Name: isolation of murine spermatogenic cells using a violet-excited cell-permeable dna binding dye
Uploaded: 2021-01-14T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Murine Spermatogenic Cells using a Violet-Excited Cell-Permeable DNA Binding Dye at JoVE.com

Biz Yardımları için Namekawa, Yoshida ve Maezawa laboratuvarları üyelerine teşekkür ederiz; Katie Gerhardt el yazması düzenleme için; Mary Ann Handel H1T antikor paylaşımı için, Cincinnati Çocuk Hastanesi Tıp Merkezi (CCHMC) Araştırma Akış Sitometri Core NIH S10OD023410 tarafından desteklenen FACS ekipman paylaşımı için; T.N.'ye Bilimsel Araştırma Yardımı (KAKENHI; 17K07424); Lalor Vakfı Doktora Sonrası Bursu A.Ş.'ye; AMED-CREST (JP17gm1110005h0001) için S.Y.; Azabu Üniversitesi Araştırma Hizmetleri Bölümü, Milli Eğitim Bakanlığı, Kültür, Spor, Bilim ve Teknoloji Bakanlığı (MEXT)-Özel Üniversite Araştırma Markalaşma Projesi Destekli Programı (2016-2019), Araştırma Faaliyeti Başlatma Hibesi (19K21196), Takeda Bilim Vakfı (2019) ve Uehara Memorial Vakfı Araştırma Teşviki (2018) tarafından S.M' ye; Ulusal Sağlık Enstitüsü R01 GM122776 Için S.H.N.

Bu protokol, Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi'nin yönergelerini takip eder (protokol no. IACUC2018-0040) Cincinnati Çocuk Hastanesi Tıp Merkezi'nde.
1. Testis hücre süspansiyonu hazırlanması için ekipman ve reaktif kurulumu
<ol><li>Her enzim stoğunu 1x Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) olarak hazırlayın ve -20 °C.'de saklayın (Tablo1). NOT: Denemeden önce herhangi bir zaman hazırlayın.</li>
	<li>Deneyden bir gün önce: Bir gecede 4 °C'de F...

