Name: isolation of murine spermatogenic cells using a violet-excited cell-permeable dna binding dye
Uploaded: 2021-01-14T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Murine Spermatogenic Cells using a Violet-Excited Cell-Permeable DNA Binding Dye at JoVE.com

Мы благодарим сотрудников лабораторий Намекава, Есида и Маэдзава за помощь; Кэти Герхардт для редактирования рукописи; Мэри Энн Гендель для обмена H1T антитела, Цинциннати Детская больница медицинский центр (CCHMC) Научно-исследовательский поток цитометрии ядро для обмена оборудование FACS при поддержке NIH S10OD023410; Грант-в-помощи для научных исследований (KAKENHI; 17K07424) к T.N.; Постдокторантство Фонда Лалора А.С.; AMED-CREST (JP17gm110005h0001) до S.Y.; грант исследовательского проекта, предоставленный Отделом исследовательских услуг Университета Азабу, Министерство образования, культуры, спорта, науки и техники (MEXT) - поддерживаемая программа проекта по брендингу частных университетов (2016-2019), Грант-в-помощи для научно-исследовательской деятельности Start-up (19K21196), Научный фонд Такеды (2019), и Uehara Memorial Foundation Research Incentive Грант (2018) для S.M.; Национальный институт здравоохранения R01 GM122776 до S.H.N.

Этот протокол соответствует руководящим принципам Институционального комитета по уходу за животными и использованию (протокол No. IACUC2018-0040) в медицинском центре детской больницы Цинциннати.
1. Установка оборудования и реагентов для подготовки подвески яичек
<ol><li>Подгот?...

