Name: isolation of murine spermatogenic cells using a violet-excited cell-permeable dna binding dye
Uploaded: 2021-01-14T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Murine Spermatogenic Cells using a Violet-Excited Cell-Permeable DNA Binding Dye at JoVE.com

Agradecemos aos membros dos laboratórios Namekawa, Yoshida e Maezawa pela ajuda; Katie Gerhardt para a edição do manuscrito; Mary Ann Handel por compartilhar o anticorpo H1T, o Núcleo de Citometria de Fluxo de Fluxo do Hospital Infantil de Cincinnati (CCHMC) para compartilhar os equipamentos FACS suportados pelo NIH S10OD023410; Subvenção em Auxílio para Pesquisa Científica (KAKENHI; 17K07424) para T.N.; Bolsa de Pós-Doutorado da Fundação Lalor para a A.S.; AMED-CREST (JP17gm110005h0001) para S.Y.; o Projeto de Pesquisa Grant pela Divisão de Serviços de Pesquisa da Universidade de Azabu, Programa de Branding de Pesquisa da Universidade Privada (2016-2019), Grant-in-Aid for Research Activity Start-up (19K21196), Takeda Science Foundation (2019) e a Uehara Memorial Foundation Research Incentive Grant (2018) para S.M.; Instituto Nacional de Saúde R01 GM122776 para S.H.N.

Este protocolo segue as diretrizes do Comitê Institucional de Atenção e Uso de Animais (protocolo nº. IACUC2018-0040) no Centro Médico do Hospital Infantil de Cincinnati.
1. Instalação de equipamentos e reagentes para a preparação da suspensão das células testiculares
<ol><li>Prepare cada estoque de enzimas na Solução de Sal Balanceado (HBSS) da Hanks e armazene a -20 °C.(Tabela1). NOTA: Prepare-se a qualquer momento antes do experimento.</li>
	<li>Um dia an...

