Name: isolation of murine spermatogenic cells using a violet-excited cell-permeable dna binding dye
Uploaded: 2021-01-14T13:00:00
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Agradecemos a los miembros de los laboratorios Namekawa, Yoshida y Maezawa por su ayuda; Katie Gerhardt por editar el manuscrito; Mary Ann Handel por compartir el anticuerpo H1T, el Núcleo de Citometría de Flujo de Investigación del Cincinnati Children's Hospital Medical Center (CCHMC) para compartir el equipo FACS apoyado por NIH S10OD023410; Subvención en Ayuda para la Investigación Científica (KAKENHI; 17K07424) a T.N.; Beca Postdoctoral de la Fundación Lalor a A.S.; AMED-CREST (JP17gm1110005h0001) a S.Y.; la Beca de Proyectos de Investigación de la División de Servicios de Investigación de la Universidad de Azabu, Ministerio de Educación, Cultura, Deportes, Ciencia y Tecnología (MEXT)-Programa apoyado para el Proyecto de Marca de Investigación de Universidades Privadas (2016-2019), Grant-in-Aid for Research Activity Start-up (19K21196), Takeda Science Foundation (2019), y la Uehara Memorial Foundation Research Incentive Grant (2018) a S.M;; Instituto Nacional de Salud R01 GM122776 a S.H.N.

Este protocolo sigue las directrices del Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (protocolo no. IACUC2018-0040) en Cincinnati Children's Hospital Medical Center.
1. Configuración de equipos y reactivos para la preparación de la suspensión de células testiculares
<ol><li>Preparar cada stock enzimático en 1x Solución de Sal Equilibrada (HBSS) de Hanks y almacenar a -20 oC.(Tabla1). NOTA: Prepárese en cualquier momento antes del experimento.</li>
	<li>Un d?...