<ol>
	<li>Griswold, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spermatogenesis:+The+Commitment+to+Meiosis.">Spermatogenesis: The Commitment to Meiosis.</a> Physiological Reviews. 96 (1), 1-17 (2016).</li><li>Yoshida, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+Spermatogenesis+Reflects+the+Unity+and+Diversity+of+Tissue+Stem+Cell+Niche+Systems.">Mouse Spermatogenesis Reflects the Unity and Diversity of Tissue Stem Cell Niche Systems.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. , 036186 (2020).</li><li>Rathke, C., Baarends, W. M., Awe, S., Renkawitz-Pohl, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromatin+dynamics+during+spermiogenesis.">Chromatin dynamics during spermiogenesis.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1839 (3), 155-168 (2014).</li><li>Maezawa, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SCML2+promotes+heterochromatin+organization+in+late+spermatogenesis.">SCML2 promotes heterochromatin organization in late spermatogenesis.</a> Journal of Cell Science. 131 (17), 217125 (2018).</li><li>Maezawa, S., Yukawa, M., Alavattam, K. G., Barski, A., Namekawa, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+reorganization+of+open+chromatin+underlies+diverse+transcriptomes+during+spermatogenesis.">Dynamic reorganization of open chromatin underlies diverse transcriptomes during spermatogenesis.</a> Nucleic Acids Research. 46 (2), 593-608 (2018).</li><li>Bellve, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification,+culture,+and+fractionation+of+spermatogenic+cells.">Purification, culture, and fractionation of spermatogenic cells.</a> Methods in Enzymology. 225, 84-113 (1993).</li><li>Bryant, J. M., Meyer-Ficca, M. L., Dang, V. M., Berger, S. L., Meyer, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Separation+of+spermatogenic+cell+types+using+STA-PUT+velocity+sedimentation.">Separation of spermatogenic cell types using STA-PUT velocity sedimentation.</a> Journal of Visualized Experiments. (80), e50648 (2013).</li><li>Gaysinskaya, V., Bortvin, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometry+of+murine+spermatocytes.">Flow cytometry of murine spermatocytes.</a> Current Protocols in Cytometry. 72, (2015).</li><li>Bastos, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometric+characterization+of+viable+meiotic+and+postmeiotic+cells+by+Hoechst+33342+in+mouse+spermatogenesis.">Flow cytometric characterization of viable meiotic and postmeiotic cells by Hoechst 33342 in mouse spermatogenesis.</a> Cytometry Part A. 65 (1), 40-49 (2005).</li><li>Getun, I. V., Torres, B., Bois, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometry+purification+of+mouse+meiotic+cells.">Flow cytometry purification of mouse meiotic cells.</a> Journal of Visualized Experimments. (50), e2602 (2011).</li><li>Gaysinskaya, V., Soh, I. Y., van der Heijden, G. W., Bortvin, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimized+flow+cytometry+isolation+of+murine+spermatocytes.">Optimized flow cytometry isolation of murine spermatocytes.</a> Cytometry Part A. 85 (6), 556-565 (2014).</li><li>Romer, K. A., de Rooiji, D. G., Kojima, M. L., Page, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolating+mitotic+and+meiotic+germ+cells+from+male+mice+by+developmental+synchronization,+staging,+and+sorting.">Isolating mitotic and meiotic germ cells from male mice by developmental synchronization, staging, and sorting.</a> Developmental Biology. 443 (1), 19-34 (2018).</li><li>Lam, K. G., Brick, K., Cheng, G., Pratto, F., Camerini-Otero, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-type-specific+genomics+reveals+histone+modification+dynamics+in+mammalian+meiosis.">Cell-type-specific genomics reveals histone modification dynamics in mammalian meiosis.</a> Nature Communications. 10 (1), 3821 (2019).</li><li>Geisinger, A., Rodriguez-Casuriaga, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+Cytometry+for+the+Isolation+and+Characterization+of+Rodent+Meiocytes.">Flow Cytometry for the Isolation and Characterization of Rodent Meiocytes.</a> Methods in Molecular Biology. 1471, 217-230 (2017).</li><li>da Cruz, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptome+analysis+of+highly+purified+mouse+spermatogenic+cell+populations:+gene+expression+signatures+switch+from+meiotic-to+postmeiotic-related+processes+at+pachytene+stage.">Transcriptome analysis of highly purified mouse spermatogenic cell populations: gene expression signatures switch from meiotic-to postmeiotic-related processes at pachytene stage.