Name: isolation of murine spermatogenic cells using a violet-excited cell-permeable dna binding dye
Uploaded: 2021-01-14T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Murine Spermatogenic Cells using a Violet-Excited Cell-Permeable DNA Binding Dye at JoVE.com

Vi takker medlemmer av Namekawa, Yoshida og Maezawa laboratorier for deres hjelp; Katie Gerhardt for redigering av manuskriptet; Mary Ann Handel for å dele H1T-antistoffet, Cincinnati Children's Hospital Medical Center (CCHMC) Research Flow Cytometry Core for deling av FACS-utstyret støttet av NIH S10OD023410; Stipend-in-Aid for Scientific Research (KAKENHI; 17K07424) til T.N.; Lalor Foundation postdoktorstipend til A.S.; AMED-CREST (JP17gm1110005h0001) til S.Y.; forskningsprosjektstipendet fra Azabu University Research Services Division, Kunnskapsdepartementet, kultur, sport, vitenskap og teknologi (MEXT)-støttet program for Private University Research Branding Project (2016–2019), Grant-in-Aid for Research Activity Oppstart (19K21196), Takeda Science Foundation (2019) og Uehara Memorial Foundation Research Incentive Grant (2018) til S.M.; National Institute of Health R01 GM122776 til S.H.N.

Denne protokollen følger retningslinjene i Institutional Animal Care and Use Committee (protokollnr. IACUC2018-0040) ved Cincinnati Children's Hospital Medical Center.
1. Utstyr og reagensoppsett for fremstilling av testikkelcellesuspensjon
<ol><li>Forbered hver enzymlager i 1x Hanks' balanserte saltoppløsning (HBSS) og oppbevar ved -20 °C. (Tabell1). MERK: Forbered når som helst før eksperimentet.</li>
	<li>En dag før forsøket: Coat samlerør (1,5 ml rør) med fø...

