Name: bovine ovarian cortex tissue culture
Uploaded: 2021-01-14T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Bovine Ovarian Cortex Tissue Culture at JoVE.com

Denne forskning blev støttet af National Institute of Food and Agriculture 2013-67015-20965 til ASC, University of Nebraska Food for Health Competitive Grants til ASC. Usa's landbrugsministerium Hatch tilskud NEB26-202/W3112 Tiltrædelse # 1011127 til ASC, Hatch-NEB ANHL Tiltrædelse # 1002234 til ASC. Kvantitativ Life Sciences Initiative Summer Postdoctoral Scholar Support – COVID-19 Award for sommerstøtte til CMS.
Forfatterne vil gerne udvide deres påskønnelse til Dr. Robert Cushman, US Meat Animal Research Center, Clay Center, NE at takke ham for at give æggestokkene i en tidligere publikation, som derefter blev brugt i det nuværende papir som et proof of concept i validering af denne teknik.

Æggestokkene blev fremstillet fra U. S. Meat Animal Research Center16. Som tidligere nævnt16, alle procedurer blev godkendt af U.S. Meat Animal Research Center (USMARC) Animal Care and Use Committee i overensstemmelse med vejledningen for pleje og brug af landbrugsdyr i landbrugsforskning og undervisning. Æggestokkene blev bragt til University of Nebraska-Lincoln Reproduktiv Laboratory, hvor de blev behandlet og kultiveret.
1. Forberedelse af p?...

Fordelen ved in vitro ovarie cortex kultur, som beskrevet i dette manuskript, er, at folliklerne udvikler sig i et normaliseret miljø med tilstødende stroma omkring folliklerne. De somatiske celler og oocyt forbliver intakte, og der er passende celle-til-celle kommunikation som en in vivo-model. Vores laboratorium har konstateret, at en 7-dages kultur system giver repræsentative folliculogenese og steroidogenese data til behandling af æggestokkene cortex. Andre protokoller for ovarievævskultur har enten relativt kor...