</a> BMC Genomics. 17, 294 (2016).</li><li>Rodriguez-Casuriaga, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+preparation+of+rodent+testicular+cell+suspensions+and+spermatogenic+stages+purification+by+flow+cytometry+using+a+novel+blue-laser-excitable+vital+dye.">Rapid preparation of rodent testicular cell suspensions and spermatogenic stages purification by flow cytometry using a novel blue-laser-excitable vital dye.</a> MethodsX. 1, 239-243 (2014).</li><li>Trovero, M. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Revealing+stage-specific+expression+patterns+of+long+noncoding+RNAs+along+mouse+spermatogenesis.">Revealing stage-specific expression patterns of long noncoding RNAs along mouse spermatogenesis.</a> RNA Biology. 17 (3), 350-365 (2020).</li><li>Telford, W. G., Bradford, J., Godfrey, W., Robey, R. W., Bates, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Side+population+analysis+using+a+violet-excited+cell-permeable+DNA+binding+dye.">Side population analysis using a violet-excited cell-permeable DNA binding dye.</a> Stem Cells. 25 (4), 1029-1036 (2007).</li><li>Alavattam, K. G., Abe, H., Sakashita, A., Namekawa, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromosome+Spread+Analyses+of+Meiotic+Sex+Chromosome+Inactivation.">Chromosome Spread Analyses of Meiotic Sex Chromosome Inactivation.</a> Methods in Molecular Biology. 1861, 113-129 (2018).</li><li>Maezawa, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Super-enhancer+switching+drives+a+burst+in+gene+expression+at+the+mitosis-to-meiosis+transition.">Super-enhancer switching drives a burst in gene expression at the mitosis-to-meiosis transition.</a> Nature Structural &amp; Molecular Biology. , (2020).</li><li>Sakashita, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endogenous+retroviruses+drive+species-specific+germline+transcriptomes+in+mammals.">Endogenous retroviruses drive species-specific germline transcriptomes in mammals.</a> Nature Structural &amp; Molecular Biology. , (2020).</li><li>Agrimson, K. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterizing+the+Spermatogonial+Response+to+Retinoic+Acid+During+the+Onset+of+Spermatogenesis+and+Following+Synchronization+in+the+Neonatal+Mouse+Testis.">Characterizing the Spermatogonial Response to Retinoic Acid During the Onset of Spermatogenesis and Following Synchronization in the Neonatal Mouse Testis.</a> Biology of Reproduction. 95 (4), 81 (2016).</li><li>Hogarth, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Turning+a+spermatogenic+wave+into+a+tsunami:+synchronizing+murine+spermatogenesis+using+WIN+18,446.">Turning a spermatogenic wave into a tsunami: synchronizing murine spermatogenesis using WIN 18,446.</a> Biology of Reproduction. 88 (2), 40 (2013).</li><li>Patel, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+reorganization+of+the+genome+shapes+the+recombination+landscape+in+meiotic+prophase.">Dynamic reorganization of the genome shapes the recombination landscape in meiotic prophase.</a> Nature Structural &amp; Molecular Biology. 26 (3), 164-174 (2019).</li><li>Alavattam, K. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Attenuated+chromatin+compartmentalization+in+meiosis+and+its+maturation+in+sperm+development.">Attenuated chromatin compartmentalization in meiosis and its maturation in sperm development.</a> Nature Structural &amp; Molecular Biology. 26 (3), 175-184 (2019).</li><li>Adams, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNF8+and+SCML2+cooperate+to+regulate+ubiquitination+and+H3K27+acetylation+for+escape+gene+activation+on+the+sex+chromosomes.">RNF8 and SCML2 cooperate to regulate ubiquitination and H3K27 acetylation for escape gene activation on the sex chromosomes.</a> PLoS Genetics. 14 (2), 1007233 (2018).</li><li>Wiltshire, T., Park, C., Caldwell, K. A., Handel, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induced+premature+G2/M-phase+transition+in+pachytene+spermatocytes+includes+events+unique+to+meiosis.">Induced premature G2/M-phase transition in pachytene spermatocytes includes events unique to meiosis.</a> Developmental Biology. 169 (2), 557-567 (1995).</li></ol>