<ol>
	<li>Griswold, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spermatogenesis:+The+Commitment+to+Meiosis.">Spermatogenesis: The Commitment to Meiosis.</a> Physiological Reviews. 96 (1), 1-17 (2016).</li><li>Yoshida, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+Spermatogenesis+Reflects+the+Unity+and+Diversity+of+Tissue+Stem+Cell+Niche+Systems.">Mouse Spermatogenesis Reflects the Unity and Diversity of Tissue Stem Cell Niche Systems.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. , 036186 (2020).</li><li>Rathke, C., Baarends, W. M., Awe, S., Renkawitz-Pohl, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromatin+dynamics+during+spermiogenesis.">Chromatin dynamics during spermiogenesis.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1839 (3), 155-168 (2014).</li><li>Maezawa, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SCML2+promotes+heterochromatin+organization+in+late+spermatogenesis.">SCML2 promotes heterochromatin organization in late spermatogenesis.</a> Journal of Cell Science. 131 (17), 217125 (2018).</li><li>Maezawa, S., Yukawa, M., Alavattam, K. G., Barski, A., Namekawa, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+reorganization+of+open+chromatin+underlies+diverse+transcriptomes+during+spermatogenesis.">Dynamic reorganization of open chromatin underlies diverse transcriptomes during spermatogenesis.</a> Nucleic Acids Research. 46 (2), 593-608 (2018).</li><li>Bellve, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification,+culture,+and+fractionation+of+spermatogenic+cells.">Purification, culture, and fractionation of spermatogenic cells.</a> Methods in Enzymology. 225, 84-113 (1993).</li><li>Bryant, J. M., Meyer-Ficca, M. L., Dang, V. M., Berger, S. L., Meyer, R. 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R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometry+purification+of+mouse+meiotic+cells.">Flow cytometry purification of mouse meiotic cells.</a> Journal of Visualized Experimments. (50), e2602 (2011).</li><li>Gaysinskaya, V., Soh, I. Y., van der Heijden, G. W., Bortvin, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimized+flow+cytometry+isolation+of+murine+spermatocytes.">Optimized flow cytometry isolation of murine spermatocytes.</a> Cytometry Part A. 85 (6), 556-565 (2014).</li><li>Romer, K. A., de Rooiji, D. G., Kojima, M. L., Page, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolating+mitotic+and+meiotic+germ+cells+from+male+mice+by+developmental+synchronization,+staging,+and+sorting.">Isolating mitotic and meiotic germ cells from male mice by developmental synchronization, staging, and sorting.</a> Developmental Biology. 443 (1), 19-34 (2018).</li><li>Lam, K. G., Brick, K., Cheng, G., Pratto, F., Camerini-Otero, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-type-specific+genomics+reveals+histone+modification+dynamics+in+mammalian+meiosis.">Cell-type-specific genomics reveals histone modification dynamics in mammalian meiosis.</a> Nature Communications. 10 (1), 3821 (2019).</li><li>Geisinger, A., Rodriguez-Casuriaga, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+Cytometry+for+the+Isolation+and+Characterization+of+Rodent+Meiocytes.">Flow Cytometry for the Isolation and Characterization of Rodent Meiocytes.</a> Methods in Molecular Biology. 1471, 217-230 (2017).</li><li>da Cruz, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptome+analysis+of+highly+purified+mouse+spermatogenic+cell+populations:+gene+expression+signatures+switch+from+meiotic-to+postmeiotic-related+processes+at+pachytene+stage.">Transcriptome analysis of highly purified mouse spermatogenic cell populations: gene expression signatures switch from meiotic-to postmeiotic-related processes at pachytene stage.</a> BMC Genomics. 17, 294 (2016).