Æggestokken cortex repræsenterer det ydre lag af æggestokken, hvor follikel udvikling forekommer1. Ursække, der oprindeligt blev arresteret under udvikling, vil blive aktiveret til at blive primære, sekundære og derefter antrale eller tertiære follikler baseret på parakrine og gonadotropinin input1,2,3,4. For bedre at forstå fysiologiske processer i æggestokken kan vævskultur bruges som en in vitro-model, hvilket giver mulighed for et kontrolleret miljø til at udføre eksperimenter. Mange undersøgelser har udnyttet æggestokkene væv kultur for forskning i assisteret reproduktiv teknologi, fertilitet bevarelse, og kræft i æggestokkene5,6,7. Ovarievævskultur har også fungeret som model for undersøgelse af reproduktive toksiner, der skader æggestokkenes sundhed og ætiologien af reproduktive lidelser som polycystisk ovarie syndrom (PCOS)8,9,10,11. Således gælder dette kultursystem for en bred vifte af specialiteter.
Hos gnavere er hele foster- eller perinatale gonader blevet anvendt i reproduktive biologiforsøg12,13,14,15. Gonader fra større husdyr kan imidlertid ikke dyrkes som hele organer på grund af deres store størrelse og potentielle degeneration. Derfor skæres kvæg og ikke-human primat ovarie cortex i mindre stykker16,17,18. Mange undersøgelser har kultiveret små ovarie cortex stykker til at studere forskellige vækstfaktor (r) i ursækken indledning i husdyr og ikke-menneskelige primater1,17,18,19. Brugen af ovarie cortexkultur har også vist primordial follikelinitiering i mangel af serum til kvæg og primat kortikale stykker, der er kultiveret i 7 dage20. Yang og Fortune i 2006 behandlet føtal ovarie cortex kultur medium med en række testosteron doser over 10 dage og bemærkede, at 10-7 M koncentrationen af testosteron øget follikel rekruttering, overlevelse, og øget progression af tidlige fase follikler19. I 2007, ved hjælp af æggestokkene cortex kulturer fra kvæg fostre (5-8 måneders svangerskab), Yang og Fortune rapporterede en rolle for Vaskulære Endothelial Growth Factor A (VEGFA) i den primære til sekundære follikel overgang21. Desuden har vores laboratorium udnyttet æggestokkene cortex kulturer til at demonstrere, hvordan VEGFA isoforme (angiogen, antiangiogen, og en kombination) kan regulere forskellige signal transduktion veje gennem Kinase domæne receptor (KDR), som er den vigtigste signal transduktion receptor, VEGFA binder16. Disse oplysninger gav mulighed for en bedre forståelse af, hvordan forskellige VEGFA-isoformer påvirker signalvejene til at fremkalde follikel progression eller anholdelse. Samlet set, dyrkning af æggestokkene cortex stykker in vitro med forskellige steroider eller vækstfaktorer kan være en værdifuld analyse til at bestemme virkningerne på mekanismer, der regulerer folliculogenese. På samme måde kan dyr, der er udviklet på forskellige ernæringsmæssige regimer, have ændret ovariemikrvironments, som kan fremme eller hæmme folliculogenese, der påvirker kvinders reproduktive modenhed. Således er vores mål i det nuværende manuskript at rapportere kvæg cortex kultur teknik og afgøre, om der er forskelle i æggestokkene mikromiljø efter in vitro kultur af kvæg cortex fra kvier fodret enten Control eller Stair-Step kost indsamlet på 13 måneder som beskrevet tidligere16.
Derfor var vores næste skridt at bestemme det æggestokkene mikromiljø i disse kvier, der blev udviklet med forskellige ernæringsmæssige kostvaner. Vi evaluerede æggestokkene cortex fra kvier fodret med enten en Stair-Step eller Control kost. Kontrol kvier blev tilbudt en vedligeholdelse kost på 97,9 g / kg0,75 i 84 dage. Stair-Step-diæten blev indledt efter 8 måneder, der indeholdt en begrænset fodret kost på 67,4 g / kg0,75 i 84 dage. Efter de første 84 dage, mens Control kvier fortsatte med at modtage 97,9 g / kg0,75, blev Stair-Step oksekød kvier tilbudt 118,9 g / kg0,75 i yderligere 68 dage, hvorefter de blev ovariektomi ved 13 måneder16 for at studere ændringer i follikulære stadier og morfologi før og efter kultur. Vi har også analyseret for forskelle i steroider, steroid metabolitter, chemokines, og cytokiner udskilles i cortex medier. Steroider og andre metabolitter blev målt for at afgøre, om der var nogen direkte virkninger fra behandlinger udført in vivo og/eller in vitro på væv levedygtighed og produktivitet. Ændringer i æggestokkene mikromiljø før og efter kultur gav et øjebliksbillede af det endokrine miljø og folliculogenese forud for kultur, og hvordan kultur eller behandling under kultur påvirker follikel progression eller anholdelse.
Æggestokke blev indsamlet efter ovariektomi blev udført på US Meat Animal Research Center (USMARC) i henhold til deres IACUC procedurer fra Control and Stair-Step kvier på 13 måneder afalder 16, rengøres med steril fosfat buffer saltvand (PBS) vasker med 0,1% antibiotika til at fjerne blod og andre forurenende stoffer, trimmet overskydende væv, og transporteres til University of Nebraska-Lincoln (UNL) Reproduktiv fysiologi laboratorium UNL på 37 ° C23 . Ved UNL blev ovarie cortexstykker skåret i små firkantede stykker (~ 0,5-1 mm3; Figur 1) og dyrkes i 7 dage (figur 2). Histologi blev udført på cortex kultur dias før og efter kultur til at bestemme follikler fase16,24 (Figur 3 og Figur 4), og ekstracellulære matrix proteiner, der kan indikere fibrose (Picro-Sirus Red, PSR; Figur 5. Dette gjorde det muligt at fastslå virkningen af in vivo ernæringsmæssige regimer på follikel stadier og tilladt sammenligning af 7 dages ovarie cortex på follikel stadier og follikel progression. Gennem hele kulturen blev mediet indsamlet og ændret dagligt (ca. 70% af medierne blev indsamlet hver dag; 250 μL/brønd), således at enten daglige hormoner/cytokiner/chemokiner kan vurderes eller samles over dage for at opnå gennemsnitlige koncentrationer. Steroider såsom androstenedion (A4) og østrogen (E2) kan samles over 3 dage og vurderes gennem radioimmunoassay (RIA; Figur 6) og samlet over 4 dage pr. dyr og analyseret via højtydende flydende kromatografi-massespektrometri (HPLC-MS)24,25 ( tabel1). Cytokin arrays blev udnyttet til at vurdere cytokin og chemokin koncentrationer i æggestokkene cortex kultur medium26 (tabel 2). Realtid polymerase kædereaktion (RT-PCR) assay plader blev udført for at bestemme genekspression for specifikke signal transduktion veje som påvist tidligere16. Alle steroid, cytokin, follikel fase og histologiske markører giver et øjebliksbillede af æggestokkene mikromiljø og spor om evnen til at mikromiljøet til at fremme "normal" eller "unormal" folliculogenese.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>#11 Scapel Blade</td>
			<td>Swann-Morton&#160;</td>
			<td>303</td>
			<td>Scaple Blade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>#21 Scapel Blade</td>
			<td>Swann-Morton&#160;</td>
			<td>307</td>
			<td>Scaple Blade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>500mL Bottle Top Filter</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430514</td>
			<td>Bottle Top Filter 0.22 &#181;m pore for filtering medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AbsoluteIDQ Sterol17 Assay</td>
			<td>Biocrates</td>
			<td>Sterol17 Kit</td>
			<td>Samples are sent off to Biocrates and steroid panels are run and results are returned&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Androstenedione Double Antibody RIA Kit</td>
			<td>MPBio</td>
			<td>7109202</td>
			<td>RIA to determine androstenedione from culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Belgium A4 Assay Kit&#160;</td>
			<td>DIA Source&#160;</td>
			<td>KIP0451</td>
			<td>RIA to determine androstenedione from culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Cytokine Array Q3</td>
			<td>RayBiotech</td>
			<td>QAB-CYT-3-1</td>
			<td>Cytokine kit to determine cytokines from culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cellSens Software Standard 1.3</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>7790</td>
			<td>Imaging Software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin-Transferrin-Selenium-X</td>
			<td>Gibco ThermoFisher Scientific</td>
			<td>5150056</td>
			<td>Addative to the culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leibovitz&#39;s L-15 Medium</td>
			<td>Gibco ThermoFisher Scientific</td>
			<td>4130039</td>
			<td>Used for tissue washing on clean bench, and in the biosafety cabniet&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope&#160;</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>SZX16</td>
			<td>Disection microscope used for imaging tissue culture pieces&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Camera&#160;</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>DP71</td>
			<td>Microscope cameraused for imaging tissue culture pieces&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Millicell Cell Culture Inserts 0.4&#181;m, 12,mm Diameter</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>PICM01250</td>
			<td>Inserts that allow the tissue to rest against the medium without being submerged in it</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multiwell 24 well plate</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353047</td>
			<td>Plate used to hold meduim, inserts, and tissues</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish 60 x 15 mm</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>351007</td>
			<td>Petri dish used for washing steps prior to culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-Buffered Saline (PBS 1X)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>21-040-CV</td>
			<td>Used for tissue washing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SAS Version 9.3</td>
			<td>SAS Institute&#160;</td>
			<td>9.3 TS1M2</td>
			<td>Statistical analysis software&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thomas Stadie-Riggs Tissue Slicer</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td>6727C10</td>
			<td>Tissue slicer for preperation of thin uniform sections of fresh tissue</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Waymouth MB 752/1 Medium</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>W1625</td>
			<td>Medium used for tissue cultures</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