<ol>
	<li>Griswold, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spermatogenesis:+The+Commitment+to+Meiosis.">Spermatogenesis: The Commitment to Meiosis.</a> Physiological Reviews. 96 (1), 1-17 (2016).</li><li>Yoshida, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+Spermatogenesis+Reflects+the+Unity+and+Diversity+of+Tissue+Stem+Cell+Niche+Systems.">Mouse Spermatogenesis Reflects the Unity and Diversity of Tissue Stem Cell Niche Systems.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. , 036186 (2020).</li><li>Rathke, C., Baarends, W. M., Awe, S., Renkawitz-Pohl, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromatin+dynamics+during+spermiogenesis.">Chromatin dynamics during spermiogenesis.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1839 (3), 155-168 (2014).</li><li>Maezawa, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SCML2+promotes+heterochromatin+organization+in+late+spermatogenesis.">SCML2 promotes heterochromatin organization in late spermatogenesis.</a> Journal of Cell Science. 131 (17), 217125 (2018).</li><li>Maezawa, S., Yukawa, M., Alavattam, K. G., Barski, A., Namekawa, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+reorganization+of+open+chromatin+underlies+diverse+transcriptomes+during+spermatogenesis.">Dynamic reorganization of open chromatin underlies diverse transcriptomes during spermatogenesis.</a> Nucleic Acids Research. 46 (2), 593-608 (2018).</li><li>Bellve, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification,+culture,+and+fractionation+of+spermatogenic+cells.">Purification, culture, and fractionation of spermatogenic cells.</a> Methods in Enzymology. 225, 84-113 (1993).</li><li>Bryant, J. M., Meyer-Ficca, M. L., Dang, V. M., Berger, S. L., Meyer, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Separation+of+spermatogenic+cell+types+using+STA-PUT+velocity+sedimentation.">Separation of spermatogenic cell types using STA-PUT velocity sedimentation.</a> Journal of Visualized Experiments. (80), e50648 (2013).</li><li>Gaysinskaya, V., Bortvin, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometry+of+murine+spermatocytes.">Flow cytometry of murine spermatocytes.</a> Current Protocols in Cytometry. 72, (2015).</li><li>Bastos, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometric+characterization+of+viable+meiotic+and+postmeiotic+cells+by+Hoechst+33342+in+mouse+spermatogenesis.">Flow cytometric characterization of viable meiotic and postmeiotic cells by Hoechst 33342 in mouse spermatogenesis.</a> Cytometry Part A. 65 (1), 40-49 (2005).</li><li>Getun, I. V., Torres, B., Bois, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometry+purification+of+mouse+meiotic+cells.">Flow cytometry purification of mouse meiotic cells.</a> Journal of Visualized Experimments. (50), e2602 (2011).</li><li>Gaysinskaya, V., Soh, I. Y., van der Heijden, G. W., Bortvin, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimized+flow+cytometry+isolation+of+murine+spermatocytes.">Optimized flow cytometry isolation of murine spermatocytes.</a> Cytometry Part A. 85 (6), 556-565 (2014).</li><li>Romer, K. A., de Rooiji, D. G., Kojima, M. L., Page, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolating+mitotic+and+meiotic+germ+cells+from+male+mice+by+developmental+synchronization,+staging,+and+sorting.">Isolating mitotic and meiotic germ cells from male mice by developmental synchronization, staging, and sorting.</a> Developmental Biology. 443 (1), 19-34 (2018).</li><li>Lam, K. G., Brick, K., Cheng, G., Pratto, F., Camerini-Otero, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-type-specific+genomics+reveals+histone+modification+dynamics+in+mammalian+meiosis.">Cell-type-specific genomics reveals histone modification dynamics in mammalian meiosis.</a> Nature Communications. 10 (1), 3821 (2019).</li><li>Geisinger, A., Rodriguez-Casuriaga, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+Cytometry+for+the+Isolation+and+Characterization+of+Rodent+Meiocytes.">Flow Cytometry for the Isolation and Characterization of Rodent Meiocytes.</a> Methods in Molecular Biology. 1471, 217-230 (2017).</li><li>da Cruz, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptome+analysis+of+highly+purified+mouse+spermatogenic+cell+populations:+gene+expression+signatures+switch+from+meiotic-to+postmeiotic-related+processes+at+pachytene+stage.">Transcriptome analysis of highly purified mouse spermatogenic cell populations: gene expression signatures switch from meiotic-to postmeiotic-related processes at pachytene stage.