</li><li>Rodriguez-Casuriaga, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+preparation+of+rodent+testicular+cell+suspensions+and+spermatogenic+stages+purification+by+flow+cytometry+using+a+novel+blue-laser-excitable+vital+dye.">Rapid preparation of rodent testicular cell suspensions and spermatogenic stages purification by flow cytometry using a novel blue-laser-excitable vital dye.</a> MethodsX. 1, 239-243 (2014).</li><li>Trovero, M. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Revealing+stage-specific+expression+patterns+of+long+noncoding+RNAs+along+mouse+spermatogenesis.">Revealing stage-specific expression patterns of long noncoding RNAs along mouse spermatogenesis.</a> RNA Biology. 17 (3), 350-365 (2020).</li><li>Telford, W. G., Bradford, J., Godfrey, W., Robey, R. W., Bates, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Side+population+analysis+using+a+violet-excited+cell-permeable+DNA+binding+dye.">Side population analysis using a violet-excited cell-permeable DNA binding dye.</a> Stem Cells. 25 (4), 1029-1036 (2007).</li><li>Alavattam, K. G., Abe, H., Sakashita, A., Namekawa, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromosome+Spread+Analyses+of+Meiotic+Sex+Chromosome+Inactivation.">Chromosome Spread Analyses of Meiotic Sex Chromosome Inactivation.</a> Methods in Molecular Biology. 1861, 113-129 (2018).</li><li>Maezawa, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Super-enhancer+switching+drives+a+burst+in+gene+expression+at+the+mitosis-to-meiosis+transition.">Super-enhancer switching drives a burst in gene expression at the mitosis-to-meiosis transition.</a> Nature Structural &amp; Molecular Biology. , (2020).</li><li>Sakashita, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endogenous+retroviruses+drive+species-specific+germline+transcriptomes+in+mammals.">Endogenous retroviruses drive species-specific germline transcriptomes in mammals.</a> Nature Structural &amp; Molecular Biology. , (2020).</li><li>Agrimson, K. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterizing+the+Spermatogonial+Response+to+Retinoic+Acid+During+the+Onset+of+Spermatogenesis+and+Following+Synchronization+in+the+Neonatal+Mouse+Testis.">Characterizing the Spermatogonial Response to Retinoic Acid During the Onset of Spermatogenesis and Following Synchronization in the Neonatal Mouse Testis.</a> Biology of Reproduction. 95 (4), 81 (2016).</li><li>Hogarth, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Turning+a+spermatogenic+wave+into+a+tsunami:+synchronizing+murine+spermatogenesis+using+WIN+18,446.">Turning a spermatogenic wave into a tsunami: synchronizing murine spermatogenesis using WIN 18,446.</a> Biology of Reproduction. 88 (2), 40 (2013).</li><li>Patel, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+reorganization+of+the+genome+shapes+the+recombination+landscape+in+meiotic+prophase.">Dynamic reorganization of the genome shapes the recombination landscape in meiotic prophase.</a> Nature Structural &amp; Molecular Biology. 26 (3), 164-174 (2019).</li><li>Alavattam, K. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Attenuated+chromatin+compartmentalization+in+meiosis+and+its+maturation+in+sperm+development.">Attenuated chromatin compartmentalization in meiosis and its maturation in sperm development.</a> Nature Structural &amp; Molecular Biology. 26 (3), 175-184 (2019).</li><li>Adams, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNF8+and+SCML2+cooperate+to+regulate+ubiquitination+and+H3K27+acetylation+for+escape+gene+activation+on+the+sex+chromosomes.">RNF8 and SCML2 cooperate to regulate ubiquitination and H3K27 acetylation for escape gene activation on the sex chromosomes.</a> PLoS Genetics. 14 (2), 1007233 (2018).</li><li>Wiltshire, T., Park, C., Caldwell, K. A., Handel, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induced+premature+G2/M-phase+transition+in+pachytene+spermatocytes+includes+events+unique+to+meiosis.">Induced premature G2/M-phase transition in pachytene spermatocytes includes events unique to meiosis.</a> Developmental Biology. 169 (2), 557-567 (1995).</li></ol>