bovine ovarian cortex tissue culture

Follikel udvikling fra ur til antral fase er en dynamisk proces inden for æggestokkene cortex, som omfatter endokrine og parakrine faktorer fra somatiske celler og cumulus celle-oocyt kommunikation. Lidt er kendt om æggestokkene mikromiljø og hvordan kytokiner og steroider produceret i det omgivende miljø påvirke follikel progression eller anholdelse. In vitro kultur æggestokkene cortex gør det muligt follikler til at udvikle sig i et normaliseret miljø, der forbliver understøttet af tilstødende stroma. Vores mål var at bestemme effekten af ernæringsmæssige Stair-Step kost på æggestokkene mikromiljø (follikel udvikling, steroid, og cytokin produktion) gennem in vitro kultur af kvæg ovarie cortex. For at opnå dette blev æggestokkene kortikale stykker fjernet fra kvier, der gennemgår to forskellige ernæringsmæssigt udviklede ordninger før puberteten: Kontrol (traditionel ernæringsudvikling) og Stair-Step (fodring og begrænsning under udvikling), der blev skåret i ca. 0,5-1 mm3 stykker. Disse stykker blev efterfølgende passeret gennem en række vasker og placeret på en vævskulturindsats, der er sat i et godt indeholdende Waymouths kulturmedium. Ovarie cortex blev kultiveret i 7 dage med daglige kulturmedier ændringer. Histologisk sektion blev udført for at bestemme follikel fase ændringer før og efter kulturen til at bestemme virkningerne af ernæring og virkningen af kultur uden yderligere behandling. Cortex kultur medium blev samlet over dage til at måle steroider, steroid metabolitter, og cytokiner. Der var tendenser til øget steroid hormoner i æggestokkene mikromiljø, der tillod follikel progression i Stair-Step versus Control æggestokkene cortex kulturer. Den ovarie cortex kultur teknik giver mulighed for en bedre forståelse af æggestokkene mikromiljø, og hvordan ændringer i endokrine sekretion kan påvirke follikel progression og vækst fra både in vivo og in vitro behandlinger. Denne kultur metode kan også vise sig gavnligt for at teste potentielle terapeutiske, der kan forbedre follikel progression hos kvinder til at fremme fertiliteten.

