 이중 라벨링

All developing organs need to be connected to both the nervous system (for sensory and motor control) as well as the vascular system (for gas exchange, ...

연구

발생학

Murine Dermal Fibroblast Isolation by FACS

FACS에 의해 쥐 피부 섬유 아세포 격리

Fibroblasts are the principle cell type responsible for secreting extracellular matrix and are a critical component of many organs and tissues. Fibroblast ...

Isolation of Murine Embryonic Hemogenic Endothelial Cells

쥐 배아 Hemogenic 내피 세포의 분리

The specification of hemogenic endothelial cells from embryonic vascular endothelium occurs during brief developmental periods within distinct tissues, ...

Isolation and Expansion of Mesenchymal Stem/Stromal Cells Derived from Human Placenta Tissue

인간 태반 조직에서 추출 분리 및 중간 엽 줄기의 확장 / 기질 세포

Mesenchymal stem/stromal cells (MSC) are promising candidates for use in cell-based therapies. In most cases, therapeutic response appears to be cell-dose ...

The Production of Pluripotent Stem Cells from Mouse Amniotic Fluid Cells Using a Transposon System

트랜스포존 시스템을 사용하여 마우스 양수 세포로부터 다 능성 줄기 세포의 제조

Induced pluripotent stem (iPS) cells are generated from mouse and human somatic cells by forced expression of defined transcription factors using ...

Horizontal Whole Mount: A Novel Processing and Imaging Protocol for Thick, Three-dimensional Tissue Cross-sections of Skin

수평 한 전체적인 거치 : 피부의 두껍고, 3 차원 조직 단면도를위한 비발 한 가공 그리고 화상 진찰 의정서

Processing a tissue of interest to generate a microscopic image that supports a scientific argument can be challenging. The acquisition of high-quality ...

Isolation of Human Endometrial Stromal Cells for In Vitro Decidualization

Isolation of Human Endometrial Stromal Cells for In Vitro Decidualization

생체 외에서 Decidualization에 대 한 인간의 자궁내 막 기질 세포의 고립

The differentiation of human endometrial stromal cells (HESC) from fibroblast-like appearance into secretory decidua is a transformation required for ...

Computational Analysis of the Caenorhabditis elegans Germline to Study the Distribution of Nuclei, Proteins, and the Cytoskeleton

Computational Analysis of the Caenorhabditis elegans Germline to Study the Distribution of Nuclei, Proteins, and the Cytoskeleton

꼬마 선 충 생식 핵의 분포, 단백질, 및 골격을 전산 분석

The Caenorhabditis elegans (C. elegans) germline is used to study several biologically important processes including stem cell development, apoptosis, and ...

In Vitro Generation of Somite Derivatives from Human Induced Pluripotent Stem Cells

인간 유도에서 Somite 파생 상품의 체 외 발생에서 만능 줄기 세포

In response to signals such as WNTs, bone morphogenetic proteins (BMPs), and sonic hedgehog (SHH) secreted from surrounding tissues, somites (SMs) give ...

Three-dimensional Angiogenesis Assay System using Co-culture Spheroids Formed by Endothelial Colony Forming Cells and Mesenchymal Stem Cells

내피 콜로니 형성 세포및 중간엽 줄기 세포에 의해 형성된 공동 배양 스페로이드를 이용한 3차원 혈관신생 분석 시스템

Studies in the field of angiogenesis have been aggressively growing in the last few decades with the recognition that angiogenesis is a hallmark of more ...