<ol>
	<li>Griswold, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spermatogenesis:+The+Commitment+to+Meiosis.">Spermatogenesis: The Commitment to Meiosis.</a> Physiological Reviews. 96 (1), 1-17 (2016).</li><li>Yoshida, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+Spermatogenesis+Reflects+the+Unity+and+Diversity+of+Tissue+Stem+Cell+Niche+Systems.">Mouse Spermatogenesis Reflects the Unity and Diversity of Tissue Stem Cell Niche Systems.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. , 036186 (2020).</li><li>Rathke, C., Baarends, W. M., Awe, S., Renkawitz-Pohl, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromatin+dynamics+during+spermiogenesis.">Chromatin dynamics during spermiogenesis.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1839 (3), 155-168 (2014).</li><li>Maezawa, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SCML2+promotes+heterochromatin+organization+in+late+spermatogenesis.">SCML2 promotes heterochromatin organization in late spermatogenesis.</a> Journal of Cell Science. 131 (17), 217125 (2018).</li><li>Maezawa, S., Yukawa, M., Alavattam, K. G., Barski, A., Namekawa, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+reorganization+of+open+chromatin+underlies+diverse+transcriptomes+during+spermatogenesis.">Dynamic reorganization of open chromatin underlies diverse transcriptomes during spermatogenesis.</a> Nucleic Acids Research. 46 (2), 593-608 (2018).</li><li>Bellve, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification,+culture,+and+fractionation+of+spermatogenic+cells.">Purification, culture, and fractionation of spermatogenic cells.</a> Methods in Enzymology. 225, 84-113 (1993).</li><li>Bryant, J. M., Meyer-Ficca, M. L., Dang, V. M., Berger, S. L., Meyer, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Separation+of+spermatogenic+cell+types+using+STA-PUT+velocity+sedimentation.">Separation of spermatogenic cell types using STA-PUT velocity sedimentation.</a> Journal of Visualized Experiments. (80), e50648 (2013).</li><li>Gaysinskaya, V., Bortvin, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometry+of+murine+spermatocytes.">Flow cytometry of murine spermatocytes.</a> Current Protocols in Cytometry. 72, (2015).</li><li>Bastos, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometric+characterization+of+viable+meiotic+and+postmeiotic+cells+by+Hoechst+33342+in+mouse+spermatogenesis.">Flow cytometric characterization of viable meiotic and postmeiotic cells by Hoechst 33342 in mouse spermatogenesis.</a> Cytometry Part A. 65 (1), 40-49 (2005).</li><li>Getun, I. V., Torres, B., Bois, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometry+purification+of+mouse+meiotic+cells.">Flow cytometry purification of mouse meiotic cells.</a> Journal of Visualized Experimments. (50), e2602 (2011).</li><li>Gaysinskaya, V., Soh, I. Y., van der Heijden, G. W., Bortvin, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimized+flow+cytometry+isolation+of+murine+spermatocytes.">Optimized flow cytometry isolation of murine spermatocytes.</a> Cytometry Part A. 85 (6), 556-565 (2014).</li><li>Romer, K. A., de Rooiji, D. G., Kojima, M. L., Page, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolating+mitotic+and+meiotic+germ+cells+from+male+mice+by+developmental+synchronization,+staging,+and+sorting.">Isolating mitotic and meiotic germ cells from male mice by developmental synchronization, staging, and sorting.</a> Developmental Biology. 443 (1), 19-34 (2018).</li><li>Lam, K. G., Brick, K., Cheng, G., Pratto, F., Camerini-Otero, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-type-specific+genomics+reveals+histone+modification+dynamics+in+mammalian+meiosis.">Cell-type-specific genomics reveals histone modification dynamics in mammalian meiosis.</a> Nature Communications. 10 (1), 3821 (2019).</li><li>Geisinger, A., Rodriguez-Casuriaga, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+Cytometry+for+the+Isolation+and+Characterization+of+Rodent+Meiocytes.">Flow Cytometry for the Isolation and Characterization of Rodent Meiocytes.</a> Methods in Molecular Biology. 1471, 217-230 (2017).</li><li>da Cruz, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptome+analysis+of+highly+purified+mouse+spermatogenic+cell+populations:+gene+expression+signatures+switch+from+meiotic-to+postmeiotic-related+processes+at+pachytene+stage.">Transcriptome analysis of highly purified mouse spermatogenic cell populations: gene expression signatures switch from meiotic-to postmeiotic-related processes at pachytene stage.