Denne kvæg cortex kultur procedure kan bruges til at bestemme en bred vifte af hormon, cytokin, og histologi data fra små stykker af æggestokken. Farvning, såsom hæmatoxylin og eosin (H&E), kan bruges til at bestemme ovariemorfologi gennem follikel iscenesættelse16,23,31 ( Figur3). Kort sagt blev follikler klassificeret som ur, som er en oocyt omgivet af et enkelt lag af pladeagtige præ-granu...

Watch this Scientific Journal Video about Bovine Ovarian Cortex Tissue Culture at JoVE.com

Bovine Ovarian Cortex Tissue Culture

In vitro kultur af kvæg ovarie cortex og effekten af ernæringsmæssige trappe-trin kost på æggestokkene mikromiljø præsenteres. Ovarie cortex stykker blev kultiveret i syv dage og steroider, cytokiner, og follikel faser blev evalueret. Den Stair-Step kost behandling havde øget steroidogenese resulterer i follikel progression i kultur.

Kvæg ovarie cortex vævskultur

Follicle development from the primordial to antral stage is a dynamic process within the ovarian cortex, which includes endocrine and paracrine factors ...

Denne protokol giver mulighed for en in vitro tilbundsgående undersøgelse af æggestokkene mikro miljø. Gør det muligt for brugerne at bestemme follikel vækst og udvikling, samt steroidogenese og overflod af immunmolekyler. En fordel ved denne teknik er evnen til direkte at evaluere ændringer i æggestokkene mikro miljø og nye follikler og vurdere den unikke samspil forårsaget af tilsætning af specifikke hormoner.Denne teknik kan bruges til at studere en række reproduktive lidelser forårsager follikulære anholdelser. For eksempel polycystisk ovarie syndrom. Da vi direkte kan evaluere æggestokkene mikro miljø in vitro, demonstrere proceduren vil være Brooke Bell, en bachelor forsker fra mit laboratorium.Brug cerated kæbekive, fastgør æggestokken, skær i halvdelen og begynd at fjerne udvendige skiver. Sikre, at ikke mere end en en til to millimeter dybde af overfladen er skåret væk fra æggestokken, således at ingen medulla er indsamlet. Skær tre til fire tynde strimler af æggestokkene cortex med en skalpel og placere strimler i den tredje PBS fyldt Petri parabol.Skær strimlerne i små firkantede stykker på 0,5 til en kubikmeter med en skalpelblad. Brug en lineal under Petri retter for at sikre, at stykkerne er af samme størrelse og tykkelse til at gøre konsekvent ovarie cortex stykker. Vask æggestokkene kortikale stykker i alle tre PBS og antibiotikum felt Petri retter, ved hjælp af buede spids sammentrækninger til at flytte stykker mellem vasker.Flyt cortex stykker gennem serien af LB-15 vasker og placere dem i en endelig LB-15-fyldt Petri parabol. Mærk låget med dyre-id'et og ovariesiden. Saml fire æggestokkene cortex stykker pr æggestokken og fastsætte dem til dag nul histologi og fryse yderligere stykker til RNA rensning.Brug de resterende vævsstykker til kultur. Forbered et biologisk sikkerhedsskab til en endelig vævsvask og kulturforberedelse. Sanitize forsyninger med 70% ethanol, før du placerer dem i den biologiske sikkerhed kabinet.Flyt alle æggestokkene cortex stykker beregnet til kultur til den biologiske sikkerhed kabinet og vaske dem igen i en LB-15-fyldt Petri parabol. Pipette 350 mikroliter af Waymouth medium per godt ind i en 24 godt væv kultur plade. Placer ubestrøget kultur godt skær i hver brønd ved hjælp af sammenkædninger og sørg for, at der ikke dannes bobler under bunden af indsatsen.Placer forsigtigt og forsigtigt fire æggestokkene cortexstykker på masken på hver indsats uden at punktere masken. Inkuber vævet ved 37 grader Celsius med 5% kuldioxid. Skift ovarie cortex kultur medium dagligt i syv dage og sørg for at bruge forvarmet Waymouth medium.Under medium ændringer, bruge sammenkøjninger til forsigtigt at løfte indsatsen ud af brønden og indsamle den kultiverede Waymouth medium i 0,5 milliliter rør. Sæt indsatsen tilbage i brønden og tilsæt 350 mikroliter af frisk kulturmedium ved at dispensere det mellem siden af indsatsen og brønden. Opbevar det indsamlede medium fra vævskulturen ved minus 20 grader Celsius.Efter syv dages kultur, billede æggestokkene cortex stykker ved hjælp af en dissektion mikroskop med en vedhæftet kamera og en computer imaging software program. Fix to æggestokkene cortex stykker pr brønd i Bouin's løsning for histologi og flash fryse til æggestokkene cortex stykker i flydende nitrogen for at opnå RNA for cDNA. Gentag dette trin for alle brønde med væv og saml derefter mediet fra dag syv og opbevaret det minus 20 grader.Lad æggestokkene cortex stykker til at forblive nedsænket i Bouin opløsning i ca 1,5 timer, derefter vaske dem med 70% ethanol tre gange, holde vævet i 70% ethanol og rydde det dagligt, indtil opløsningen ikke længere er gul. Hæmatoxylin og eosin plet blev udført for ursække, tidlige primære follikler, primær follikel, sekundær follikel og antral follikel. Follikel iscenesættelse blev gennemført på en ovarie cortex fastsat før og efter kultur til at vurdere folliculogenese.Forskellen i morfologi som bestemt af kollagen deposition kan indikere fibrose i æggestokkene cortex fra trappe-trin eller kontrol kvier. En sammenligning af det gennemsnitlige areal af picrosirius rød positiv farvning pr æggestokkene cortex fyldt mellem kontrol og trappe-trin kvier er vist her. Daglig samling af kultur medium blev samlet over tre dage til at vurdere varieret steroid hormon produktion, ved hjælp af en radioimmunoassay.Steroid metabolitter og cytokin produktion blev også målt i æggestokkene cortex kultur medium fra en brønd for hvert dyr samlet over fire dage af kultur. Jo længere vævet sidder, jo sværere kan det være at arbejde med. Det kan være nødvendigt at øve præcise snit.Denne teknik bruges til at forstå virkningerne på signal transduktion veje til at redde overskydende steroidogenese at bestemme virkningerne af overskydende steroider på cytokin og chemokin produktion, og at bestemme virkningerne på follikel progression eller anholdelse i æggestokkene væv.

