Name: isolation of murine spermatogenic cells using a violet-excited cell-permeable dna binding dye
Uploaded: 2021-01-14T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Murine Spermatogenic Cells using a Violet-Excited Cell-Permeable DNA Binding Dye at JoVE.com

Vi tackar medlemmar av laboratorierna Namekawa, Yoshida, och Maezawa för deras hjälp; Katie Gerhardt för redigering av manuskriptet; Mary Ann Händel för att dela H1T-antikroppen, Cincinnati Children's Hospital Medical Center (CCHMC) Research Flow Cytometry Core för att dela FACS-utrustning som stöds av NIH S10OD023410; Bidragsbistånd till vetenskaplig forskning (KAKENHI; 17K07424) till T.N.; Lalor Foundation Postdoktorsstipendium till A.S.; AMED-CREST (JP17gm1110005h0001) till S.Y.; forskningsprojektet Grant av Azabu University Research Services Division, Ministeriet för utbildning, kultur, sport, vetenskap och teknik (MEXT)-stödda program för Private University Research Branding Project (2016–2019), Grant-in-Aid for Research Activity Start-up (19K21196), Takeda Science Foundation (2019) och Uehara Memorial Foundation Research Incentive Grant (2018) till S.M.; Medborgareinstitut av vård- R01 GM122776 till S.H.N.

Detta protokoll följer riktlinjerna från kommittén för institutionsdjursvård och användning (protokoll nr. IACUC2018-0040) på Cincinnati Children's Hospital Medical Center.
1. Utrustning och reagensinställning för beredning av testikelcellsupphängning
<ol><li>Förbered varje enzymlager i 1x Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) och förvara vid -20 °C. (Tabell1). OBS: Förbered när som helst före experimentet.</li>
	<li>En dag före försöket: Coatsamlande r?...