Aquí presentamos un protocolo práctico y simple para aislar las subpoblaciones de espermatozoides y espermatozoides de un solo ratón macho adulto. Para garantizar la reproducibilidad de este protocolo, hay algunos pasos críticos que necesitan atención. Antes de la digestión enzimática, el paso de lavado tiene como objetivo eliminar las células intersticiales; después de la digestión, este paso ayuda a eliminar los espermatozoides y los desechos. Lavar/centrifugar 3 veces es importante. En nuestra receta de tamp...

La espermatogénesis es un proceso complejo en el que una pequeña población de células madre espermatogoniales sostiene la producción continua de un gran número de espermatozoides a lo largo de la vida adulta1,2. Durante la espermatogénesis, la remodelación dinámica de la cromatina tiene lugar cuando las células espermatogénicas se someten a meiosis para producir espermatozoides haploideos3,4,5. El aislamiento de espermatocitos meyóticos es esencial para la investigación molecular, y se han establecido varios enfoques diferentes para aislar los espermatocitos meyóticos, incluyendo la separación basada en sedimentación6,7 y la clasificación celular activada por fluorescencia (FACS)8,9,10,11,12,13,14,15,16,17. Sin embargo, estos métodos tienen limitaciones técnicas. Mientras que la separación basada en sedimentación produce un gran número de células5,6,7,es intensiva en mano de obra. El método establecido basado en FACS utiliza Hoechst 33342 (Ho342) para separar los espermatocitos meyóticos basados en el contenido de ADN y las propiedades de dispersión de luz y requiere clasificadores celulares FACS equipados con un láser ultravioleta (UV)8,9,10,11. Los métodos alternativos basados en FACS requieren líneas de ratón transgénicas que expresen proteínas florescentes, sincronización de espermatogénesis12o fijación celular y etiquetado de anticuerpos que no sea compatible con el aislamiento de células vivas13. Si bien hay otro método alternativo utilizando un tinte de unión de ADN permeable a las células, DyeCycle Green stain14,15,16,17, este método se recomienda para el aislamiento de células espermatogénicas de testículos juveniles. Por lo tanto, existe una necesidad crítica de desarrollar un método de aislamiento simple y robusto para los esperatocitos meyóticos vivos que se pueden aplicar a cualquier cepa de ratón de cualquier edad y que se puede realizar utilizando cualquier clasificador celular FACS.
Aquí describimos un protocolo de aislamiento celular tan buscado desde hace mucho tiempo utilizando la mancha DyeCycle Violet (DCV). El DCV es un tinte de unión de ADN permeable a la célula de baja citotoxicidad estructuralmente similar al Ho342, pero con un espectro de excitación desplazado hacia el rango violeta18. Además, DCV tiene un espectro de emisiones más amplio en comparación con DCG. Por lo tanto, puede ser excitado por láseres UV y violeta, lo que mejora la flexibilidad del equipo, permitiendo el uso de un clasificador de células FACS no equipado con un láser UV. El protocolo DCV presentado aquí utiliza la separación bidimensional con azul DCV y rojo DCV, imitando la ventaja del protocolo Ho342. Con esta ventaja, nuestro protocolo DCV nos permite aislar células germinales altamente enriquecidas de los testículos adultos. Proporcionamos un protocolo detallado para aislar las células espermatogénicas vivas de los testículos adultos de ratón de un ratón (de dos testículos). También describimos un protocolo eficiente y rápido para preparar la suspensión de una sola célula a partir de pruebas de ratón que se pueden utilizar para este aislamiento de celda. El procedimiento requiere un corto tiempo para completar (preparación de la suspensión de una sola célula - 1 hora, tinción de tinte - 30 min, y clasificación celular - 2-3 horas: total - 4-5 horas dependiendo del número de células necesarias; Figura 1). Después del aislamiento celular, se puede completar una amplia gama de aplicaciones posteriores, incluyendo RNA-seq, ATAC-seq, ChIP-seq y cultivo celular.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>1.5 ml tube</td>
			<td>Watson</td>
			<td>131-7155C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 mm Petri dish</td>
			<td>Corning, Falcon</td>
			<td>351029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL Centrifuge tube</td>
			<td>Watson</td>
			<td>1332-015S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 ml polystyrene tube with cell strainer snap cap (35 &#181;m nylon mesh)</td>
			<td>Corning, Falcon</td>
			<td>352235</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL Centrifuge tube</td>
			<td>Watson</td>
			<td>1342-050S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>60 mm Petri dish</td>
			<td>Corning, Falcon</td>
			<td>351007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70 &#181;m nylon mesh</td>
			<td>Corning, Falcon</td>
			<td>352350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell sorter</td>
			<td>Sony</td>
			<td>SH800S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase, recombinant, Animal-derived-free</td>
			<td>FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation</td>
			<td>036-23141</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase, Type 1</td>
			<td>Worthington</td>
			<td>LS004196</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cover glass</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>12-544-G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytospin 3</td>
			<td>Shandon</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI (4&#39;,6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride)</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>D1306</td>
			<td>working concentration: 0.1 &#956;g/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dnase I</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D5025-150KU</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey serum</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S30-M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s phosphate-buffered saline (DPBS)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium (DMEM)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11885076</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>16000044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hostone H1T antibody</td>
			<td>gift from Mary Ann Handel</td>
			<td></td>
			<td>1/2000 diluted</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hank&#8217;s balanced salt solution (HBSS)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14175095</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hyaluronidase from bovine testes</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H3506-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline (PBS)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P5493-4L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipettemen</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProLong Gold Antifade Mountant</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>P36930</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rH2AX antibody</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>05-635</td>
			<td>working concentration: 2 &#956;g/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sperm Fertilization Protein 56 (Sp56) antibody</td>
			<td>QED Bioscience</td>
			<td>55101</td>
			<td>working concentration: 0.5 &#956;g/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterilized forceps and scissors</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superfrost /Plus Microscope Slides</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>12-550-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYCP3 antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab205846</td>
			<td>working concentration: 5 &#956;g/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TWEEN 20 (Polysorbate 20)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P9416</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vybrant DyeCycle Violet Stain (DCV)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>V35003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of murine spermatogenic cells using a violet-excited cell-permeable dna binding dye

El aislamiento de espermatocitos meyóticos es esencial para investigar los mecanismos moleculares subyacentes a la meiosis y la espermatogénesis. Aunque existen protocolos de aislamiento celular establecidos que utilizan la tinción Hoechst 33342 en combinación con la clasificación celular activada por fluorescencia, requiere clasificadores celulares equipados con un láser ultravioleta. Aquí describimos un protocolo de aislamiento celular utilizando la mancha DyeCycle Violet (DCV), un tinte de unión de ADN de baja citotoxicidad estructuralmente similar a Hoechst 33342. DcV puede ser excitado por láseres ultravioleta y violeta, lo que mejora la flexibilidad de la elección del equipo, incluyendo un clasificador de células no equipado con un láser ultravioleta. Usando este protocolo, uno puede aislar tres subpoblaciones de células vivas en la profase meótica I, incluyendo leptoteno/zygotene, paquiteno y espermatozoides diploteno, así como espermatozoides redondos post-meyóticos. También describimos un protocolo para preparar la suspensión de una sola célula a partir de testículos de ratón. En general, el procedimiento requiere un corto tiempo para completarse (4-5 horas dependiendo del número de celdas necesarias), lo que facilita muchas aplicaciones posteriores.