</a> BMC Genomics. 17, 294 (2016).</li><li>Rodriguez-Casuriaga, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+preparation+of+rodent+testicular+cell+suspensions+and+spermatogenic+stages+purification+by+flow+cytometry+using+a+novel+blue-laser-excitable+vital+dye.">Rapid preparation of rodent testicular cell suspensions and spermatogenic stages purification by flow cytometry using a novel blue-laser-excitable vital dye.</a> MethodsX. 1, 239-243 (2014).</li><li>Trovero, M. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Revealing+stage-specific+expression+patterns+of+long+noncoding+RNAs+along+mouse+spermatogenesis.">Revealing stage-specific expression patterns of long noncoding RNAs along mouse spermatogenesis.</a> RNA Biology. 17 (3), 350-365 (2020).</li><li>Telford, W. G., Bradford, J., Godfrey, W., Robey, R. W., Bates, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Side+population+analysis+using+a+violet-excited+cell-permeable+DNA+binding+dye.">Side population analysis using a violet-excited cell-permeable DNA binding dye.</a> Stem Cells. 25 (4), 1029-1036 (2007).</li><li>Alavattam, K. G., Abe, H., Sakashita, A., Namekawa, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromosome+Spread+Analyses+of+Meiotic+Sex+Chromosome+Inactivation.">Chromosome Spread Analyses of Meiotic Sex Chromosome Inactivation.</a> Methods in Molecular Biology. 1861, 113-129 (2018).</li><li>Maezawa, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Super-enhancer+switching+drives+a+burst+in+gene+expression+at+the+mitosis-to-meiosis+transition.">Super-enhancer switching drives a burst in gene expression at the mitosis-to-meiosis transition.</a> Nature Structural &amp; Molecular Biology. , (2020).</li><li>Sakashita, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endogenous+retroviruses+drive+species-specific+germline+transcriptomes+in+mammals.">Endogenous retroviruses drive species-specific germline transcriptomes in mammals.</a> Nature Structural &amp; Molecular Biology. , (2020).</li><li>Agrimson, K. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterizing+the+Spermatogonial+Response+to+Retinoic+Acid+During+the+Onset+of+Spermatogenesis+and+Following+Synchronization+in+the+Neonatal+Mouse+Testis.">Characterizing the Spermatogonial Response to Retinoic Acid During the Onset of Spermatogenesis and Following Synchronization in the Neonatal Mouse Testis.</a> Biology of Reproduction. 95 (4), 81 (2016).</li><li>Hogarth, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Turning+a+spermatogenic+wave+into+a+tsunami:+synchronizing+murine+spermatogenesis+using+WIN+18,446.">Turning a spermatogenic wave into a tsunami: synchronizing murine spermatogenesis using WIN 18,446.</a> Biology of Reproduction. 88 (2), 40 (2013).</li><li>Patel, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+reorganization+of+the+genome+shapes+the+recombination+landscape+in+meiotic+prophase.">Dynamic reorganization of the genome shapes the recombination landscape in meiotic prophase.</a> Nature Structural &amp; Molecular Biology. 26 (3), 164-174 (2019).</li><li>Alavattam, K. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Attenuated+chromatin+compartmentalization+in+meiosis+and+its+maturation+in+sperm+development.">Attenuated chromatin compartmentalization in meiosis and its maturation in sperm development.</a> Nature Structural &amp; Molecular Biology. 26 (3), 175-184 (2019).</li><li>Adams, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNF8+and+SCML2+cooperate+to+regulate+ubiquitination+and+H3K27+acetylation+for+escape+gene+activation+on+the+sex+chromosomes.">RNF8 and SCML2 cooperate to regulate ubiquitination and H3K27 acetylation for escape gene activation on the sex chromosomes.</a> PLoS Genetics. 14 (2), 1007233 (2018).</li><li>Wiltshire, T., Park, C., Caldwell, K. A., Handel, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induced+premature+G2/M-phase+transition+in+pachytene+spermatocytes+includes+events+unique+to+meiosis.">Induced premature G2/M-phase transition in pachytene spermatocytes includes events unique to meiosis.</a> Developmental Biology. 169 (2), 557-567 (1995).</li></ol>