Здесь мы представляем практический и простой протокол для изоляции субпопуляций сперматозоидов и сперматозоидов от одного взрослого самца мыши. Для обеспечения воспроизводимости этого протокола необходимо принять некоторые важные меры. Перед перевариванием ферментов, мыть шаг напр...

Сперматогенез является сложным процессом, в котором небольшая популяция сперматозоидов стволовых клеток поддерживать непрерывное производство большого количества спермы на протяжениивсей взрослой жизни 1,2. Во время сперматогенеза, динамическая хроматин ремоделирование происходит, когда сперматозоидные клетки проходят мейоз для производства гаплоидныхсперматозоидов 3,4,5. Изоляция мейотических сперматозоидов имеет важное значение для молекулярного исследования, и несколько различных подходов к изоляции меиотических сперматозоидов были созданы, в том числеосадочных основе разделения 6,7 и флуоресценции активированныхклеток сортировки(FACS) 8,9,10,11,12,13,14,15,16,17. Однако эти методы имеют технические ограничения. В то время как разделение на основе осадочных пород даетбольшое количество клеток 5,6,7,это трудоемкий. Установленный facS-основанный метод использует Hoechst 33342 (Ho342) для того чтобы отделить meiotic сперматиноциты основанные на содержании ДНАА и светлых scattering свойствах и требует сортеров клетки FACS оборудованных с ультрафиолетовым (УФ)лазером 8,9,10,11. Альтернативные методы на основе FACS требуют трансгенных линий мыши, которые выражают флуоресцентныебелки, синхронизация сперматогенеза 12, или фиксации клеток и маркировки антител, что не совместимо с изоляцией живыхклеток 13. Хотя есть еще один альтернативный метод с использованием клеток проницаемой ДНК связывания красителя, DyeCycle Зеленыйпятно 14,15,16,17, этот метод рекомендуется для изоляции сперматозоидных клеток от несовершеннолетних яичка. Таким образом, существует критическая необходимость разработки простого и надежного метода изоляции живых мейотических сперматозоидов, которые могут быть применены к любому штамму мыши любого возраста и которые могут быть выполнены с помощью любого сортера клеток FACS.
Здесь мы описываем такой давно испрашиваемый протокол изоляции клеток с использованием пятна DyeCycle Violet (DCV). DCV является низкой цитотоксичности, клеток проницаемой ДНК связывания красителя структурно похож на Ho342, но с возбуждением спектра смещается в сторону фиолетовогодиапазона 18. Кроме того, DCV имеет более широкий спектр выбросов по сравнению с DCG. Таким образом, он может быть возбужден как УФ, так и фиолетовые лазеры, что повышает гибкость оборудования, что позволяет использовать сортер клеток FACS, не оборудованный УФ-лазером. Протокол DCV, представленный здесь, использует двумерное разделение с dcV синим и DCV красным, имитируя преимущество протокола Ho342. С этим преимуществом, наш протокол DCV позволяет нам изолировать высокообогащеные зародышевые клетки от взрослого яичка. Мы предоставляем подробный протокол закрытости, чтобы изолировать живые сперматозоидные клетки от взрослых мышей яички одной мыши (из двух яище). Мы также описываем эффективный и быстрый протокол для подготовки одноклеточной подвески от мышей испытаний, которые могут быть использованы для этой изоляции клеток. Процедура требует короткого времени (подготовка одноклеточной суспензии - 1 час, окрашивания красителя - 30 мин, а сортировки клеток - 2-3 часа: всего - 4-5 часов в зависимости от количества необходимых клеток; Рисунок 1). После изоляции ячеек может быть завершен широкий спектр приложений ниже по течению, включая РНК-сек, ATAC-seq, ChIP-seq и культуру клеток.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>1.5 ml tube</td>
			<td>Watson</td>
			<td>131-7155C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 mm Petri dish</td>
			<td>Corning, Falcon</td>
			<td>351029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL Centrifuge tube</td>
			<td>Watson</td>
			<td>1332-015S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 ml polystyrene tube with cell strainer snap cap (35 &#181;m nylon mesh)</td>
			<td>Corning, Falcon</td>
			<td>352235</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL Centrifuge tube</td>
			<td>Watson</td>
			<td>1342-050S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>60 mm Petri dish</td>
			<td>Corning, Falcon</td>
			<td>351007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70 &#181;m nylon mesh</td>
			<td>Corning, Falcon</td>
			<td>352350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell sorter</td>
			<td>Sony</td>
			<td>SH800S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase, recombinant, Animal-derived-free</td>
			<td>FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation</td>
			<td>036-23141</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase, Type 1</td>
			<td>Worthington</td>
			<td>LS004196</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cover glass</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>12-544-G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytospin 3</td>
			<td>Shandon</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI (4&#39;,6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride)</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>D1306</td>
			<td>working concentration: 0.1 &#956;g/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dnase I</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D5025-150KU</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey serum</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S30-M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s phosphate-buffered saline (DPBS)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium (DMEM)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11885076</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>16000044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hostone H1T antibody</td>
			<td>gift from Mary Ann Handel</td>
			<td></td>
			<td>1/2000 diluted</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hank&#8217;s balanced salt solution (HBSS)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14175095</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hyaluronidase from bovine testes</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H3506-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline (PBS)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P5493-4L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipettemen</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProLong Gold Antifade Mountant</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>P36930</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rH2AX antibody</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>05-635</td>
			<td>working concentration: 2 &#956;g/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sperm Fertilization Protein 56 (Sp56) antibody</td>
			<td>QED Bioscience</td>
			<td>55101</td>
			<td>working concentration: 0.5 &#956;g/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterilized forceps and scissors</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superfrost /Plus Microscope Slides</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>12-550-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYCP3 antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab205846</td>
			<td>working concentration: 5 &#956;g/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TWEEN 20 (Polysorbate 20)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P9416</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vybrant DyeCycle Violet Stain (DCV)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>V35003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of murine spermatogenic cells using a violet-excited cell-permeable dna binding dye