<ol>
	<li>Griswold, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spermatogenesis:+The+Commitment+to+Meiosis.">Spermatogenesis: The Commitment to Meiosis.</a> Physiological Reviews. 96 (1), 1-17 (2016).</li><li>Yoshida, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+Spermatogenesis+Reflects+the+Unity+and+Diversity+of+Tissue+Stem+Cell+Niche+Systems.">Mouse Spermatogenesis Reflects the Unity and Diversity of Tissue Stem Cell Niche Systems.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. , 036186 (2020).</li><li>Rathke, C., Baarends, W. M., Awe, S., Renkawitz-Pohl, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromatin+dynamics+during+spermiogenesis.">Chromatin dynamics during spermiogenesis.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1839 (3), 155-168 (2014).</li><li>Maezawa, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SCML2+promotes+heterochromatin+organization+in+late+spermatogenesis.">SCML2 promotes heterochromatin organization in late spermatogenesis.</a> Journal of Cell Science. 131 (17), 217125 (2018).</li><li>Maezawa, S., Yukawa, M., Alavattam, K. G., Barski, A., Namekawa, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+reorganization+of+open+chromatin+underlies+diverse+transcriptomes+during+spermatogenesis.">Dynamic reorganization of open chromatin underlies diverse transcriptomes during spermatogenesis.</a> Nucleic Acids Research. 46 (2), 593-608 (2018).</li><li>Bellve, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification,+culture,+and+fractionation+of+spermatogenic+cells.">Purification, culture, and fractionation of spermatogenic cells.</a> Methods in Enzymology. 225, 84-113 (1993).</li><li>Bryant, J. M., Meyer-Ficca, M. L., Dang, V. M., Berger, S. L., Meyer, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Separation+of+spermatogenic+cell+types+using+STA-PUT+velocity+sedimentation.">Separation of spermatogenic cell types using STA-PUT velocity sedimentation.</a> Journal of Visualized Experiments. (80), e50648 (2013).</li><li>Gaysinskaya, V., Bortvin, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometry+of+murine+spermatocytes.">Flow cytometry of murine spermatocytes.</a> Current Protocols in Cytometry. 72, (2015).</li><li>Bastos, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometric+characterization+of+viable+meiotic+and+postmeiotic+cells+by+Hoechst+33342+in+mouse+spermatogenesis.">Flow cytometric characterization of viable meiotic and postmeiotic cells by Hoechst 33342 in mouse spermatogenesis.</a> Cytometry Part A. 65 (1), 40-49 (2005).</li><li>Getun, I. V., Torres, B., Bois, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometry+purification+of+mouse+meiotic+cells.">Flow cytometry purification of mouse meiotic cells.</a> Journal of Visualized Experimments. (50), e2602 (2011).</li><li>Gaysinskaya, V., Soh, I. Y., van der Heijden, G. W., Bortvin, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimized+flow+cytometry+isolation+of+murine+spermatocytes.">Optimized flow cytometry isolation of murine spermatocytes.</a> Cytometry Part A. 85 (6), 556-565 (2014).</li><li>Romer, K. A., de Rooiji, D. G., Kojima, M. L., Page, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolating+mitotic+and+meiotic+germ+cells+from+male+mice+by+developmental+synchronization,+staging,+and+sorting.">Isolating mitotic and meiotic germ cells from male mice by developmental synchronization, staging, and sorting.</a> Developmental Biology. 443 (1), 19-34 (2018).</li><li>Lam, K. G., Brick, K., Cheng, G., Pratto, F., Camerini-Otero, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-type-specific+genomics+reveals+histone+modification+dynamics+in+mammalian+meiosis.">Cell-type-specific genomics reveals histone modification dynamics in mammalian meiosis.</a> Nature Communications. 10 (1), 3821 (2019).</li><li>Geisinger, A., Rodriguez-Casuriaga, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+Cytometry+for+the+Isolation+and+Characterization+of+Rodent+Meiocytes.">Flow Cytometry for the Isolation and Characterization of Rodent Meiocytes.</a> Methods in Molecular Biology. 1471, 217-230 (2017).</li><li>da Cruz, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptome+analysis+of+highly+purified+mouse+spermatogenic+cell+populations:+gene+expression+signatures+switch+from+meiotic-to+postmeiotic-related+processes+at+pachytene+stage.">Transcriptome analysis of highly purified mouse spermatogenic cell populations: gene expression signatures switch from meiotic-to postmeiotic-related processes at pachytene stage.