</a> BMC Genomics. 17, 294 (2016).</li><li>Rodriguez-Casuriaga, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+preparation+of+rodent+testicular+cell+suspensions+and+spermatogenic+stages+purification+by+flow+cytometry+using+a+novel+blue-laser-excitable+vital+dye.">Rapid preparation of rodent testicular cell suspensions and spermatogenic stages purification by flow cytometry using a novel blue-laser-excitable vital dye.</a> MethodsX. 1, 239-243 (2014).</li><li>Trovero, M. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Revealing+stage-specific+expression+patterns+of+long+noncoding+RNAs+along+mouse+spermatogenesis.">Revealing stage-specific expression patterns of long noncoding RNAs along mouse spermatogenesis.</a> RNA Biology. 17 (3), 350-365 (2020).</li><li>Telford, W. G., Bradford, J., Godfrey, W., Robey, R. W., Bates, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Side+population+analysis+using+a+violet-excited+cell-permeable+DNA+binding+dye.">Side population analysis using a violet-excited cell-permeable DNA binding dye.</a> Stem Cells. 25 (4), 1029-1036 (2007).</li><li>Alavattam, K. G., Abe, H., Sakashita, A., Namekawa, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromosome+Spread+Analyses+of+Meiotic+Sex+Chromosome+Inactivation.">Chromosome Spread Analyses of Meiotic Sex Chromosome Inactivation.</a> Methods in Molecular Biology. 1861, 113-129 (2018).</li><li>Maezawa, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Super-enhancer+switching+drives+a+burst+in+gene+expression+at+the+mitosis-to-meiosis+transition.">Super-enhancer switching drives a burst in gene expression at the mitosis-to-meiosis transition.</a> Nature Structural &amp; Molecular Biology. , (2020).</li><li>Sakashita, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endogenous+retroviruses+drive+species-specific+germline+transcriptomes+in+mammals.">Endogenous retroviruses drive species-specific germline transcriptomes in mammals.</a> Nature Structural &amp; Molecular Biology. , (2020).</li><li>Agrimson, K. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterizing+the+Spermatogonial+Response+to+Retinoic+Acid+During+the+Onset+of+Spermatogenesis+and+Following+Synchronization+in+the+Neonatal+Mouse+Testis.">Characterizing the Spermatogonial Response to Retinoic Acid During the Onset of Spermatogenesis and Following Synchronization in the Neonatal Mouse Testis.</a> Biology of Reproduction. 95 (4), 81 (2016).</li><li>Hogarth, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Turning+a+spermatogenic+wave+into+a+tsunami:+synchronizing+murine+spermatogenesis+using+WIN+18,446.">Turning a spermatogenic wave into a tsunami: synchronizing murine spermatogenesis using WIN 18,446.</a> Biology of Reproduction. 88 (2), 40 (2013).</li><li>Patel, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+reorganization+of+the+genome+shapes+the+recombination+landscape+in+meiotic+prophase.">Dynamic reorganization of the genome shapes the recombination landscape in meiotic prophase.</a> Nature Structural &amp; Molecular Biology. 26 (3), 164-174 (2019).</li><li>Alavattam, K. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Attenuated+chromatin+compartmentalization+in+meiosis+and+its+maturation+in+sperm+development.">Attenuated chromatin compartmentalization in meiosis and its maturation in sperm development.</a> Nature Structural &amp; Molecular Biology. 26 (3), 175-184 (2019).</li><li>Adams, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNF8+and+SCML2+cooperate+to+regulate+ubiquitination+and+H3K27+acetylation+for+escape+gene+activation+on+the+sex+chromosomes.">RNF8 and SCML2 cooperate to regulate ubiquitination and H3K27 acetylation for escape gene activation on the sex chromosomes.</a> PLoS Genetics. 14 (2), 1007233 (2018).</li><li>Wiltshire, T., Park, C., Caldwell, K. A., Handel, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induced+premature+G2/M-phase+transition+in+pachytene+spermatocytes+includes+events+unique+to+meiosis.">Induced premature G2/M-phase transition in pachytene spermatocytes includes events unique to meiosis.</a> Developmental Biology. 169 (2), 557-567 (1995).</li></ol>