Un resultado representativo de este protocolo de clasificación se muestra en la Figura 3. El tiempo total de clasificación de dos testículos (un ratón) suele ser de alrededor de 3 horas, lo que depende de la concentración de la suspensión celular y de la velocidad de clasificación. Después de la clasificación, la pureza de los espermatocitos se confirma mediante la inmunostaining de SYCP3 y de laFigura 3A ( Figura 3A). La pureza representativa de las fr...

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Isolation of Murine Spermatogenic Cells using a Violet-Excited Cell-Permeable DNA Binding Dye

Aquí presentamos un método simple y eficiente para aislar células germinales meíticas y post-meyóticas vivas de los testículos de ratón adultos. Usando un tinte de unión de ADN excitado por violeta y clasificación celular activada por fluorescencia, se pueden aislar poblaciones de células espermatogénicas altamente enriquecidas para muchas aplicaciones posteriores.

Aislamiento de células espermatogénicas murinas usando un tinte de unión de ADN permeable a células violetas-excitado

Isolation of meiotic spermatocytes is essential to investigate molecular mechanisms underlying meiosis and spermatogenesis. Although there are established ...

Este nuevo método eficiente para aislar las subpoblaciones de esperatocitos y espermatozoides de ratones adultos se puede utilizar para investigar los mecanismos moleculares subyacentes a la meiosis y la espermatogénesis. Este método utiliza un tinte de unión al ADN de baja citotoxicidad con un amplio espectro de excitación que se puede aplicar a las órdenes FACS más utilizadas actualmente. Este método es muy sencillo.El aspecto más difícil es la citometría de flujo, pero la estrategia detallada de gating debe ayudar a adaptar el protocolo a otros clasificadores de células. Demostrando el procedimiento estará Yu-Han Yeh, un asistente de investigación del Laboratorio de Satoshi Namekawa. Después de cosechar ambos testículos de un ratón macho de ocho semanas de edad, coloque los tejidos en un plato de Petri de 60 milímetros que contenga dos mililitros de PBS helado y retire la túnica albuginea.Separe suavemente los testículos con fórceps para dispersar ligeramente los túbulos seminiferos. Y transfiera los túbulos a una gota de PBS helado fresco en un plato de Petri de 100 milímetros. Utilice los fórceps para desenredar suavemente los túbulos y lavar los túbulos en tres gotas adicionales de PBS como se acaba de demostrar.Después del último lavado, coloque los túbulos seminíferos desenredados en un tubo de 15 mililitros, que contiene dos mililitros de tampón de disociación para una incubación de 20 minutos a 37 grados centígrados. Al final de la incubación, utilice una pipeta de 1000 microlitros para pipetear suavemente los túbulos 20 veces, antes de devolver el tubo a la incubadora durante otros seis minutos. Al final de la incubación, pipetear los tejidos 20 veces más, antes de devolver el tubo a la incubadora.Después de tres minutos, pipetee suavemente los túbulos 10 veces o hasta que no queden trozos de tejido visible, antes de detener la disociación con 10 mililitros de tampón FACS. Luego, centrífuga a la suspensión de tejido dos veces usando 10 mililitros adicionales para el tampón FACS fresco para el segundo lavado para eliminar el espermatozoide y tantos desechos como sea posible. Para manchar las células para el análisis citométrico de flujo, vuelva a suspender el pellet en tres mililitros de tampón FACS.Y filtre la suspensión celular a través de un colador de células de nylon de 70 micras.en un tubo de 50 mililitros. Después de contar, transfiera el 10% de las células a un nuevo tubo sobre hielo como control negativo no manchado. Y mezcle completamente seis microlitros de la mancha DCV en la suspensión celular restante.Después de una incubación de 30 minutos a 37 grados Celsius en la oscuridad con suave temblor cada 10 minutos, agregue cinco microlitros de DNase I a las células. Y filtre las células a través de un colador de malla de nylon de 35 micras en un tubo FACS de cinco mililitros sobre hielo. Para el análisis citométrico de flujo de las celdas, cree un nuevo experimento en el software de análisis de flujo y, en el menú de herramientas de la hoja de cálculo, haga clic en nueva densidad para crear un área de dispersión hacia delante frente frente a un trazado de densidad de área de retrofluya en