Изоляция мейотических сперматозоидов имеет важное значение для исследования молекулярных механизмов, лежащих в основе мейоза и сперматогенеза. Хотя существуют установленные протоколы изоляции клеток с использованием Hoechst 33342 окрашивания в сочетании с флуоресценции активированной сортировки клеток, он требует сортировки клеток оснащен ультрафиолетовым лазером. Здесь мы описываем протокол изоляции клеток с использованием пятна DyeCycle Violet (DCV), низкого цитотоксичности ДНК связывания красителя структурно похож на Hoechst 33342. DCV может быть возбужден как ультрафиолетовых, так и фиолетовых лазеров, что повышает гибкость выбора оборудования, в том числе сортера клеток, не оснащенных ультрафиолетовым лазером. Используя этот протокол, можно изолировать три живых клеток субпопуляции в мейотической профазы I, в том числе лептотен / зиготен, пахитен, и диплотен сперматоцитов, а также пост-мейотических круглых сперматозоидов. Мы также описываем протокол для подготовки одноклеточной подвески от мышей-тестов. В целом, процедура требует короткого времени для завершения (4-5 часов в зависимости от количества необходимых ячеек), что облегчает многие приложения вниз по течению.

Репрезентативный результат этого протокола сортировки показан на рисунке 3. Общее время сортировки двух яищей (одна мышь) обычно составляет около 3 часов, что зависит от концентрации клеточной подвески и скорости сортировки. После сортировки чистота сперматозоидов под?...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Murine Spermatogenic Cells using a Violet-Excited Cell-Permeable DNA Binding Dye at JoVE.com

Isolation of Murine Spermatogenic Cells using a Violet-Excited Cell-Permeable DNA Binding Dye

Здесь мы представляем простой и эффективный метод изоляции живых мейотических и постмейотических зародышевых клеток от взрослых мышей. Используя низкоцитотоксичность, фиолетовый возбужденный краситель связывания ДНК и флуоресценцию активированной сортировки клеток, можно изолировать высокообогащеные популяции сперматозоидов для многих нисходящих приложений.

Изоляция murine сперматогенных клеток с помощью фиолетово-возбужденных клеток проницаемых ДНК Связывание красителя

Isolation of meiotic spermatocytes is essential to investigate molecular mechanisms underlying meiosis and spermatogenesis. Although there are established ...