</a> BMC Genomics. 17, 294 (2016).</li><li>Rodriguez-Casuriaga, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+preparation+of+rodent+testicular+cell+suspensions+and+spermatogenic+stages+purification+by+flow+cytometry+using+a+novel+blue-laser-excitable+vital+dye.">Rapid preparation of rodent testicular cell suspensions and spermatogenic stages purification by flow cytometry using a novel blue-laser-excitable vital dye.</a> MethodsX. 1, 239-243 (2014).</li><li>Trovero, M. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Revealing+stage-specific+expression+patterns+of+long+noncoding+RNAs+along+mouse+spermatogenesis.">Revealing stage-specific expression patterns of long noncoding RNAs along mouse spermatogenesis.</a> RNA Biology. 17 (3), 350-365 (2020).</li><li>Telford, W. G., Bradford, J., Godfrey, W., Robey, R. W., Bates, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Side+population+analysis+using+a+violet-excited+cell-permeable+DNA+binding+dye.">Side population analysis using a violet-excited cell-permeable DNA binding dye.</a> Stem Cells. 25 (4), 1029-1036 (2007).</li><li>Alavattam, K. G., Abe, H., Sakashita, A., Namekawa, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromosome+Spread+Analyses+of+Meiotic+Sex+Chromosome+Inactivation.">Chromosome Spread Analyses of Meiotic Sex Chromosome Inactivation.</a> Methods in Molecular Biology. 1861, 113-129 (2018).</li><li>Maezawa, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Super-enhancer+switching+drives+a+burst+in+gene+expression+at+the+mitosis-to-meiosis+transition.">Super-enhancer switching drives a burst in gene expression at the mitosis-to-meiosis transition.</a> Nature Structural &amp; Molecular Biology. , (2020).</li><li>Sakashita, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endogenous+retroviruses+drive+species-specific+germline+transcriptomes+in+mammals.">Endogenous retroviruses drive species-specific germline transcriptomes in mammals.</a> Nature Structural &amp; Molecular Biology. , (2020).</li><li>Agrimson, K. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterizing+the+Spermatogonial+Response+to+Retinoic+Acid+During+the+Onset+of+Spermatogenesis+and+Following+Synchronization+in+the+Neonatal+Mouse+Testis.">Characterizing the Spermatogonial Response to Retinoic Acid During the Onset of Spermatogenesis and Following Synchronization in the Neonatal Mouse Testis.</a> Biology of Reproduction. 95 (4), 81 (2016).</li><li>Hogarth, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Turning+a+spermatogenic+wave+into+a+tsunami:+synchronizing+murine+spermatogenesis+using+WIN+18,446.">Turning a spermatogenic wave into a tsunami: synchronizing murine spermatogenesis using WIN 18,446.</a> Biology of Reproduction. 88 (2), 40 (2013).</li><li>Patel, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+reorganization+of+the+genome+shapes+the+recombination+landscape+in+meiotic+prophase.">Dynamic reorganization of the genome shapes the recombination landscape in meiotic prophase.</a> Nature Structural &amp; Molecular Biology. 26 (3), 164-174 (2019).</li><li>Alavattam, K. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Attenuated+chromatin+compartmentalization+in+meiosis+and+its+maturation+in+sperm+development.">Attenuated chromatin compartmentalization in meiosis and its maturation in sperm development.</a> Nature Structural &amp; Molecular Biology. 26 (3), 175-184 (2019).</li><li>Adams, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNF8+and+SCML2+cooperate+to+regulate+ubiquitination+and+H3K27+acetylation+for+escape+gene+activation+on+the+sex+chromosomes.">RNF8 and SCML2 cooperate to regulate ubiquitination and H3K27 acetylation for escape gene activation on the sex chromosomes.</a> PLoS Genetics. 14 (2), 1007233 (2018).</li><li>Wiltshire, T., Park, C., Caldwell, K. A., Handel, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induced+premature+G2/M-phase+transition+in+pachytene+spermatocytes+includes+events+unique+to+meiosis.">Induced premature G2/M-phase transition in pachytene spermatocytes includes events unique to meiosis.</a> Developmental Biology. 169 (2), 557-567 (1995).</li></ol>