Her presenterer vi en praktisk og enkel protokoll for å isolere underpopulasjoner av spermatocytter og spermatider fra en enkelt voksen mannlig mus. For å sikre reproduserbarheten til denne protokollen, er det noen kritiske skritt som trenger oppmerksomhet. Før enzymfordøyelse tar vasketrinnet sikte på å fjerne interstitielle celler; etter fordøyelsen bidrar dette trinnet til å fjerne spermatozoer og rusk. Vasking/sentrifugering 3 ganger er viktig. I vår dissosiasjonsbufferoppskrift letter kombinasjonen av flere...

Spermatogenese er en kompleks prosess hvor en liten populasjon av spermatogoniale stamceller opprettholder kontinuerlig produksjon av et stort antall sperm gjennom voksenlivet1,2. Under spermatogenese finner dynamisk kromatin remodeling sted når spermatogene celler gjennomgår meiose for å produsere haploid spermatids3,4,5. Isolering av meiotiske spermatocytter er avgjørende for molekylær undersøkelse, og flere forskjellige tilnærminger for å isolere meiotiske spermatocytter er etablert, inkludert sedimenteringsbasert separasjon6,7 og fluorescensaktivert cellesortering (FACS)8,9,10,11,12,13,14,15,16,17. Disse metodene har imidlertid tekniske begrensninger. Mens sedimenteringsbasert separasjon gir et stort antall celler5,6,7, er det arbeidskrevende. Den etablerte FACS-baserte metoden bruker Hoechst 33342 (Ho342) til å skille meiotiske spermatocytter basert på DNA-innhold og lysspøpende egenskaper og krever FACS cellesorterere utstyrt med en ultrafiolett (UV) laser8,9,10,11. Alternative FACS-baserte metoder krever transgene muselinjer som uttrykker blomstrende proteiner, synkronisering av spermatogenese12, eller cellefiksering og antistoffmerking som ikke er kompatibel med isolering av levendeceller 13. Mens det er en annen alternativ metode ved hjelp av en cellegjennomtrengelig DNA bindende fargestoff, DyeCycle Grønn flekk14,15,16,17, anbefales denne metoden for isolering av spermatogene celler fra juvenil testis. Derfor er det et kritisk behov for å utvikle en enkel og robust isolasjonsmetode for levende meiotiske spermatocytter som kan brukes på enhver musestamme i alle aldre, og som kan utføres ved hjelp av hvilken som helst FACS-cellesortering.
Her beskriver vi en så ettertraktet celleisolasjonsprotokoll ved hjelp av DyeCycle Violet (DCV) flekken. DCV er en lav cytotoksisitet, cellegjennomtrengelig DNA bindende fargestoff strukturelt lik Ho342, men med et eksitasjonsspektrum forskjøvet mot fiolettområde 18. I tillegg har DCV et bredere utslippsspektrum sammenlignet med DCG. Dermed kan det være begeistret av både UV og fiolette lasere, noe som forbedrer fleksibiliteten til utstyr, slik at bruk av en FACS cellesortering som ikke er utstyrt med en UV-laser. DCV-protokollen som presenteres her bruker todimensjonal separasjon med DCV blå og DCV rød, etterligne fordelen av Ho342-protokollen. Med denne fordelen tillater vår DCV-protokoll oss å isolere høyt berikede bakterieceller fra de voksne testiene. Vi tilbyr en detaljert gating protokoll for å isolere levende spermatogene celler fra voksne mus testiklene av en mus (fra to testiklene). Vi beskriver også en effektiv og rask protokoll for å forberede encellede suspensjon fra musetestiklene som kan brukes til denne celleisoleringen. Prosedyren krever kort tid å fullføre (utarbeidelse av enkeltcellesuspensjon - 1 time, fargestofffarging - 30 min og cellesortering - 2-3 timer: totalt - 4-5 timer avhengig av antall nødvendige celler; Figur 1). Etter celleisolasjon kan et bredt spekter av nedstrøms programmer, inkludert RNA-seq, ATAC-seq, ChIP-seq og cellekultur, fullføres.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>1.5 ml tube</td>
			<td>Watson</td>
			<td>131-7155C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 mm Petri dish</td>
			<td>Corning, Falcon</td>
			<td>351029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL Centrifuge tube</td>
			<td>Watson</td>
			<td>1332-015S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 ml polystyrene tube with cell strainer snap cap (35 &#181;m nylon mesh)</td>
			<td>Corning, Falcon</td>
			<td>352235</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL Centrifuge tube</td>
			<td>Watson</td>
			<td>1342-050S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>60 mm Petri dish</td>
			<td>Corning, Falcon</td>
			<td>351007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70 &#181;m nylon mesh</td>
			<td>Corning, Falcon</td>
			<td>352350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell sorter</td>
			<td>Sony</td>
			<td>SH800S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase, recombinant, Animal-derived-free</td>
			<td>FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation</td>
			<td>036-23141</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase, Type 1</td>
			<td>Worthington</td>
			<td>LS004196</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cover glass</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>12-544-G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytospin 3</td>
			<td>Shandon</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI (4&#39;,6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride)</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>D1306</td>
			<td>working concentration: 0.1 &#956;g/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dnase I</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D5025-150KU</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey serum</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S30-M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s phosphate-buffered saline (DPBS)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium (DMEM)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11885076</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>16000044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hostone H1T antibody</td>
			<td>gift from Mary Ann Handel</td>
			<td></td>
			<td>1/2000 diluted</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hank&#8217;s balanced salt solution (HBSS)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14175095</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hyaluronidase from bovine testes</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H3506-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline (PBS)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P5493-4L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipettemen</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProLong Gold Antifade Mountant</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>P36930</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rH2AX antibody</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>05-635</td>
			<td>working concentration: 2 &#956;g/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sperm Fertilization Protein 56 (Sp56) antibody</td>
			<td>QED Bioscience</td>
			<td>55101</td>
			<td>working concentration: 0.5 &#956;g/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterilized forceps and scissors</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superfrost /Plus Microscope Slides</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>12-550-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYCP3 antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab205846</td>
			<td>working concentration: 5 &#956;g/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TWEEN 20 (Polysorbate 20)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P9416</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vybrant DyeCycle Violet Stain (DCV)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>V35003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of murine spermatogenic cells using a violet-excited cell-permeable dna binding dye