Этот новый эффективный метод изоляции субпопуляций сперматозоидов и сперматозоидов от взрослых мышей может быть использован для исследования молекулярных механизмов, лежащих в основе мейоза и сперматогенеза. Этот метод использует низкой цитотоксичности ДНК связывания красителя с широким спектром возбуждения, которые могут быть применены к наиболее используемых в настоящее время заказов FACS. Этот метод очень прост.Наиболее сложным аспектом является цитометрия потока gating, но подробная стратегия gating должны помочь с адаптацией протокола к другим сортаторам клеток. Демонстрацией процедуры будет yu-Han Yeh, научный сотрудник лаборатории Сатоши Наметкавы. После сбора обоих яище от восьминедельного самца мыши, поместите ткани в 60-миллиметровую чашку Петри, содержащую два миллилитров ледяного PBS и удалите туника альбугинеа.Аккуратно отделите яички типсами, чтобы слегка разогнать семенные трубочки. И перенесите трубоубий в каплю свежего ледяного PBS в 100-миллиметровую чашку Петри. Используйте типсы, чтобы аккуратно распутать трубоушки и мыть трубоушки в трех дополнительных капель PBS, как только что продемонстрировали.После последней стирки поместите распутанные семенные трубочки в 15-миллилитровую трубку, содержащую два миллилитров буфера диссоциации для 20-минутной инкубации при 37 градусах цельсия. В конце инкубации используйте трубу из 1000 микролитров, чтобы аккуратно пипетку труб 20 раз, прежде чем вернуть трубку в инкубатор еще на шесть минут. В конце инкубации, пипетки ткани еще 20 раз, прежде чем вернуть трубку в инкубатор.Через три минуты, осторожно пипетки трубы 10 раз или до тех пор, пока видимые части ткани остаются, прежде чем остановить диссоциацию с 10 миллилитров буфера FACS. Затем центрифуга к подвеске ткани два раза с помощью дополнительных 10 миллилитров для свежего буфера FACS для второй стирки, чтобы удалить сперматозоиды и как можно больше мусора, как это возможно. Чтобы испачкать клетки для цитометрического анализа потока, повторно приостанавливайте гранулы в три миллилитров буфера FACS.И фильтровать подвеску клетки через 70 микрон нейлоновых клеток ситечко, в 50 миллилитров трубки. После подсчета, передача 10% клеток в новую трубку на льду, как незапачканный отрицательный контроль. И тщательно смешать шесть микролитров пятна DCV в оставшейся клеточной подвески.После 30-минутной инкубации при 37 градусах По Цельсию в темноте с нежной тряской каждые 10 минут добавляйте в клетки пять микролитров DNase I. И фильтровать клетки через 35 микрон нейлоновой сетки ситечко в пять миллилитров FACS трубки на льду. Для цитометрического анализа потока клеток, создать новый эксперимент в программном обеспечении анализа потока, и в меню инструментов листа, нажмите новую плотность, чтобы создать передовую область рассеяния по сравнению с backscatter области плотности участка в линейном масштабе.Нажмите на новую гистограмму, чтобы создать сюжет dcV синей гистограммы в логаритмическом масштабе. И нажмите кнопку начать и записать, чтобы начать обработку необлитаемого образца. В то время как образец работает, нажмите детектор и настройки порога, чтобы настроить как вперед, так и боковой рассеяния PMT напряжения для места необитых клеток в масштабе вперед и назад рассеяния участка.Отрегулируйте напряжение PMT для канала jappy для того чтобы обнаружить местонахождение населенности DCV отрицательной в первой декаде участка logarithmic голубой гистограммы DCV. Затем нажмите стоп, чтобы выгрузить незапачканный образец. После краткого вихревого и загрузки окрашенных образца, нажмите следующую трубку, чтобы создать новый лист для образца.Установите цитометр, чтобы приобрести по крайней мере один раз от 10 до шести событий, и нажмите кнопку начала и записи. Далее щелкните новую плотность, чтобы создать вперед высоту рассеяния по сравнению с вперед шириной рассеяния. И DCV синий против DCV красной плотности участков в линейном масштабе.На передовую область рассеяния по сравнению с backscatter области плотности участка, использовать полигон инструмент, чтобы нарисовать ворота называется клетки, чтобы включить большую часть клеток и исключить мелкий мусор. Примените эти ворота к высоте вперед рассеяния по сравнению с вперед участок ширины рассеяния и использовать прямоугольник инструмент, чтобы нарисовать ворота одной ячейки, чтобы исключить не одной ячейки. Нанесите ворота одной ячейки на синий цвет DCV и участок красной плотности DCV и отрегулируйте шкалу для захвата расширенного профиля.Используйте полигон инструмент, чтобы нарисовать ворота DCV, чтобы исключить незапачканные клетки и боковой популяции, и применить ворота к dcV синий участок гистограммы в линейном масштабе. Три основных пика относятся к различным содержанию ДНК 1C, 2C и 4C. Создайте второй синий DCV против dcV красный участок плотности в линейном масштабе.И задние ворота DCV ворота на участок, чтобы найти 1C и 4C населения. Создайте другой dcV синий против DCV красный участок плотности в линейном масштабе. И используйте эллипс инструмент, чтобы нарисовать ворота на 1C населения.Используйте полигон инструмент для ворот 4C населения с непрерывной кривой. И создать еще один DCV синий против DCV красной плотности участка в линейном масштабе. Используйте полигон инструмент для создания 4C один ворота.В новом вперед бок о бок рассеяния участка, использовать эллипсовый инструмент для создания pachytene, диплотен и лептотен, zygotene сперматоцитов ворот. Когда все ворота были нарисованы, создать новый DCV синий против DCV красный цвет точка участок на линейной шкале, чтобы применить для 4C ворота, чтобы убедиться, что три популяции находятся в непрерывном порядке в воротах. Далее создайте новую область рассеяния вперед по сравнению с участком плотности backscatter области в линейном масштабе, и выберите единый размер клеток в качестве чистой круглой популяции сперматозоидов.После сортировки, репрезентативные чистоты разделенных лептотена, zygotene, пахитена и диплотена сперматозоидов фракций, как правило, между 80%до 90%, как это подтверждается SYCP3 и Гамма H2AX иммуностимуляторов. Чистота круглого сперматозоидов фракция может быть подтверждена ядром окрашивания с DCV в сочетании с Sp56 и H1t окрашивания, а также, как правило, около 90% жизнеспособность изолированных популяций клеток, как правило, более 95%И средняя общая урожайность каждой фракции от одной взрослой мыши, как правило, достаточно для различных вниз по течению анализа. Отсортированные клетки могут быть использованы для различных следующего поколения секвенирования анализа, чтобы лучше изучить экспрессию генов и регуляции во время сперматогенеза.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Dual Labeling of Neural Crest Cells and Blood Vessels Within Chicken Embryos Using ChickGFP Neural Tube Grafting and Carbocyanine Dye DiI Injection