<ol>
	<li>Griswold, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spermatogenesis:+The+Commitment+to+Meiosis.">Spermatogenesis: The Commitment to Meiosis.</a> Physiological Reviews. 96 (1), 1-17 (2016).</li><li>Yoshida, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+Spermatogenesis+Reflects+the+Unity+and+Diversity+of+Tissue+Stem+Cell+Niche+Systems.">Mouse Spermatogenesis Reflects the Unity and Diversity of Tissue Stem Cell Niche Systems.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. , 036186 (2020).</li><li>Rathke, C., Baarends, W. M., Awe, S., Renkawitz-Pohl, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromatin+dynamics+during+spermiogenesis.">Chromatin dynamics during spermiogenesis.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1839 (3), 155-168 (2014).</li><li>Maezawa, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SCML2+promotes+heterochromatin+organization+in+late+spermatogenesis.">SCML2 promotes heterochromatin organization in late spermatogenesis.</a> Journal of Cell Science. 131 (17), 217125 (2018).</li><li>Maezawa, S., Yukawa, M., Alavattam, K. G., Barski, A., Namekawa, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+reorganization+of+open+chromatin+underlies+diverse+transcriptomes+during+spermatogenesis.">Dynamic reorganization of open chromatin underlies diverse transcriptomes during spermatogenesis.</a> Nucleic Acids Research. 46 (2), 593-608 (2018).</li><li>Bellve, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification,+culture,+and+fractionation+of+spermatogenic+cells.">Purification, culture, and fractionation of spermatogenic cells.</a> Methods in Enzymology. 225, 84-113 (1993).</li><li>Bryant, J. M., Meyer-Ficca, M. L., Dang, V. M., Berger, S. L., Meyer, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Separation+of+spermatogenic+cell+types+using+STA-PUT+velocity+sedimentation.">Separation of spermatogenic cell types using STA-PUT velocity sedimentation.</a> Journal of Visualized Experiments. (80), e50648 (2013).</li><li>Gaysinskaya, V., Bortvin, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometry+of+murine+spermatocytes.">Flow cytometry of murine spermatocytes.</a> Current Protocols in Cytometry. 72, (2015).</li><li>Bastos, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometric+characterization+of+viable+meiotic+and+postmeiotic+cells+by+Hoechst+33342+in+mouse+spermatogenesis.">Flow cytometric characterization of viable meiotic and postmeiotic cells by Hoechst 33342 in mouse spermatogenesis.</a> Cytometry Part A. 65 (1), 40-49 (2005).</li><li>Getun, I. V., Torres, B., Bois, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometry+purification+of+mouse+meiotic+cells.">Flow cytometry purification of mouse meiotic cells.</a> Journal of Visualized Experimments. (50), e2602 (2011).</li><li>Gaysinskaya, V., Soh, I. Y., van der Heijden, G. W., Bortvin, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimized+flow+cytometry+isolation+of+murine+spermatocytes.">Optimized flow cytometry isolation of murine spermatocytes.</a> Cytometry Part A. 85 (6), 556-565 (2014).</li><li>Romer, K. A., de Rooiji, D. G., Kojima, M. L., Page, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolating+mitotic+and+meiotic+germ+cells+from+male+mice+by+developmental+synchronization,+staging,+and+sorting.">Isolating mitotic and meiotic germ cells from male mice by developmental synchronization, staging, and sorting.</a> Developmental Biology. 443 (1), 19-34 (2018).</li><li>Lam, K. G., Brick, K., Cheng, G., Pratto, F., Camerini-Otero, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-type-specific+genomics+reveals+histone+modification+dynamics+in+mammalian+meiosis.">Cell-type-specific genomics reveals histone modification dynamics in mammalian meiosis.</a> Nature Communications. 10 (1), 3821 (2019).</li><li>Geisinger, A., Rodriguez-Casuriaga, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+Cytometry+for+the+Isolation+and+Characterization+of+Rodent+Meiocytes.">Flow Cytometry for the Isolation and Characterization of Rodent Meiocytes.</a> Methods in Molecular Biology. 1471, 217-230 (2017).</li><li>da Cruz, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptome+analysis+of+highly+purified+mouse+spermatogenic+cell+populations:+gene+expression+signatures+switch+from+meiotic-to+postmeiotic-related+processes+at+pachytene+stage.">Transcriptome analysis of highly purified mouse spermatogenic cell populations: gene expression signatures switch from meiotic-to postmeiotic-related processes at pachytene stage.