Isolering av meiotiske spermatocytter er avgjørende for å undersøke molekylære mekanismer underliggende meiose og spermatogenese. Selv om det er etablert celleisolasjonsprotokoller ved hjelp av Hoechst 33342 farging i kombinasjon med fluorescens-aktivert cellesortering, krever det cellesortere utstyrt med en ultrafiolett laser. Her beskriver vi en celleisolasjonsprotokoll ved hjelp av DyeCycle Violet (DCV) flekken, en lav cytotoksisitet DNA bindende fargestoff strukturelt lik Hoechst 33342. DCV kan være begeistret av både ultrafiolette og fiolette lasere, noe som forbedrer fleksibiliteten til utstyrsvalg, inkludert en cellesorter som ikke er utstyrt med en ultrafiolett laser. Ved hjelp av denne protokollen kan man isolere tre live-celle subpopulasjoner i meiotiske prophase I, inkludert leptotene / zygotene, pachytene, og diplotene spermatocytter, samt post-meiotiske runde spermatids. Vi beskriver også en protokoll for å forberede encellede suspensjon fra musetestikler. Samlet sett krever prosedyren kort tid å fullføre (4-5 timer avhengig av antall nødvendige celler), noe som letter mange nedstrøms applikasjoner.

Et representativt resultat av denne sorteringsprotokollen vises i figur 3. Den totale sorteringstiden for to testiklene (en mus) er vanligvis rundt 3 timer, som er avhengig av konsentrasjonen av cellesuspensjon og sorteringshastigheten. Etter sortering er renheten av spermatocytter bekreftet ved immunstaining av SYCP3 og γH2AX (figur 3A). Den representative renheten av sorterte L / Z, P, D spermatocytt fraksjoner er rundt 80,4%, 90,6% og 87,6%, henholdsvis (<st...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Murine Spermatogenic Cells using a Violet-Excited Cell-Permeable DNA Binding Dye at JoVE.com

Isolation of Murine Spermatogenic Cells using a Violet-Excited Cell-Permeable DNA Binding Dye

Her presenterer vi en enkel og effektiv metode for å isolere levende meiotiske og postmeiotiske bakterieceller fra voksne musetestikler. Ved hjelp av en lav cytotoksisitet, fiolett-spent DNA bindende fargestoff og fluorescens-aktivert celle sortering, man kan isolere svært beriket spermatogene cellepopulasjoner for mange nedstrøms applikasjoner.

Isolering av murine spermatogene celler ved hjelp av en violet-spent celle-gjennomtrengelig DNA bindende fargestoff

Isolation of meiotic spermatocytes is essential to investigate molecular mechanisms underlying meiosis and spermatogenesis. Although there are established ...