Burada spermatosit ve spermatid alt popülasyonlarını tek bir yetişkin erkek fareden izole etmek için pratik ve basit bir protokol salıyoruz. Bu protokolün tekrarlanabilirliğini sağlamak için dikkat gerektiren bazı kritik adımlar vardır. Enzim sindiriminden önce, yıkama adımı interstisyel hücreleri ortadan kaldırmayı amaçlar; sindirim sonra, bu adım spermatozoa ve enkaz kaldırmak için yardımcı olur. Yıkama / santrifüj 3 kez önemlidir. Bizim dissosyasyon tampon tarifi, birkaç farklı enzimleri...

Spermatogenez spermatogonial kök hücrelerin küçük bir popülasyon yetişkinyaşam1,2boyunca sperm çok sayıda sürekli üretimini sürdürmek karmaşık bir süreçtir. Spermatogenez sırasında, dinamik kromatin remodeling spermatojenik hücreler haploid spermatidsüretmekiçin meyozis geçmesi gerçekleşir 3,4,5. Meyotik spermatositlerin izolasyonu moleküler araştırma için gereklidir ve sedimantasyona dayalı ayırma6,7 ve floresanaktif hücre ayrıştırma (FACS)8,9,10,11,12,13,14,15,16,17dahil olmak üzere meyotik spermatositleri izole etmek için çeşitli yaklaşımlar oluşturulmuştur. Ancak, bu yöntemlerin teknik sınırlamaları vardır. Sedimantasyon aparatlığı çok sayıda hücre yitirmede5,6,7, emek yoğundur. Kurulan FACS tabanlı yöntem DNA içeriği ve ışık saçılma özelliklerine göre meiotik spermatositleri ayırmak için Hoechst 33342 (Ho342) kullanır ve bir ultraviyole (UV) lazer8,9,10,11ile donatılmış FACS hücre ayırıcıları gerektirir. Alternatif FACS tabanlı yöntemler floresan proteinleri ifade transgenik fare hatları gerektirir, spermatogenez senkronizasyonu12, veya hücre fiksasyonu ve canlı hücrelerin izolasyonu ile uyumlu olmayan antikor etiketleme13. Hücre geçirgen DNA bağlayıcı boya, BoyaDöngüsüYeşil leke14, 15,16,17kullanarak başka bir alternatif yöntem olsa da, bu yöntem juvenil testislerden spermatojenik hücrelerin izolasyonu için tavsiye edilir. Bu nedenle, herhangi bir yaştaki herhangi bir fare suş uygulanabilir ve herhangi bir FACS hücre ayırıcı kullanılarak yapılabilir canlı meiotik spermatositler için basit ve sağlam bir izolasyon yöntemi geliştirmek için kritik bir ihtiyaç vardır.
Burada Boya Döngüsü Menekşe (DCV) lekekullanarak böyle uzun zamandır aranan hücre izolasyon protokolü açıklar. DCV düşük sitotoksisite, hücre geçirilebilir DNA bağlayıcı boya yapısal Ho342 benzer ama bir uyarma spektrumu ile menekşe aralığı doğru kaymıştır18. Buna ek olarak, DCV DCG ile karşılaştırıldığında daha geniş bir emisyon spektrumuna sahiptir. Böylece, uv lazer ile donatılmış olmayan bir FACS hücre ayırıcı kullanımına izin, ekipman esnekliğini artırır hem UV ve menekşe lazerler, tarafından heyecan verici olabilir. Burada sunulan DCV protokolü, Ho342 protokolünün avantajını taklit eden, DCV mavi ve DCV kırmızı ile iki boyutlu ayırma kullanır. Bu avantajla, DCV protokolümüz yetişkin testislerinden yüksek oranda zenginleştirilmiş mikrop hücrelerini izole etmemizi sağlar. Canlı spermatojenik hücreleri bir farenin yetişkin fare testislerinden (iki testisten) izole etmek için ayrıntılı bir gating protokolü salıyoruz. Ayrıca, bu hücre yalıtımı için kullanılabilecek fare testislerinden tek hücreli süspansiyon hazırlamak için etkili ve hızlı bir protokol açıklarız. Prosedürütamamlamak için kısa bir süre gerektirir (tek hücreli süspansiyon hazırlanması - 1 saat, boya boyama - 30 dk ve hücre sıralama - 2-3 saat: toplam - 4-5 saat gerekli hücrelerin sayısına bağlı olarak; Şekil 1). Hücre izolasyonu sonrasında, RNA-seq, ATAC-seq, ChIP-seq ve hücre kültürü gibi çok çeşitli downstream uygulamaları tamamlanabilir.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>1.5 ml tube</td>
			<td>Watson</td>
			<td>131-7155C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 mm Petri dish</td>
			<td>Corning, Falcon</td>
			<td>351029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL Centrifuge tube</td>
			<td>Watson</td>
			<td>1332-015S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 ml polystyrene tube with cell strainer snap cap (35 &#181;m nylon mesh)</td>
			<td>Corning, Falcon</td>
			<td>352235</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL Centrifuge tube</td>
			<td>Watson</td>
			<td>1342-050S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>60 mm Petri dish</td>
			<td>Corning, Falcon</td>
			<td>351007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70 &#181;m nylon mesh</td>
			<td>Corning, Falcon</td>
			<td>352350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell sorter</td>
			<td>Sony</td>
			<td>SH800S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase, recombinant, Animal-derived-free</td>
			<td>FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation</td>
			<td>036-23141</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase, Type 1</td>
			<td>Worthington</td>
			<td>LS004196</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cover glass</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>12-544-G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytospin 3</td>
			<td>Shandon</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI (4&#39;,6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride)</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>D1306</td>
			<td>working concentration: 0.1 &#956;g/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dnase I</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D5025-150KU</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey serum</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S30-M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s phosphate-buffered saline (DPBS)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium (DMEM)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11885076</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>16000044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hostone H1T antibody</td>
			<td>gift from Mary Ann Handel</td>
			<td></td>
			<td>1/2000 diluted</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hank&#8217;s balanced salt solution (HBSS)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14175095</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hyaluronidase from bovine testes</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H3506-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline (PBS)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P5493-4L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipettemen</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProLong Gold Antifade Mountant</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>P36930</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rH2AX antibody</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>05-635</td>
			<td>working concentration: 2 &#956;g/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sperm Fertilization Protein 56 (Sp56) antibody</td>
			<td>QED Bioscience</td>
			<td>55101</td>
			<td>working concentration: 0.5 &#956;g/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterilized forceps and scissors</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superfrost /Plus Microscope Slides</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>12-550-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYCP3 antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab205846</td>
			<td>working concentration: 5 &#956;g/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TWEEN 20 (Polysorbate 20)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P9416</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vybrant DyeCycle Violet Stain (DCV)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>V35003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of murine spermatogenic cells using a violet-excited cell-permeable dna binding dye