Aqui apresentamos um protocolo prático e simples para isolar subpopulações de espermatotozóides e espermatóides de um único rato adulto. Para garantir a reprodutibilidade deste protocolo, existem algumas etapas críticas que precisam de atenção. Antes da digestão enzimápica, a etapa de lavagem visa remover células intersticiais; após a digestão, esta etapa ajuda a remover espermatozoides e detritos. Lavar/centrifugar 3 vezes é importante. Em nossa receita tampão de dissociação, a combinação de várias ...

A espermatogênese é um processo complexo em que uma pequena população de células-tronco espermatogonial sustenta a produção contínua de um grande número de espermatozoides ao longo da vida adulta1,2. Durante a espermatogênese, a remodelação dinâmica da cromatina ocorre quando as células espermatogênicas sofrem meiose para produzir espermatóides haploides3,4,5. O isolamento dos espermatocitos meioticos é essencial para a investigação molecular, e várias abordagens diferentes para isolados espermatotocitos meioticos foram estabelecidas, incluindo separação baseada em sedimentação6,7 e triagem celular ativada por fluorescência (FACS)8,9,10,11,12,13,14,15,16,17. No entanto, esses métodos têm limitações técnicas. Enquanto a separação baseada em sedimentação produz um grande número de células5,6,7, é trabalhosa. O método estabelecido baseado em FACS usa hoechst 33342 (Ho342) para separar espermatocitotas meioticos com base no conteúdo de DNA e propriedades de dispersão de luz e requer classificadores de células FACS equipados com um laser ultravioleta (UV)8,9,10,11. Métodos alternativos baseados em FACS requerem linhas de camundongos transgênicos que expressam proteínas florescentes, sincronização da espermatogênese12, ou fixação celular e rotulagem de anticorpos que não são compatíveis com o isolamento das células vivas13. Embora exista outro método alternativo usando um corante de ligação de DNA permeável celular, DyeCycle Mancha verde14,15,16,17, este método é recomendado para o isolamento de células espermatogênicas de testis juvenis. Portanto, há uma necessidade crítica de desenvolver um método de isolamento simples e robusto para espermatos meioticos vivos que podem ser aplicados a qualquer cepa de camundongos de qualquer idade e que pode ser realizado usando qualquer classificador de células FACS.
Aqui descrevemos um protocolo de isolamento celular tão procurado usando a mancha DyeCycle Violet (DCV). DCV é uma baixa citotoxicidade, corante de dna permeável celular estruturalmente semelhante ao Ho342, mas com um espectro de excitação deslocado para a faixa violeta18. Além disso, o DCV tem um espectro de emissões mais amplo em comparação com o DCG. Assim, ele pode ser animado por lasers UV e violeta, o que melhora a flexibilidade do equipamento, permitindo o uso de um classificador de células FACS não equipado com um laser UV. O protocolo DCV apresentado aqui usa separação bidimensional com azul DCV e vermelho DCV, imitando a vantagem do protocolo Ho342. Com essa vantagem, nosso protocolo DCV nos permite isolar células germinativas altamente enriquecidas dos testíis adultos. Fornecemos um protocolo de gating detalhado para isolar células espermatogênicas vivas de testículos de camundongos adultos de um rato (de dois testículos). Também descrevemos um protocolo eficiente e rápido para preparar a suspensão unicelular a partir de testículos de mouse que podem ser usados para este isolamento celular. O procedimento requer um curto período de tempo para ser concluído (preparação de suspensão de célula única - 1 hora, coloração de corante - 30 min, e classificação celular - 2-3 horas: total - 4-5 horas, dependendo do número de células necessárias; Figura 1). Após o isolamento celular, uma ampla gama de aplicações a jusante, incluindo RNA-seq, ATAC-seq, ChIP-seq e cultura celular podem ser concluídas.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>1.5 ml tube</td>
			<td>Watson</td>
			<td>131-7155C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 mm Petri dish</td>
			<td>Corning, Falcon</td>
			<td>351029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL Centrifuge tube</td>
			<td>Watson</td>
			<td>1332-015S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 ml polystyrene tube with cell strainer snap cap (35 &#181;m nylon mesh)</td>
			<td>Corning, Falcon</td>
			<td>352235</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL Centrifuge tube</td>
			<td>Watson</td>
			<td>1342-050S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>60 mm Petri dish</td>
			<td>Corning, Falcon</td>
			<td>351007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70 &#181;m nylon mesh</td>
			<td>Corning, Falcon</td>
			<td>352350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell sorter</td>
			<td>Sony</td>
			<td>SH800S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase, recombinant, Animal-derived-free</td>
			<td>FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation</td>
			<td>036-23141</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase, Type 1</td>
			<td>Worthington</td>
			<td>LS004196</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cover glass</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>12-544-G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytospin 3</td>
			<td>Shandon</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI (4&#39;,6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride)</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>D1306</td>
			<td>working concentration: 0.1 &#956;g/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dnase I</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D5025-150KU</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey serum</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S30-M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s phosphate-buffered saline (DPBS)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium (DMEM)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11885076</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>16000044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hostone H1T antibody</td>
			<td>gift from Mary Ann Handel</td>
			<td></td>
			<td>1/2000 diluted</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hank&#8217;s balanced salt solution (HBSS)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14175095</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hyaluronidase from bovine testes</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H3506-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline (PBS)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P5493-4L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipettemen</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProLong Gold Antifade Mountant</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>P36930</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rH2AX antibody</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>05-635</td>
			<td>working concentration: 2 &#956;g/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sperm Fertilization Protein 56 (Sp56) antibody</td>
			<td>QED Bioscience</td>
			<td>55101</td>
			<td>working concentration: 0.5 &#956;g/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterilized forceps and scissors</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superfrost /Plus Microscope Slides</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>12-550-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYCP3 antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab205846</td>
			<td>working concentration: 5 &#956;g/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TWEEN 20 (Polysorbate 20)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P9416</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vybrant DyeCycle Violet Stain (DCV)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>V35003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of murine spermatogenic cells using a violet-excited cell-permeable dna binding dye