</a> BMC Genomics. 17, 294 (2016).</li><li>Rodriguez-Casuriaga, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+preparation+of+rodent+testicular+cell+suspensions+and+spermatogenic+stages+purification+by+flow+cytometry+using+a+novel+blue-laser-excitable+vital+dye.">Rapid preparation of rodent testicular cell suspensions and spermatogenic stages purification by flow cytometry using a novel blue-laser-excitable vital dye.</a> MethodsX. 1, 239-243 (2014).</li><li>Trovero, M. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Revealing+stage-specific+expression+patterns+of+long+noncoding+RNAs+along+mouse+spermatogenesis.">Revealing stage-specific expression patterns of long noncoding RNAs along mouse spermatogenesis.</a> RNA Biology. 17 (3), 350-365 (2020).</li><li>Telford, W. G., Bradford, J., Godfrey, W., Robey, R. W., Bates, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Side+population+analysis+using+a+violet-excited+cell-permeable+DNA+binding+dye.">Side population analysis using a violet-excited cell-permeable DNA binding dye.</a> Stem Cells. 25 (4), 1029-1036 (2007).</li><li>Alavattam, K. G., Abe, H., Sakashita, A., Namekawa, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromosome+Spread+Analyses+of+Meiotic+Sex+Chromosome+Inactivation.">Chromosome Spread Analyses of Meiotic Sex Chromosome Inactivation.</a> Methods in Molecular Biology. 1861, 113-129 (2018).</li><li>Maezawa, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Super-enhancer+switching+drives+a+burst+in+gene+expression+at+the+mitosis-to-meiosis+transition.">Super-enhancer switching drives a burst in gene expression at the mitosis-to-meiosis transition.</a> Nature Structural &amp; Molecular Biology. , (2020).</li><li>Sakashita, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endogenous+retroviruses+drive+species-specific+germline+transcriptomes+in+mammals.">Endogenous retroviruses drive species-specific germline transcriptomes in mammals.</a> Nature Structural &amp; Molecular Biology. , (2020).</li><li>Agrimson, K. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterizing+the+Spermatogonial+Response+to+Retinoic+Acid+During+the+Onset+of+Spermatogenesis+and+Following+Synchronization+in+the+Neonatal+Mouse+Testis.">Characterizing the Spermatogonial Response to Retinoic Acid During the Onset of Spermatogenesis and Following Synchronization in the Neonatal Mouse Testis.</a> Biology of Reproduction. 95 (4), 81 (2016).</li><li>Hogarth, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Turning+a+spermatogenic+wave+into+a+tsunami:+synchronizing+murine+spermatogenesis+using+WIN+18,446.">Turning a spermatogenic wave into a tsunami: synchronizing murine spermatogenesis using WIN 18,446.</a> Biology of Reproduction. 88 (2), 40 (2013).</li><li>Patel, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+reorganization+of+the+genome+shapes+the+recombination+landscape+in+meiotic+prophase.">Dynamic reorganization of the genome shapes the recombination landscape in meiotic prophase.</a> Nature Structural &amp; Molecular Biology. 26 (3), 164-174 (2019).</li><li>Alavattam, K. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Attenuated+chromatin+compartmentalization+in+meiosis+and+its+maturation+in+sperm+development.">Attenuated chromatin compartmentalization in meiosis and its maturation in sperm development.</a> Nature Structural &amp; Molecular Biology. 26 (3), 175-184 (2019).</li><li>Adams, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNF8+and+SCML2+cooperate+to+regulate+ubiquitination+and+H3K27+acetylation+for+escape+gene+activation+on+the+sex+chromosomes.">RNF8 and SCML2 cooperate to regulate ubiquitination and H3K27 acetylation for escape gene activation on the sex chromosomes.</a> PLoS Genetics. 14 (2), 1007233 (2018).</li><li>Wiltshire, T., Park, C., Caldwell, K. A., Handel, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induced+premature+G2/M-phase+transition+in+pachytene+spermatocytes+includes+events+unique+to+meiosis.">Induced premature G2/M-phase transition in pachytene spermatocytes includes events unique to meiosis.</a> Developmental Biology. 169 (2), 557-567 (1995).</li></ol>