Meyozis ve spermatogenezin altında yatan moleküler mekanizmaları araştırmak için meyotik spermatositlerin izolasyonu esastır. Floresan aktive hücre sıralama ile birlikte Hoechst 33342 boyama kullanarak kurulmuş hücre izolasyon protokolleri olmasına rağmen, ultraviyole lazer ile donatılmış hücre ayırıcılar gerektirir. Burada, Hoechst 33342'ye benzer yapısal olarak benzeyen düşük sitotoksisite DNA bağlayıcıboyası Olan DyeCycle Violet (DCV) lekesi kullanılarak bir hücre izolasyon protokolü tanımlanmaktadır. DCV hem ultraviyole hem de mor lazerler tarafından heyecanlı olabilir, hangi ekipman seçimi esnekliğini artırır, ultraviyole lazer ile donatılmış olmayan bir hücre ayırıcı dahil. Bu protokolü kullanarak, leptoten/zigotene, pachytene ve diplotene spermatositler de dahil olmak üzere meyotik profaz I'de üç canlı hücre alt popülasyonunu ve post-meiyotik yuvarlak spermatidleri izole edebilir. Ayrıca fare testislerinden tek hücreli süspansiyon hazırlamak için bir protokol açıklarız. Genel olarak, yordamın tamamlanması için kısa bir süre (gerekli hücrelerin sayısına bağlı olarak 4-5 saat), birçok downstream uygulamaları kolaylaştırır gerektirir.

Bu sıralama protokolünün temsili bir sonucu Şekil 3'tegösterilmiştir. İki testisin (bir fare) toplam sıralama süresi genellikle hücre süspansiyonunun konsantrasyonuna ve sıralama hızına bağlı olarak yaklaşık 3 saattir. Sıralamadan sonra spermatositlerin saflığı SYCP3 ve γH2AX(Şekil 3A)immünboyboyama ile doğrulanır. Sıralanmış L/Z, P, D spermatosit fraksiyonlarının temsili saflıkları sırasıyla %80.4, %90.6 ve %87.6 civarındad?...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Murine Spermatogenic Cells using a Violet-Excited Cell-Permeable DNA Binding Dye at JoVE.com

Isolation of Murine Spermatogenic Cells using a Violet-Excited Cell-Permeable DNA Binding Dye

Burada yetişkin fare testislerinden canlı meiotik ve post-meyotik mikrop hücrelerini izole etmek için basit ve etkili bir yöntem salıyoruz. Düşük sitotoksisite, menekşe heyecanlı DNA bağlayıcı boya ve floresan-aktive hücre sıralama kullanarak, bir birçok downstream uygulamaları için son derece zenginleştirilmiş spermatojenik hücre popülasyonları izole edebilirsiniz.

Mor-Heyecanlı Hücre-Geçirgen DNA Bağlayıcı Boya Kullanılarak Murine Spermatojenik Hücrelerin İzolasyon

Isolation of meiotic spermatocytes is essential to investigate molecular mechanisms underlying meiosis and spermatogenesis. Although there are established ...