una escala lineal.Haga clic en nuevo histograma para crear un trazado de histograma azul DCV en una escala logarítmica. Y haga clic en Iniciar y grabar para comenzar a procesar la muestra no detenida. Mientras se ejecuta la muestra, haga clic en la configuración del detector y del umbral para ajustar los voltajes PMT de dispersión hacia delante y hacia atrás para colocar las celdas no manchadas en la escala del gráfico de dispersión hacia delante y hacia atrás.Ajuste el voltaje PMT para el canal jappy para localizar la posición de la población negativa DCV en la primera década de la gráfica logarítmica del histograma azul DCV. A continuación, haga clic en Detener para descargar el ejemplo no detenido. Después de vórtices brevemente y cargar la muestra manchada, haga clic en el siguiente tubo para crear una nueva hoja de trabajo para la muestra.Establezca el citometro para adquirir al menos una vez 10 en los seis eventos y haga clic en Iniciar y registrar. A continuación, haga clic en Nueva densidad para crear la altura de dispersión hacia delante frente frente a la anchura de dispersión hacia delante. Y la densidad de color azul DCV frente a la densidad roja DCV en una escala lineal.En el área de dispersión hacia delante frente frente a la gráfica de densidad de área de retropareador, utilice la herramienta polígono para dibujar una puerta llamada celdas para incluir la mayoría de las celdas y excluir pequeños desechos. Aplique esta puerta a la gráfica de altura de dispersión hacia delante frente frente a ancho de dispersión hacia adelante y utilice la herramienta rectángulo para dibujar la puerta de una sola celda para excluir celdas no individuales. Aplique la puerta de la celda única a la gráfica de densidad roja DCV en comparación con la gráfica de densidad roja DCV y ajuste la escala para capturar un perfil extendido.Utilice la herramienta poligonal para dibujar una puerta DCV para excluir las celdas no manchadas y la población lateral, y aplique la puerta a un trazado de histograma azul DCV en una escala lineal. Los tres picos principales se refieren a los diferentes contenidos de ADN 1C, 2C y 4C. Cree una segunda gráfica de densidad azul DCV frente a la de color rojo DCV en una escala lineal.Y puerta trasera de la puerta DCV en la parcela para localizar las poblaciones 1C y 4C. Cree otro trazado de densidad azul DCV frente a rojo DCV en una escala lineal. Y utilice la herramienta de elipse para dibujar una puerta en la población 1C.Utilice la herramienta poligonal para cercar la población 4C con una curva continua. Y cree otra gráfica de densidad roja DCV azul frente a DCV en una escala lineal. Utilice la herramienta polígono para crear una puerta 4C.En una nueva gráfica de dispersión hacia delante al lado del otro, utilice la herramienta de elipse para crear puertas de paquiteno, diploteno y leptoteno, espermatocitos de cigeno. Cuando se hayan dibujado todas las puertas, cree una nueva gráfica de puntos de color azul DCV frente a DCV en una escala lineal para aplicar la puerta for 4C para asegurarse de que las tres poblaciones están en un orden continuo dentro de la puerta. A continuación, cree un nuevo área de dispersión hacia delante frente frente a una gráfica de densidad de área de retropareador en una escala lineal y seleccione el tamaño unificado de las células como una población de espermatozoides redondas pura.Después de la clasificación, las purezas representativas de las fracciones separadas de leptoteno, cigono, paquiteno y capermatocito de diploteno suelen estar entre el 80% y el 90%, según lo confirmado por la inmunostaining SYCP3 y Gamma H2AX. La pureza de la facción espermática redonda se puede confirmar mediante la tinción del núcleo con DCV en combinación con la tinción Sp56 y H1t, y también es típicamente alrededor del 90%La viabilidad de las poblaciones celulares aisladas es generalmente superior al 95%Y los rendimientos totales promedio de cada fracción de un solo ratón adulto es típicamente suficiente para varios análisis posteriores. Las células ordenadas se pueden utilizar para varios análisis de secuenciación de próxima generación para explorar mejor la expresión génica y la regulación durante la espermatogénesis.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Dual Labeling of Neural Crest Cells and Blood Vessels Within Chicken Embryos Using ChickGFP Neural Tube Grafting and Carbocyanine Dye DiI Injection