O isolamento dos espermatocitotas meioticos é essencial para investigar mecanismos moleculares subjacentes à meiose e espermatogênese. Embora existam protocolos de isolamento celular estabelecidos usando manchas hoechst 33342 em combinação com a classificação celular ativada pela fluorescência, ela requer classificadores celulares equipados com um laser ultravioleta. Aqui descrevemos um protocolo de isolamento celular usando a mancha DyeCycle Violet (DCV), um corante de ligação de DNA de baixa citotoxicidade estruturalmente semelhante ao Hoechst 33342. O DCV pode ser animado por lasers ultravioleta e violeta, o que melhora a flexibilidade da escolha do equipamento, incluindo um classificador de células não equipado com um laser ultravioleta. Usando este protocolo, pode-se isolar três subpopulações de células vivas em prophase I meiotic, incluindo leptoteno/zygotene, paquitene e espermatocitotes diploteno, bem como espermatoides redondos pós-meioticos. Também descrevemos um protocolo para preparar suspensão de célula única de testículos de mouse. No geral, o procedimento requer um curto período de tempo para ser concluído (4-5 horas, dependendo do número de células necessárias), o que facilita muitas aplicações a jusante.

Um resultado representativo deste protocolo de classificação é mostrado na Figura 3. O tempo total de triagem de dois testículos (um rato) é geralmente em torno de 3 horas, o que depende da concentração da suspensão celular e da velocidade de classificação. Após a triagem, a pureza dos espermatocitodos é confirmada pela imunossuagem de SYCP3 e γH2AX (Figura 3A). As frações representativas de L/Z, P, D espermatocyte estão em torno de 80,4%, 90,6% ...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Murine Spermatogenic Cells using a Violet-Excited Cell-Permeable DNA Binding Dye at JoVE.com

Isolation of Murine Spermatogenic Cells using a Violet-Excited Cell-Permeable DNA Binding Dye

Aqui apresentamos um método simples e eficiente para isolar células germinativas vivas e pós-meiotic de testículos de camundongos adultos. Usando uma baixa citotoxicidade, corante de DNA com proteção violeta e classificação celular ativada por fluorescência, pode-se isolar populações de células espermatogênicas altamente enriquecidas para muitas aplicações a jusante.

Isolamento de células spermatogênicas murinas usando um corante de ligação de DNA permeável celular-permeável violeta

Isolation of meiotic spermatocytes is essential to investigate molecular mechanisms underlying meiosis and spermatogenesis. Although there are established ...