Denne nye effektive metoden for å isolere underpopulasjoner av spermatocytter og spermatider fra voksne mus kan brukes til å undersøke molekylære mekanismer underliggende meiose og spermatogenese. Denne metoden bruker en lav cytotoksisitet DNA bindende fargestoff med et bredt eksitasjonsspektrum som kan brukes på de fleste brukte FACS-ordrer. Denne metoden er veldig grei.Det mest utfordrende aspektet er flyten cytometri gating men den detaljerte gating strategi bør hjelpe med å tilpasse protokollen til andre celler sorters. Å demonstrere prosedyren vil være Yu-Han Yeh, en forskningsassistent fra Satoshi Namekawa's Laboratory. Etter høsting av begge testiklene fra en åtte uker gammel mannlig mus, legg vevet i en 60 millimeter petriskål som inneholder to milliliter iskald PBS og fjern tunikaalbuginea.Forsiktig skille testiklene med tang for å litt spre seminiferøse tubuli. Og overfør tubuliene til en dråpe frisk iskald PBS i en 100 millimeter petriskål. Bruk tangen til å forsiktig løsne tubuli og vaske tubuli i tre ekstra dråper PBS som nettopp demonstrert.Etter den siste vasken, legg de untangled seminiferøse tubuli i et 15 milliliter rør, som inneholder to milliliter dissosiasjonsbuffer for en 20-minutters inkubasjon ved 37 grader Celsius. På slutten av inkubasjonen, bruk en 1000 mikroliter pipette til å forsiktig pipette tubuli 20 ganger, før du returnerer røret til inkubatoren i ytterligere seks minutter. På slutten av inkubasjonen pipette vevet ytterligere 20 ganger, før du returnerer røret til inkubatoren.Etter tre minutter, pipette forsiktig tubuli 10 ganger eller til ingen synlige vev stykker gjenstår, før du stopper dissosiasjonen med 10 milliliter FACS buffer. Deretter sentrifuge til vev suspensjon to ganger ved hjelp av ytterligere 10 milliliter for frisk FACS buffer for andre vask for å fjerne spermatozoa og så mye rusk som mulig. For å flekke cellene for strømningscytokometrisk analyse, re-suspendere pellet i tre milliliter FACS buffer.Og filtrer cellesuspensjonen gjennom en 70 mikron nyloncellesil, inn i et 50 milliliter rør. Etter telling, overføre 10% av cellene til et nytt rør på is som den uopphetede negative kontrollen. Og bland seks mikroliter dcv-flekk grundig inn i den gjenværende cellefjæringen.Etter en 30-minutters inkubasjon ved 37 grader Celsius i mørket med mild risting hvert 10. Og filtrer cellene gjennom en 35 mikron nylon mesh sil i en fem milliliter FACS rør på is. For flow cytometrisk analyse av cellene, opprett et nytt eksperiment i flytanalyseprogramvaren, og under regnearkverktøymenyen klikker du ny tetthet for å opprette et fremoversp scatter-område kontra backscatter områdetetthetsplott på en lineær skala.Klikk nytt histogrammet for å opprette en DCV blå histogram plott på en logaritmisk skala. Og klikk start og registrer for å begynne å behandle det uopphetede utvalget. Mens prøven er i gang, klikker du på detektor- og terskelinnstillinger for å justere både forover- og sidespavsedede PMT-spenninger for å plassere de uopphetede cellene på skalaen av strø- og bakspartikkelplottet.Juster PMT-spenningen for jappykanalen for å finne posisjonen til DCV negativ befolkning i det første tiåret av DCV blå histogrammet logaritmisk plott. Klikk deretter stopp for å fjerne det uopphetede utvalget. Etter kort innvirring og lasting av den beisede prøven, klikker du neste rør for å opprette et nytt regneark for prøven.Angi cytometeret til å skaffe minst en ganger 10 til de seks hendelsene, og klikk start og ta opp. Deretter klikker du ny tetthet for å opprette punkthøyde fremover kontra punktbredde fremover. Og DCV blå versus DCV rød tetthet plott på en lineær skala.På fremover scatter området versus backscatter området tetthet tomten, bruk polygon verktøyet til å tegne en port kalt celler for å inkludere de fleste av cellene og for å utelukke små rusk. Bruk denne porten på den fremre punkthøyden versus fremover punktbredde plott og bruke rektangelverktøyet til å tegne en enkelt celle port for å utelukke ikke-enkeltceller. Påfør enkeltcellens port på DCV blå versus DCV rød tetthet plot og justere skalaen for å fange en utvidet profil.Bruk polygonverktøyet til å tegne en DCV-port for å utelate de uopphetede cellene og sidepopulasjonen, og bruk porten på et DCV blått histogrammet plott på en lineær skala. De tre store toppene refererer til det forskjellige 1C-, 2C- og 4C DNA-innholdet. Opprett en annen DCV blå versus DCV rød tetthet plott på en lineær skala.Og tilbake gate DCV gate på tomten for å finne 1C og 4C populasjoner. Opprett en annen DCV blå versus DCV rød tetthet plott på en lineær skala. Og bruk ellipseverktøyet til å tegne en port på 1C-befolkningen.Bruk polygonverktøyet til å gate 4C-populasjonen med en kontinuerlig kurve. Og lag en annen DCV blå versus DCV rød tetthet plott på en lineær skala. Bruk polygonverktøyet til å lage en 4C en port.I en ny fremover ved side scatter plot, bruk ellipse verktøyet for å lage pachytene, diplotene og leptotene, zygotene spermatocyte porter. Når alle portene er trukket, opprette en ny DCV blå versus DCV rød farge dot plot på en lineær skala for å søke om 4C gate for å sikre at de tre populasjonene er i en kontinuerlig rekkefølge innenfor porten. Deretter oppretter du et nytt fremoversp scatter-område versus backscatter area tetthet tomt på en lineær skala, og velg den enhetlige størrelsen på celler som en ren rund spermatid befolkning.Etter sortering er de representative renhetene til de separerte leptotene, zygotene, pachytene og diplotene spermatocyttfraksjonene vanligvis mellom 80% til 90%som bekreftet av SYCP3 og Gamma H2AX immunostaining. Renheten av den runde spermatidfraksjonen kan bekreftes av kjernefarging med DCV i kombinasjon med Sp56 og H1t farging, og er også typisk rundt 90%Levedyktigheten til de isolerte cellepopulasjonene er vanligvis over 95%Og gjennomsnittlig total avkastning på hver brøkdel fra en enkelt voksen mus er vanligvis tilstrekkelig for ulike nedstrøms analyse. De sorterte cellene kan brukes til ulike neste generasjons sekvenseringsanalyse for bedre å utforske genuttrykk og regulering under spermatogenese.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Dual Labeling of Neural Crest Cells and Blood Vessels Within Chicken Embryos Using ChickGFP Neural Tube Grafting and Carbocyanine Dye DiI Injection