Dual Labeling of Neural Crest Cells and Blood Vessels Within Chicken Embryos Using ChickGFP Neural Tube Grafting and Carbocyanine Dye DiI Injection

Etiquetado Dual De Las Células De La Cresta Neural Y Los Vasos Sanguíneos Dentro De Los Embriones De Pollo Usando ChickGFP Injerto De Tubo Neural Y Carbocianina Tinte DiI Inyección

All developing organs need to be connected to both the nervous system (for sensory and motor control) as well as the vascular system (for gas exchange, ...

Investigación

Biología del Desarrollo

Murine Dermal Fibroblast Isolation by FACS

Murino fibroblastos dérmicos aislamiento por FACS

Fibroblasts are the principle cell type responsible for secreting extracellular matrix and are a critical component of many organs and tissues. Fibroblast ...

Isolation of Murine Embryonic Hemogenic Endothelial Cells

Aislamiento de las células murinas embrionarias Hemogenic endoteliales

The specification of hemogenic endothelial cells from embryonic vascular endothelium occurs during brief developmental periods within distinct tissues, ...

Isolation and Expansion of Mesenchymal Stem/Stromal Cells Derived from Human Placenta Tissue

Aislamiento y expansión de células madre mesenquimales / estromales derivadas de tejido de placenta humana

Mesenchymal stem/stromal cells (MSC) are promising candidates for use in cell-based therapies. In most cases, therapeutic response appears to be cell-dose ...

The Production of Pluripotent Stem Cells from Mouse Amniotic Fluid Cells Using a Transposon System

La producción de células madre pluripotentes a partir de células de ratón amniótico líquido mediante un sistema de transposón

Induced pluripotent stem (iPS) cells are generated from mouse and human somatic cells by forced expression of defined transcription factors using ...

Horizontal Whole Mount: A Novel Processing and Imaging Protocol for Thick, Three-dimensional Tissue Cross-sections of Skin

Montaje entero horizontal: un nuevo protocolo de procesamiento e imágenes para tejidos gruesos y tridimensionales Secciones transversales de la piel

Processing a tissue of interest to generate a microscopic image that supports a scientific argument can be challenging. The acquisition of high-quality ...

Isolation of Human Endometrial Stromal Cells for In Vitro Decidualization

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Aislamiento de células Stromal Endometrial humanas In Vitro Decidualization

The differentiation of human endometrial stromal cells (HESC) from fibroblast-like appearance into secretory decidua is a transformation required for ...

Computational Analysis of the Caenorhabditis elegans Germline to Study the Distribution of Nuclei, Proteins, and the Cytoskeleton

Computational Analysis of the Caenorhabditis elegans Germline to Study the Distribution of Nuclei, Proteins, and the Cytoskeleton

Análisis computacional de lo elegans de Caenorhabditis del Germline para estudiar la distribución de núcleos, proteínas y citoesqueleto

The Caenorhabditis elegans (C. elegans) germline is used to study several biologically important processes including stem cell development, apoptosis, and ...

In Vitro Generation of Somite Derivatives from Human Induced Pluripotent Stem Cells

En la generación de Vitro del Somite derivados humanos inducida por células madre pluripotentes

In response to signals such as WNTs, bone morphogenetic proteins (BMPs), and sonic hedgehog (SHH) secreted from surrounding tissues, somites (SMs) give ...

Three-dimensional Angiogenesis Assay System using Co-culture Spheroids Formed by Endothelial Colony Forming Cells and Mesenchymal Stem Cells

Sistema de ensayo de angiogénesis tridimensional utilizando esferoides de cocultura formados por células formadoras de colonias endoteliales y células madre mesenquimales

Studies in the field of angiogenesis have been aggressively growing in the last few decades with the recognition that angiogenesis is a hallmark of more ...