Här presenterar vi ett praktiskt och enkelt protokoll för att isolera subpopulationer av spermatocyter och spermatider från en enda vuxen manlig mus. För att säkerställa reproducerbarheten av detta protokoll finns det några kritiska steg som behöver uppmärksammas. Innan enzym matsmältningen, tvätta steg syftar till att ta bort interstitial celler; efter matsmältningen, detta steg hjälper till att ta bort spermatozoa och skräp. Tvätt/centrifugering 3 gånger är viktigt. I vårt dissociationsbuffertrecept u...

Spermatogenes är en komplex process där en liten population av spermatogariella stamceller upprätthålla kontinuerlig produktion av ett stort antal spermier under hela vuxenlivet1,2. Under spermatogenesen sker dynamisk kromatin remodeling när spermatogenic celler genomgår meios att producera haploid spermatider3,4,5. Isolering av meiotiska spermatocyter är avgörande för molekylär undersökning, och flera olika tillvägagångssätt för att isolera meiotiska spermatocyter har fastställts, inklusive sedimenteringsbaserad separation6,7 och fluorescens-aktiverad cellsortering (FACS)8,9,10,11,12,13,14,15,16,17. Dessa metoder har dock tekniska begränsningar. Medan sedimenteringsbaserad separation ger ett stort antal celler5,6,7, är det arbetsintensivt. Den etablerade FACS-baserade metoden använder Hoechst 33342 (Ho342) för att separera mejotiska spermatocyter baserade på DNA-innehåll och ljusspridningsegenskaper och kräver FACS-cellsorterare utrustade med en ultraviolett (UV) laser8,9,10,11. Alternativa FACS-baserade metoder kräver transgena muslinjer som uttrycker fluorescerande proteiner, synkronisering av spermatogenes12, eller cellfixering och antikroppsmärkning som inte är kompatibel med isolering av levande celler13. Medan det finns en annan alternativ metod med hjälp av en cell-permeabel DNA bindande färgämne, DyeCycle Grön fläck14,15,16,17, Denna metod rekommenderas för isolering av spermatogenic celler från juvenila testis. Därför finns det ett kritiskt behov av att utveckla en enkel och robust isoleringsmetod för levande meiotiska spermatocyter som kan appliceras på alla musstam i alla åldrar och som kan utföras med hjälp av alla FACS-cellsorterare.
Här beskriver vi en sådan länge sökt cell isolering protokoll med hjälp av DyeCycle Violet (DCV) fläcken. DCV är en låg cytotoxicitet, cell-permeabelt DNA bindande färgämne strukturellt liknar Ho342 men med en excitation spektrum skiftat mot det violetta intervallet18. Dessutom har DCV ett bredare utsläppsspektrum jämfört med DCG. Således kan det vara upphetsad av både UV och violetta lasrar, vilket förbättrar flexibiliteten i utrustning, vilket möjliggör användning av en FACS cell sorterare inte utrustad med en UV-laser. DCV-protokollet som presenteras här använder tvådimensionell separation med DCV blå och DCV röd, härma fördelen med Ho342-protokollet. Med denna fördel, vår DCV protokoll tillåter oss att isolera högberikad könsceller från den vuxna testis. Vi ger en detaljerad gating protokoll för att isolera levande spermatogenic celler från vuxna mus testikel av en mus (från två testikel). Vi beskriver också ett effektivt och snabbt protokoll för att förbereda encellsfjädring från mustestes som kan användas för denna cellisolering. Förfarandet kräver en kort tid att slutföra (beredning av encellsupphängning - 1 timme, färgfärgning - 30 min, och cellsortering - 2-3 timmar: totalt - 4-5 timmar beroende på antalet nödvändiga celler; Bild 1). Efter cellisolering kan ett brett spektrum av nedströms applikationer inklusive RNA-seq, ATAC-seq, ChIP-seq och cellkultur slutföras.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>1.5 ml tube</td>
			<td>Watson</td>
			<td>131-7155C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 mm Petri dish</td>
			<td>Corning, Falcon</td>
			<td>351029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL Centrifuge tube</td>
			<td>Watson</td>
			<td>1332-015S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 ml polystyrene tube with cell strainer snap cap (35 &#181;m nylon mesh)</td>
			<td>Corning, Falcon</td>
			<td>352235</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL Centrifuge tube</td>
			<td>Watson</td>
			<td>1342-050S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>60 mm Petri dish</td>
			<td>Corning, Falcon</td>
			<td>351007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70 &#181;m nylon mesh</td>
			<td>Corning, Falcon</td>
			<td>352350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell sorter</td>
			<td>Sony</td>
			<td>SH800S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase, recombinant, Animal-derived-free</td>
			<td>FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation</td>
			<td>036-23141</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase, Type 1</td>
			<td>Worthington</td>
			<td>LS004196</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cover glass</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>12-544-G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytospin 3</td>
			<td>Shandon</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI (4&#39;,6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride)</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>D1306</td>
			<td>working concentration: 0.1 &#956;g/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dnase I</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D5025-150KU</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey serum</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S30-M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s phosphate-buffered saline (DPBS)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium (DMEM)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11885076</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>16000044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hostone H1T antibody</td>
			<td>gift from Mary Ann Handel</td>
			<td></td>
			<td>1/2000 diluted</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hank&#8217;s balanced salt solution (HBSS)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14175095</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hyaluronidase from bovine testes</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H3506-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline (PBS)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P5493-4L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipettemen</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProLong Gold Antifade Mountant</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>P36930</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rH2AX antibody</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>05-635</td>
			<td>working concentration: 2 &#956;g/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sperm Fertilization Protein 56 (Sp56) antibody</td>
			<td>QED Bioscience</td>
			<td>55101</td>
			<td>working concentration: 0.5 &#956;g/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterilized forceps and scissors</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superfrost /Plus Microscope Slides</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>12-550-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYCP3 antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab205846</td>
			<td>working concentration: 5 &#956;g/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TWEEN 20 (Polysorbate 20)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P9416</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vybrant DyeCycle Violet Stain (DCV)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>V35003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of murine spermatogenic cells using a violet-excited cell-permeable dna binding dye