Dual Labeling of Neural Crest Cells and Blood Vessels Within Chicken Embryos Using ChickGFP Neural Tube Grafting and Carbocyanine Dye DiI Injection

Двойная маркировка нервных клеток Креста и кровеносных сосудов в куриных эмбрионах сиспользованием Чик GFP нейронной трубки прививки и карбоцианина красителя DiI инъекции

All developing organs need to be connected to both the nervous system (for sensory and motor control) as well as the vascular system (for gas exchange, ...

Murine Dermal Fibroblast Isolation by FACS

Мышиные Кожные фибробластов Изоляция FACS

Fibroblasts are the principle cell type responsible for secreting extracellular matrix and are a critical component of many organs and tissues. Fibroblast ...

Isolation of Murine Embryonic Hemogenic Endothelial Cells

Выделение мышиной эмбриональных кроветворных эндотелиальных клеток

The specification of hemogenic endothelial cells from embryonic vascular endothelium occurs during brief developmental periods within distinct tissues, ...

Isolation and Expansion of Mesenchymal Stem/Stromal Cells Derived from Human Placenta Tissue

Выделение и расширения мезенхимальных стволовых / стромальные клетки, полученные из плаценты человека ткани

Mesenchymal stem/stromal cells (MSC) are promising candidates for use in cell-based therapies. In most cases, therapeutic response appears to be cell-dose ...

The Production of Pluripotent Stem Cells from Mouse Amniotic Fluid Cells Using a Transposon System

Производство плюрипотентных стволовых клеток из амниотической жидкости для мыши клеток с использованием транспозона системы

Induced pluripotent stem (iPS) cells are generated from mouse and human somatic cells by forced expression of defined transcription factors using ...

Horizontal Whole Mount: A Novel Processing and Imaging Protocol for Thick, Three-dimensional Tissue Cross-sections of Skin

Горизонтальная целая гора: новый протокол обработки и обработки изображений для толстых, трехмерных поперечных сечений кожи

Processing a tissue of interest to generate a microscopic image that supports a scientific argument can be challenging. The acquisition of high-quality ...

Isolation of Human Endometrial Stromal Cells for In Vitro Decidualization

Isolation of Human Endometrial Stromal Cells for In Vitro Decidualization

Изоляции человека эндометрия стромальных клеток In Vitro Decidualization

The differentiation of human endometrial stromal cells (HESC) from fibroblast-like appearance into secretory decidua is a transformation required for ...

Computational Analysis of the Caenorhabditis elegans Germline to Study the Distribution of Nuclei, Proteins, and the Cytoskeleton

Computational Analysis of the Caenorhabditis elegans Germline to Study the Distribution of Nuclei, Proteins, and the Cytoskeleton

Вычислительный анализ микрофлорой Caenorhabditis elegans для изучения распределения ядер, белки и Цитоскелет

The Caenorhabditis elegans (C. elegans) germline is used to study several biologically important processes including stem cell development, apoptosis, and ...

In Vitro Generation of Somite Derivatives from Human Induced Pluripotent Stem Cells

В Vitro поколения Сомит производных от человека индуцированных плюрипотентных стволовых клеток

In response to signals such as WNTs, bone morphogenetic proteins (BMPs), and sonic hedgehog (SHH) secreted from surrounding tissues, somites (SMs) give ...

Three-dimensional Angiogenesis Assay System using Co-culture Spheroids Formed by Endothelial Colony Forming Cells and Mesenchymal Stem Cells

Трехмерная система ассеаа ассеа ангиогенеза с использованием сокультурных сфероидов, сформированных эндотелиальными колоний формирования клеток и мезенхимальных стволовых клеток

Studies in the field of angiogenesis have been aggressively growing in the last few decades with the recognition that angiogenesis is a hallmark of more ...