Dual Labeling of Neural Crest Cells and Blood Vessels Within Chicken Embryos Using ChickGFP Neural Tube Grafting and Carbocyanine Dye DiI Injection

Dobbel merking av nevrale kamceller og blodårer i kyllingembryoer ved hjelp av ChickGFP Neural Tube Grafting og Carbocyanine Dye DiI Injection

All developing organs need to be connected to both the nervous system (for sensory and motor control) as well as the vascular system (for gas exchange, ...

Murine Dermal Fibroblast Isolation by FACS

Muse Dermal Fibroblast Isolering av FACS

Fibroblasts are the principle cell type responsible for secreting extracellular matrix and are a critical component of many organs and tissues. Fibroblast ...

Isolation of Murine Embryonic Hemogenic Endothelial Cells

Isolering av Murine Embryonic Hemogenic endotelceller

The specification of hemogenic endothelial cells from embryonic vascular endothelium occurs during brief developmental periods within distinct tissues, ...

Isolation and Expansion of Mesenchymal Stem/Stromal Cells Derived from Human Placenta Tissue

Isolasjon og utvidelse av Mesenchymale Stem / stromal celler avledet fra human placenta Tissue

Mesenchymal stem/stromal cells (MSC) are promising candidates for use in cell-based therapies. In most cases, therapeutic response appears to be cell-dose ...

The Production of Pluripotent Stem Cells from Mouse Amniotic Fluid Cells Using a Transposon System

Produksjonen av Pluripotent stamceller fra mus fostervann Cells Ved hjelp av en Transposon System

Induced pluripotent stem (iPS) cells are generated from mouse and human somatic cells by forced expression of defined transcription factors using ...

Horizontal Whole Mount: A Novel Processing and Imaging Protocol for Thick, Three-dimensional Tissue Cross-sections of Skin

Horisontal helmontering: En romanbehandlings- og bildeprotokoll for tykke, tredimensjonale vev Tverrsnitt av huden

Processing a tissue of interest to generate a microscopic image that supports a scientific argument can be challenging. The acquisition of high-quality ...

Isolation of Human Endometrial Stromal Cells for In Vitro Decidualization

Isolation of Human Endometrial Stromal Cells for In Vitro Decidualization

Isolering av Endometrial Stromal menneskeceller for In Vitro Decidualization

The differentiation of human endometrial stromal cells (HESC) from fibroblast-like appearance into secretory decidua is a transformation required for ...

Computational Analysis of the Caenorhabditis elegans Germline to Study the Distribution of Nuclei, Proteins, and the Cytoskeleton

Computational Analysis of the Caenorhabditis elegans Germline to Study the Distribution of Nuclei, Proteins, and the Cytoskeleton

Beregningsorientert analyse av Caenorhabditis elegans Germline å studere distribusjon av kjerner, proteiner og Cytoskeleton

The Caenorhabditis elegans (C. elegans) germline is used to study several biologically important processes including stem cell development, apoptosis, and ...

In Vitro Generation of Somite Derivatives from Human Induced Pluripotent Stem Cells

I Vitro generasjon av Somite derivater fra menneske indusert stamceller Pluripotent

In response to signals such as WNTs, bone morphogenetic proteins (BMPs), and sonic hedgehog (SHH) secreted from surrounding tissues, somites (SMs) give ...

Three-dimensional Angiogenesis Assay System using Co-culture Spheroids Formed by Endothelial Colony Forming Cells and Mesenchymal Stem Cells

Tredimensjonale angiogenese analysen system bruker co-kultur Spheroids dannet av endothelial Colony forming celler og Mesenchymal stamceller

Studies in the field of angiogenesis have been aggressively growing in the last few decades with the recognition that angiogenesis is a hallmark of more ...