Isolering av meiotiska spermatocyter är avgörande för att undersöka molekylära mekanismer som ligger bakom meios och spermatogenes. Även om det finns etablerade cellisoleringsprotokoll med hjälp av Hoechst 33342-färgning i kombination med fluorescens-aktiverad cellsortering, kräver det cellsorterare utrustade med en ultraviolett laser. Här beskriver vi en cell isolering protokoll med hjälp av Stainen DyeCycle Violet (DCV) , en låg cytotoxicitet DNA bindande färgämne strukturellt liknar Hoechst 33342. DCV kan vara upphetsad av både ultraviolett och violetta lasrar, vilket förbättrar flexibiliteten i utrustning val, inklusive en cell sorterare inte utrustad med en ultraviolett laser. Med hjälp av detta protokoll kan man isolera tre live-cell subpopulationer i meiotiska prophase jag, inklusive leptotene/zygotene, pachytene och diplotene spermatocyter, samt post-meiotic runda spermatider. Vi beskriver också ett protokoll för att förbereda encellsfjädring från mustestes. Sammantaget kräver proceduren en kort tid för att slutföra (4-5 timmar beroende på antalet nödvändiga celler), vilket underlättar många nedströms applikationer.

Ett representativt resultat av detta sorteringsprotokoll visas i figur 3. Den totala sorteringstiden för två testikörare (en mus) är vanligtvis runt 3 timmar, vilket är beroende av koncentrationen av cellupphängning och sorteringshastigheten. Efter sortering bekräftas renheten hos spermatocyter genom immunfärgning av SYCP3 och γH2AX (figur 3A). Den representativa renheten för sorterade L/Z, P, D-spermatocytefraktioner är omkring 80,4 %, 90,6 % respekt...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Murine Spermatogenic Cells using a Violet-Excited Cell-Permeable DNA Binding Dye at JoVE.com

Isolation of Murine Spermatogenic Cells using a Violet-Excited Cell-Permeable DNA Binding Dye

Här presenterar vi en enkel och effektiv metod för att isolera levande meiotiska och post-meiotiska könsceller från vuxna mustestes. Med hjälp av en lågcyttoxicitet, violett-upphetsad DNA bindande färgämne och fluorescens-aktiverad cell sortering, kan man isolera högberikad spermatogenic cell populationer för många nedströms applikationer.

Isolering av Murine Spermaogena celler med hjälp av en Violet-Excited Cell-Permeable DNA Bindande Dye

Isolation of meiotic spermatocytes is essential to investigate molecular mechanisms underlying meiosis and spermatogenesis. Although there are established ...