Erişkin farelerden spermatosit ve spermatid alt popülasyonlarını izole etmek için bu yeni etkili yöntem, meyozis ve spermatogenezin altında yatan moleküler mekanizmaları araştırmak için kullanılabilir. Bu yöntem, şu anda kullanılan FACS emirlerine uygulanabilen geniş bir uyarma spektrumlu düşük sitotoksisite DNA bağlayıcı boya kullanır. Bu yöntem çok basittir.En zorlu yönü akış sitometri gating ama ayrıntılı gating stratejisi diğer hücre ayırıcılar için protokol adapte yardımcı olmalıdır. Prosedürü gösteren Yu-Han Yeh, Satoshi Namekawa Laboratuvarı'ndan bir araştırma asistanı olacaktır. Sekiz haftalık erkek fareden her iki testis hasat sonra, buz soğuk PBS iki mililitre içeren 60 milimetre Petri çanak dokuları yerleştirin ve tuluk albuginea kaldırın.Seminiferous tübülleri hafifçe dağıtmak için testisleri forcep'lerle hafifçe ayırın. Ve tübülleri 100 milimetrelik petri kabında bir damla taze buz gibi pbs'ye aktarın. Tübülleri hafifçe çözmek ve tübülleri az önce gösterildiği gibi üç ek PBS damlacıklarında yıkamak için büşraları kullanın.Son yıkamadan sonra, 37 santigrat derecede 20 dakikalık bir kuluçka için iki mililitre dissosiasyon tamponu içeren 15 mililitrelik bir tüp içine untangled seminiferous tübüller yerleştirin. Kuluçka sonunda, tüpü kuvöze altı dakika daha dönmeden önce tübülleri 20 kez hafifçe pipetlemek için 1000 mikrolitrelik bir pipet kullanın. Kuluçka sonunda, pipet dokular ek 20 kez, tüp kuvöz e dönmeden önce.Üç dakika sonra, tübülleri 10 kez veya görünür doku parçaları kalmayana kadar hafifçe pipetleyin, 10 mililitre FACS tamponu yla ayrışma yı durdurmadan önce. Sonra, spermatozoa ve mümkün olduğunca çok enkaz kaldırmak için ikinci yıkama için taze FACS tampon için ek bir 10 mililitre kullanarak doku süspansiyon iki kez santrifüj. Akış sitometrik analizi için hücreleri lekelemek için, FACS tampon üç mililitre pelet yeniden askıya.Ve hücre süspansiyonuna 70 mikron naylon hücresüzden 50 mililitrelik bir tüpe süzün. Saydıktan sonra, lekelenmemiş negatif kontrol olarak hücrelerin %10'u buz üzerinde yeni bir tüpe aktarın. Ve kalan hücre süspansiyoniçine iyice DCV leke altı mikrolitre karıştırın.30 dakikalık bir kuluçka dan sonra 37 santigrat derece karanlıkta nazik sallayarak her 10 dakikada bir, hücrelere DNase I beş mikrolitre ekleyin. Ve hücreleri 35 mikron naylon örgü süzgeçten buz üzerinde beş mililitrelik FACS tüpüne filtreleyin. Hücrelerin akış sitometrik analizi için, akış analizi yazılımında yeni bir deneme oluşturun ve çalışma sayfası araçları menüsü altında, doğrusal ölçekte geri dağılım alanı ile karşı ileri dağılım alanı oluşturmak için yeni yoğunluğu tıklatın.Logaritmik ölçekte DCV mavi histogram çizimi oluşturmak için yeni histogramı tıklatın. Ve lekesiz örneği işlemeye başlamak için başlat ve kaydet'i tıklatın. Örnek çalışırken, lekesiz hücreleri ileri ve geri dağılım çizimi ölçeğine yerleştirmek için hem ileri hem de yan dağılım PMT gerilimlerini ayarlamak için dedektör ve eşik ayarlarını tıklatın.DCV mavi histogram logaritma ilk on yıl içinde DCV negatif popülasyonun konumunu bulmak için jappy kanalı için PMT voltajayarlayın. Ardından, lekelenmemiş örneği boşaltmak için dur'u tıklatın. Lekeli numuneyi kısa bir süre girdaplayıp yükledikten sonra, örnek için yeni bir çalışma sayfası oluşturmak için sonraki tüpü tıklatın.Sitometreyi altı etkinliğe en az bir kez 10 almak için ayarlayın ve başlat ve kaydet'i tıklatın. Ardından, ileri dağılım yüksekliği ve ileri dağılım genişliği oluşturmak için yeni yoğunluk seçeneğini tıklatın. Ve DCV mavi karşı DCV kırmızı yoğunluk çizer doğrusal bir ölçekte.