Este novo método eficiente para isolar subpopulações de espermatototos e espermatozoides de camundongos adultos pode ser usado para investigar os mecanismos moleculares subjacentes à meiose e espermatogênese. Este método usa um corante de ligação de DNA de baixa citotoxicidade com um amplo espectro de excitação que pode ser aplicado às ordens FACS mais usadas atualmente. Este método é muito simples.O aspecto mais desafiador é o fluxo de citometria, mas a estratégia detalhada de gating deve ajudar na adaptação do protocolo a outras células. Demonstrando o procedimento estará Yu-Han Yeh, um assistente de pesquisa do Laboratório satoshi Namekawa. Depois de colher ambos os testículos de um rato macho de oito semanas de idade, coloque os tecidos em uma placa de Petri de 60 milímetros contendo dois mililitros de PBS gelado e remova a tunica albuginea.Separe suavemente os testículos com fórceps para dispersar ligeiramente os túbulos seminiferos. E transfira os túbulos para uma gota de PBS gelado fresco em uma placa de Petri de 100 milímetros. Use os fórceps para desembaraçar suavemente os túbulos e lavar os túbulos em três gotículas adicionais de PBS como apenas demonstrado.Após a última lavagem, coloque os túbulos seminiferos desemaranhados em um tubo de 15 mililitros, contendo dois mililitros de tampão de dissociação para uma incubação de 20 minutos a 37 graus Celsius. No final da incubação, use uma pipeta de 1000 microliteres para in pipeta suavemente os túbulos 20 vezes, antes de devolver o tubo à incubadora por mais seis minutos. No final da incubação, pipeta os tecidos mais 20 vezes, antes de devolver o tubo à incubadora.Após três minutos, pipeta suavemente os túbulos 10 vezes ou até que não restem pedaços de tecido visíveis, antes de parar a dissociação com 10 mililitros de tampão FACS. Em seguida, centrífuga para a suspensão tecidual duas vezes usando um adicional de 10 mililitros para tampão FACS fresco para a segunda lavagem para remover o espermatozoide e o máximo de detritos possível. Para colorar as células para análise citométrica de fluxo, suspenda a pelota em três mililitros de tampão FACS.E filtrar a suspensão celular através de um coador de células de nylon de 70 mícrons, em um tubo de 50 mililitros. Após a contagem, transfira 10% das células para um novo tubo no gelo como o controle negativo não manchado. E misture completamente seis microliters de mancha de DCV na suspensão restante da célula.Depois de uma incubação de 30 minutos a 37 graus Celsius no escuro com agitação suave a cada 10 minutos, adicione cinco microliters de DNase I às células. E filtrar as células através de um filtro de malha de nylon de 35 mícrons em um tubo FACS de cinco mililitros no gelo. Para análise citométrica de fluxo das células, crie um novo experimento no software de análise de fluxo e, sob o menu de ferramentas de planilha, clique em nova densidade para criar uma área de dispersão para a frente versus o gráfico de densidade da área de backscatter em uma escala linear.Clique em um novo histograma para criar um gráfico de histograma azul DCV em uma escala logarítmica. E clique em iniciar e gravar para começar a processar a amostra não manchada. Enquanto a amostra estiver em execução, clique no detector e nas configurações do limiar para ajustar as tensões PMT de dispersão dianteira e lateral para colocar as células não manchadas na escala do gráfico de dispersão para frente e para trás.Ajuste a tensão PMT para o canal jappy para localizar a posição da população negativa do DCV na primeira década do lote logarítmico do histograma azul DCV. Em seguida, clique em parar para descarregar a amostra não manchada. Depois de brevemente vórtice e carregamento da amostra manchada, clique no próximo tubo para criar uma nova planilha para a amostra.Defina o cítmetro para adquirir pelo menos uma vez 10 para os seis eventos, e clique em iniciar e gravar. Em seguida, clique em nova densidade para criar altura de dispersão para a frente versus largura de dispersão para a frente. E dcv azul versus DCV gráficos de densidade vermelha em uma escala linear.Na área de dispersão dianteira versus o gráfico de densidade da área do backscatter, use a ferramenta polígono para desenhar um portão chamado células para incluir a maioria das células e excluir pequenos detritos. Aplique este portão à altura de dispersão dianteira versus o gráfico de largura de dispersão para a frente e use a ferramenta retângulo para desenhar o portão de uma única célula para excluir células não únicas. Aplique o portão da célula única no gráfico de densidade vermelha DCV versus DCV e ajuste a escala para capturar um perfil estendido.Use a ferramenta polígono para desenhar um portão DCV para excluir as células e a população lateral não manchadas, e aplique o portão a uma trama de histograma azul DCV em uma escala linear. Os três principais picos referem-se aos diferentes conteúdos de DNA 1C, 2C e 4C. Crie um segundo gráfico de densidade vermelha DCV em escala linear.E portão de trás do portão DCV para o lote para localizar as populações 1C e 4C. Crie outra trama de densidade vermelha DCV versus DCV em escala linear. E use a ferramenta de elipse para desenhar um portão na população 1C.Use a ferramenta polígono para portalar a população 4C com uma curva contínua. E criar outra trama de densidade vermelha DCV em escala linear. Use a ferramenta polígono para criar um portão 4C um.Em um novo gráfico de dispersão para a frente, use a ferramenta de elipse para criar paquiteno, diploteno e leptoteno, portões de espermatocitatocito de zygoteno. Quando todos os portões forem desenhados, crie um novo gráfico de pontos de ponto azul DCV versus DCV em escala linear para aplicar o portão 4C para garantir que as três populações estejam em uma ordem contínua dentro do portão. Em seguida, crie uma nova área de dispersão para a frente versus o gráfico de densidade da área de backscatter em uma escala linear, e selecione o tamanho unificado das células como uma população espermicida redonda pura.Após a triagem, as purezas representativas das frações de espermatotocitetos de leptoteno, zigoteno, paquiteno e diploteno são tipicamente entre 80% e 90%, conforme confirmado pelas imunostaining SYCP3 e Gamma H2AX. A pureza da facção esperoxida redonda pode ser confirmada por coloração de núcleo com DCV em combinação com a coloração de Sp56 e H1t, e também é tipicamente em torno de 90% A viabilidade das populações celulares isoladas é geralmente superior a 95% E os rendimentos totais médios de cada fração de um único rato adulto são tipicamente suficientes para várias análises a jusante. As células classificadas podem ser usadas para várias análises de sequenciamento de próxima geração para explorar melhor a expressão genética e a regulação durante a espermatogênese.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Dual Labeling of Neural Crest Cells and Blood Vessels Within Chicken Embryos Using ChickGFP Neural Tube Grafting and Carbocyanine Dye DiI Injection