Denna nya effektiva metod för att isolera subpopulationer av spermatocyter och spermatider från vuxna möss kan användas för att undersöka de molekylära mekanismer som ligger bakom meios och spermatogenes. Denna metod använder en låg cytotoxicitet DNA bindande färgämne med en bred excitation spektrum som kan tillämpas på de flesta för närvarande används FACS order. Denna metod är mycket okomplicerad.Den mest utmanande aspekten är flödet cytometri gating men den detaljerade gating strategi bör hjälpa till med att anpassa protokollet till andra celler sorterare. Demonstrera förfarandet kommer att Yu-Han Yeh, en forskningsassistent från Satoshi Namekawa's Laboratory. Efter skörd båda testiklar från en åtta veckor gammal manlig mus, placera vävnaderna i en 60 millimeter Petri skålen innehåller två milliliter iskall PBS och ta bort tunica albuginea.Separera försiktigt testiklarna med tärnor för att lätt skingra de seminiferösa tubulina. Och överföra tubuli i en droppe färsk iskall PBS i en 100 millimeter Petri skålen. Använd tärnorna för att försiktigt reda ut tubulina och tvätta tubulina i ytterligare tre droppar PBS som just visats.Efter den sista tvätten, placera untangled seminiferous tubuli i en 15 milliliter rör, som innehåller två milliliter av dissociation buffert för en 20-minuters inkubation vid 37 grader Celsius. I slutet av inkubationen, använd en 1000 mikroliterpipett för att försiktigt pipet tubules 20 gånger, innan du returnerar röret till inkubatorn i ytterligare sex minuter. Vid slutet av inkubationen pipettera vävnaderna ytterligare 20 gånger, innan du returnerar röret till inkubatorn.Efter tre minuter, försiktigt pipettera tubuli 10 gånger eller tills ingen synlig vävnad bitar kvar, innan du stoppar dissociation med 10 milliliter FACS buffert. Sedan centrifug till vävnadsupphängningen två gånger med ytterligare 10 milliliter för färsk FACS-buffert för den andra tvätten för att ta bort spermatozoan och så mycket skräp som möjligt. För att färga cellerna för flödescytometrisk analys, åter upphäva pelleten i tre milliliter av FACS buffert.Och filtrera cellupphängningen genom en 70 mikron nyloncell sil, i en 50 milliliter rör. Efter räkning, överför 10%av cellerna till ett nytt rör på is som den obefläckade negativa kontrollen. Och blanda noggrant sex mikroliter av DCV-fläck i den återstående cellupphängningen.Efter en 30-minuters inkubation vid 37 grader Celsius i mörkret med mild skakning var 10 minuter, tillsätt fem mikroliter DNase I till cellerna. Och filtrera cellerna genom en 35 micron nylon mesh sil i en fem milliliter FACS rör på is. För flödescytmetrisk analys av cellerna, skapa ett nytt experiment i programvaran för flödesanalys, och under menyn kalkylbladsverktyg klickar du på ny densitet för att skapa en framåtspridd yta kontra backscatter områdestäthetsyta på en linjär skala.Klicka på nytt histogram för att skapa ett DCV-blått histogram plot på en logaritmisk skala. Och klicka på start och spela in för att börja bearbeta det obefläckade provet. Medan provet är igång, klicka detektor och tröskelinställningar för att justera både framåt och sida scatter PMT spänningar för att placera de obefläckade cellerna på skalan för framåt och tillbaka scatter tomt.Justera PMT-spänningen för jappy kanalen för att lokalisera positionen för DCV negativ befolkning under det första decenniet av DCV blå histogram logaritmiska tomten. Klicka sedan på stopp för att lasta av det ej utstömda provet. Efter en kort virvelning och inläsning av det färgade provet klickar du på nästa rör för att skapa ett nytt kalkylblad för provet.Ställ in cytometern så att den skaffar sig minst en gånger 10 till de sex händelserna, och klicka på start och spela in. Klicka därefter på ny densitet för att skapa framåt scatter höjd kontra framåt scatter bredd. Och DCV blå kontra DCV röd densitet tomter på en linjär skala.På den framåt scatter området kontra backscatter område densitet tomt, använd polygon verktyget för att rita en grind som kallas celler att inkludera de flesta av cellerna och att utesluta små skräp. Applicera den här grinden på den framåtspridda höjden kontra framåt scatter bredden tomt och använd rektangeln verktyget för att rita en enda cells grind för att utesluta icke enstaka celler. Applicera den enda cellens grind på DCV-blå kontra DCV röd densitetsrit och justera skalan för att fånga en utökad profil.Använd polygonverktyget för att rita en DCV-grind för att utesluta de obefläckade cellerna och sidopopulationen, och applicera porten på ett DCV-blått histogram-plot på en linjär skala. De tre stora topparna hänvisar till de olika 1C, 2C och 4C DNA-innehåll. Skapa en andra DCV blå kontra DCV röd densitet tomt på en linjär skala.Och tillbaka gate DCV porten på tomten för att lokalisera 1C och 4C populationer. Skapa en annan DCV blå kontra DCV röd densitet tomt på en linjär skala. Och använd ellipsverktyget för att rita en grind på 1C-populationen.Använd polygonverktyget för att grinda 4C-populationen med en kontinuerlig kurva. Och skapa en annan DCV blå kontra DCV röd densitet tomt på en linjär skala. Använd polygonverktyget för att skapa en 4C en grind.I en ny framåt vid sida scatter plot, använd ellips verktyget för att skapa pachytene, diploten och leptotene, zygotene spermatocyte grindar. När alla av portarna har ritats, skapa en ny DCV blå kontra DCV röd färg prick tomt på en linjär skala för att tillämpa för 4C grinden för att säkerställa att de tre populationerna är i en kontinuerlig ordning inom grinden. Därefter skapa en ny framåt scatter område kontra backscatter område densitet tomt på en linjär skala, och välj enhetlig storlek av celler som en ren runda spermatid befolkningen.Efter sortering är de representativa renheterna för den separerade leptoteen, zygoten, pachyten och diplotene spermatocyte fraktioner typiskt mellan 80%till 90%som bekräftas av SYCP3 och Gamma H2AX immunfärgning. Renheten i den runda spermatid fraktionen kan bekräftas genom kärnan färgning med DCV i kombination med Sp56 och H1t färgning, och är också typiskt runt 90%Livskraften hos de isolerade cellpopulationerna är vanligtvis över 95%Och den genomsnittliga totala avkastningen av varje fraktion från en enda vuxen mus är typiskt tillräcklig för olika nedströms analys. De sorterade cellerna kan användas för olika nästa generations sekvenseringsanalys för att bättre utforska genuttryck och reglering under spermatogenes.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Dual Labeling of Neural Crest Cells and Blood Vessels Within Chicken Embryos Using ChickGFP Neural Tube Grafting and Carbocyanine Dye DiI Injection