İleri dağılım alanı ve geri dağılım alanı yoğunluğu çiziminde, hücrelerin çoğunu içerecek şekilde hücre adı verilen bir kapı çizmek ve küçük enkazı dışlamak için çokgen aracını kullanın. Bu geçidi ileri dağılım yüksekliğine karşı ileri dağılım genişliği çizimine uygulayın ve tek hücreolmayan hücreleri hariç tutmak için tek bir hücrenin kapısını çizmek için dikdörtgen aracını kullanın. Tek hücrenin kapısını DCV mavisine karşı DCV kırmızı yoğunluk çizimine uygulayın ve genişletilmiş bir profili yakalamak için ölçeği ayarlayın.Lekelenmemiş hücreleri ve yan popülasyonu dışlamak için bir DCV kapısı çizmek ve doğrusal ölçekte Bir DCV mavi histogram çizimine geçit uygulamak için çokgen aracını kullanın. Üç ana zirvefarklı 1C, 2C ve 4C DNA içeriğine atıfta bulunur. Doğrusal ölçekte ikinci bir DCV mavisi ile DCV kırmızı yoğunluk çizimi oluşturun.Ve 1C ve 4C popülasyonlarını bulmak için plan üzerine DCV kapısı arka kapı. Doğrusal ölçekte başka bir DCV mavisi ile DCV kırmızı yoğunluk çizimi oluşturun. Ve 1C popülasyonuna bir kapı çizmek için elips aracını kullanın.4C popülasyonuna sürekli bir eğri yle geçit vermek için çokgen aracını kullanın. Ve doğrusal bir ölçekte başka bir DCV mavi karşı DCV kırmızı yoğunluk arsa oluşturun. 4C tek kapı oluşturmak için çokgen aracını kullanın.Yan dağılım arsa yeni bir ileri, pachytene, diploten ve leptoten, zigot spermatosit kapıları oluşturmak için elips aracı kullanın. Tüm kapılar çizildiğinde, üç popülasyonun kapı içinde sürekli sırada olduğundan emin olmak için 4C kapısı için uygulamak için doğrusal ölçekte yeni bir DCV mavisi ile DCV kırmızı renkli nokta çizimi oluşturun. Ardından, doğrusal ölçekte geri dağılım alanı yoğunluğuna karşı yeni bir ileri dağılım alanı oluşturun ve saf yuvarlak spermatid popülasyonu olarak hücrelerin birleşik boyutunu seçin.Sıralamadan sonra, ayrılmış leptoten, zigotene, pachyten e-pişen ve diploten spermatosit fraksiyonlarının temsili saflıkları genellikle SYCP3 ve Gamma H2AX immünboyama tarafından doğrulanan %80 ile %90 arasındadır. Yuvarlak spermatid hizip saflığı Sp56 ve H1t boyama ile birlikte DCV ile çekirdek boyama ile teyit edilebilir, ve aynı zamanda tipik olarak yaklaşık 90%Izole hücre popülasyonlarının canlılığı genellikle% 95 üzerinde ve tek bir yetişkin fare her fraksiyonun ortalama toplam verimleri genellikle çeşitli downstream analizi için yeterlidir. Sitolunan hücreler spermatogenez sırasında gen ekspresyonunu ve regülasyonlarını daha iyi keşfetmek için çeşitli yeni nesil sıralama analizleri için kullanılabilir.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Dual Labeling of Neural Crest Cells and Blood Vessels Within Chicken Embryos Using ChickGFP Neural Tube Grafting and Carbocyanine Dye DiI Injection