Dual Labeling of Neural Crest Cells and Blood Vessels Within Chicken Embryos Using ChickGFP Neural Tube Grafting and Carbocyanine Dye DiI Injection

Rotulagem dupla de células de crista neural e vasos sanguíneos dentro de embriões de frango usando enxerto de tubo neural chickGFP e injeção de dii de corante de carbocyanina

All developing organs need to be connected to both the nervous system (for sensory and motor control) as well as the vascular system (for gas exchange, ...

Biologia do Desenvolvimento

Murine Dermal Fibroblast Isolation by FACS

Isolamento de fibroblastos de murino Dérmica por FACS

Fibroblasts are the principle cell type responsible for secreting extracellular matrix and are a critical component of many organs and tissues. Fibroblast ...

Isolation of Murine Embryonic Hemogenic Endothelial Cells

Isolamento de células embrionárias de murino hegemônicos endoteliais

The specification of hemogenic endothelial cells from embryonic vascular endothelium occurs during brief developmental periods within distinct tissues, ...

Isolation and Expansion of Mesenchymal Stem/Stromal Cells Derived from Human Placenta Tissue

Isolamento e expansão de CTM / células estromais derivadas de placenta humana Tissue

Mesenchymal stem/stromal cells (MSC) are promising candidates for use in cell-based therapies. In most cases, therapeutic response appears to be cell-dose ...

The Production of Pluripotent Stem Cells from Mouse Amniotic Fluid Cells Using a Transposon System

A produção de células-tronco pluripotentes de rato amniótico células do líquido Usando um Sistema Transposon

Induced pluripotent stem (iPS) cells are generated from mouse and human somatic cells by forced expression of defined transcription factors using ...

Horizontal Whole Mount: A Novel Processing and Imaging Protocol for Thick, Three-dimensional Tissue Cross-sections of Skin

Horizontal Whole Mount: um protocolo de processamento e imagem de Novel para secções transversais grossas de tecidos tridimensionais

Processing a tissue of interest to generate a microscopic image that supports a scientific argument can be challenging. The acquisition of high-quality ...

Isolation of Human Endometrial Stromal Cells for In Vitro Decidualization

Isolation of Human Endometrial Stromal Cells for In Vitro Decidualization

Isolamento de células do estroma Endometrial humanas para In Vitro Decidualization

The differentiation of human endometrial stromal cells (HESC) from fibroblast-like appearance into secretory decidua is a transformation required for ...

Computational Analysis of the Caenorhabditis elegans Germline to Study the Distribution of Nuclei, Proteins, and the Cytoskeleton

Computational Analysis of the Caenorhabditis elegans Germline to Study the Distribution of Nuclei, Proteins, and the Cytoskeleton

Análise computacional do Germline Caenorhabditis elegans , para estudar a distribuição de núcleos, as proteínas e o citoesqueleto

The Caenorhabditis elegans (C. elegans) germline is used to study several biologically important processes including stem cell development, apoptosis, and ...

In Vitro Generation of Somite Derivatives from Human Induced Pluripotent Stem Cells

Na geração de Vitro do Somite derivados de humanos induzida por células tronco pluripotentes

In response to signals such as WNTs, bone morphogenetic proteins (BMPs), and sonic hedgehog (SHH) secreted from surrounding tissues, somites (SMs) give ...

Three-dimensional Angiogenesis Assay System using Co-culture Spheroids Formed by Endothelial Colony Forming Cells and Mesenchymal Stem Cells

Sistema tridimensional do ensaio da angiogênese usando spheroids da co-cultura dados forma pela colônia endothelial que dá forma a pilhas e às pilhas de haste mesenchymal

Studies in the field of angiogenesis have been aggressively growing in the last few decades with the recognition that angiogenesis is a hallmark of more ...