Dual Labeling of Neural Crest Cells and Blood Vessels Within Chicken Embryos Using ChickGFP Neural Tube Grafting and Carbocyanine Dye DiI Injection

Dubbel märkning av neurala vapenceller och blodkärl i kycklingembryon med chickGFP neuralrör ympning och karbalybocyanin färgämne dii injektion

All developing organs need to be connected to both the nervous system (for sensory and motor control) as well as the vascular system (for gas exchange, ...

Murine Dermal Fibroblast Isolation by FACS

Murin Dermal Fibroblast Isolering av FACS

Fibroblasts are the principle cell type responsible for secreting extracellular matrix and are a critical component of many organs and tissues. Fibroblast ...

Isolation of Murine Embryonic Hemogenic Endothelial Cells

Isolering av murina embryonala Hemogenic endotelceller

The specification of hemogenic endothelial cells from embryonic vascular endothelium occurs during brief developmental periods within distinct tissues, ...

Isolation and Expansion of Mesenchymal Stem/Stromal Cells Derived from Human Placenta Tissue

Isolering och Expansion av mesenkymala stam / stromaceller celler från Human Placenta Tissue

Mesenchymal stem/stromal cells (MSC) are promising candidates for use in cell-based therapies. In most cases, therapeutic response appears to be cell-dose ...

The Production of Pluripotent Stem Cells from Mouse Amniotic Fluid Cells Using a Transposon System

Produktionen av pluripotenta stamceller från mus fostervatten celler med användning av en transposon System

Induced pluripotent stem (iPS) cells are generated from mouse and human somatic cells by forced expression of defined transcription factors using ...

Horizontal Whole Mount: A Novel Processing and Imaging Protocol for Thick, Three-dimensional Tissue Cross-sections of Skin

Horisontell helmontering: Ett nytt bearbetnings- och bildprotokoll för tjocka, tredimensionella vävnads tvärsnitt av huden

Processing a tissue of interest to generate a microscopic image that supports a scientific argument can be challenging. The acquisition of high-quality ...

Isolation of Human Endometrial Stromal Cells for In Vitro Decidualization

Isolation of Human Endometrial Stromal Cells for In Vitro Decidualization

Isolering av mänskliga livmodercancer stromaceller för In Vitro Decidualization

The differentiation of human endometrial stromal cells (HESC) from fibroblast-like appearance into secretory decidua is a transformation required for ...

Computational Analysis of the Caenorhabditis elegans Germline to Study the Distribution of Nuclei, Proteins, and the Cytoskeleton

Computational Analysis of the Caenorhabditis elegans Germline to Study the Distribution of Nuclei, Proteins, and the Cytoskeleton

Computational analys av den Caenorhabditis elegans könsceller att studera fördelningen av atomkärnor, proteiner och cytoskelettet

The Caenorhabditis elegans (C. elegans) germline is used to study several biologically important processes including stem cell development, apoptosis, and ...

In Vitro Generation of Somite Derivatives from Human Induced Pluripotent Stem Cells

I Vitro Generation av Somite derivat från mänskliga inducerade stamceller pluripotenta

In response to signals such as WNTs, bone morphogenetic proteins (BMPs), and sonic hedgehog (SHH) secreted from surrounding tissues, somites (SMs) give ...

Three-dimensional Angiogenesis Assay System using Co-culture Spheroids Formed by Endothelial Colony Forming Cells and Mesenchymal Stem Cells

Tredimensionellt Angiogeneshämningssystem med hjälp av Samkulturspheroider som bildas av Endotelkolonibildande celler och mesenkymala stamceller

Studies in the field of angiogenesis have been aggressively growing in the last few decades with the recognition that angiogenesis is a hallmark of more ...