Dual Labeling of Neural Crest Cells and Blood Vessels Within Chicken Embryos Using ChickGFP Neural Tube Grafting and Carbocyanine Dye DiI Injection

ChickGFP Nöral Tüp Greftleme ve Karbosiyanine Boya DiI Enjeksiyonu Kullanılarak Tavuk Embriyoları İçinde Nöral Kret Hücrelerinin ve Kan Damarlarının Çift Etiketlenimi

All developing organs need to be connected to both the nervous system (for sensory and motor control) as well as the vascular system (for gas exchange, ...

Murine Dermal Fibroblast Isolation by FACS

FACS ile Murin Dermal fibroblast İzolasyonu

Fibroblasts are the principle cell type responsible for secreting extracellular matrix and are a critical component of many organs and tissues. Fibroblast ...

Isolation of Murine Embryonic Hemogenic Endothelial Cells

Fare Embriyonik Hemogenic endotel hücrelerinin izolasyonu

The specification of hemogenic endothelial cells from embryonic vascular endothelium occurs during brief developmental periods within distinct tissues, ...

Isolation and Expansion of Mesenchymal Stem/Stromal Cells Derived from Human Placenta Tissue

İnsan Plasenta Doku türetilen İzolasyon ve mezenkimal kök Genişleme / Stromal hücreler

Mesenchymal stem/stromal cells (MSC) are promising candidates for use in cell-based therapies. In most cases, therapeutic response appears to be cell-dose ...

The Production of Pluripotent Stem Cells from Mouse Amniotic Fluid Cells Using a Transposon System

Bir Transpozon Sistemi Kullanılarak Fare Amniyotik Sıvı Hücreleri pluripotent kök hücrelerin üretimi

Induced pluripotent stem (iPS) cells are generated from mouse and human somatic cells by forced expression of defined transcription factors using ...

Horizontal Whole Mount: A Novel Processing and Imaging Protocol for Thick, Three-dimensional Tissue Cross-sections of Skin

Yatay Dağ Dağı: Derinin kalın, üç boyutlu doku kesitleri için yeni bir İşleme ve Görüntüleme Protokolü

Processing a tissue of interest to generate a microscopic image that supports a scientific argument can be challenging. The acquisition of high-quality ...

Isolation of Human Endometrial Stromal Cells for In Vitro Decidualization

Isolation of Human Endometrial Stromal Cells for In Vitro Decidualization

Vitro Decidualization için insan endometrium Stromal hücre izolasyon

The differentiation of human endometrial stromal cells (HESC) from fibroblast-like appearance into secretory decidua is a transformation required for ...

Computational Analysis of the Caenorhabditis elegans Germline to Study the Distribution of Nuclei, Proteins, and the Cytoskeleton

Computational Analysis of the Caenorhabditis elegans Germline to Study the Distribution of Nuclei, Proteins, and the Cytoskeleton

Çekirdeklerin dağıtım, proteinler ve sitoiskeleti çalışmaya Caenorhabditis elegans Germline sayısal analizi

The Caenorhabditis elegans (C. elegans) germline is used to study several biologically important processes including stem cell development, apoptosis, and ...

In Vitro Generation of Somite Derivatives from Human Induced Pluripotent Stem Cells

Somite türevleri indüklenen insan nesil Vitro Pluripotent kök hücreler

In response to signals such as WNTs, bone morphogenetic proteins (BMPs), and sonic hedgehog (SHH) secreted from surrounding tissues, somites (SMs) give ...

Three-dimensional Angiogenesis Assay System using Co-culture Spheroids Formed by Endothelial Colony Forming Cells and Mesenchymal Stem Cells

Endotel Kolonisi Oluşturan Hücreler ve Mezenkimal Kök Hücreler tarafından Oluşturulan Eş Kültür Sfaoidler Kullanılarak Üç Boyutlu Anjiyogenez Tsay Sistemi

Studies in the field of angiogenesis have been aggressively growing in the last few decades with the recognition that angiogenesis is a hallmark of more ...