Research

JoVE Journal

Biology

Actin Co-Sedimentation Assay; for the Analysis of Protein Binding to F-Actin

The actin cytoskeleton within the cell is a network of actin filaments that allows the movement of cells and cellular processes, and that generates ...

Electrospinning Fibrous Polymer Scaffolds for Tissue Engineering and Cell Culture

As the field of tissue engineering evolves, there is a tremendous demand to produce more suitable materials and processing techniques in order to address ...

A Tissue Culture Model of Estrogen-producing Primary Bovine Granulosa Cells

En vævskultur Model af østrogen-producerende primære Bovine Granulosa-celler

Ovarian granulosa cells (GC) are the major source of estradiol synthesis. Induced by the preovulatory luteinizing hormone (LH) surge, cells of the theca ...

Bovine Mammary Gland Biopsy Techniques

Kvæg mælkekirtlen biopsi teknikker

Bovine mammary gland biopsies allow researchers to collect tissue samples to study cell biology including gene expression, histological analysis, ...

Reproductive Techniques for Ovarian Monitoring and Control in Amphibians

Reproduktive teknikker til overvågning og kontrol af æggestokkene i padde

Ovarian control and monitoring in amphibians require a multi-faceted approach. There are several applications that can successfully induce reproductive ...

An Ex Vivo Tissue Culture Model of Cartilage Remodeling in Bovine Knee Explants

En ex vivo vævskultur model af brusk remodeling i kvæg knæ Explants

Ex vivo culture systems cover a broad range of experiments dedicated to studying tissue and cellular function in a native setting. Cartilage is a unique ...

Tissue Collection of Bats for -Omics Analyses and Primary Cell Culture

Vævs samling af flagermus til omics-analyser og primær cellekultur

As high-throughput sequencing technologies advance, standardized methods for high quality tissue acquisition and preservation allow for the extension of ...

Evaluating the Angiogenetic Properties of Ovarian Cancer Stem-Like Cells using the Three-Dimensional Co-Culture System, NICO-1

Evaluering af de angiogenetiske egenskaber ved stamceller til æggestokkræft ved hjælp af det tredimensionelle samkultursystem, NICO-1

Cancer stem cells (CSCs) reside in a supportive niche, constituting a microenvironment comprised of adjacent stromal cells, vessels, and extracellular ...

Afsløring af inflammatorisk gigt: Udforskning af funktioner af synovialceller

Isolation and Culture of Primary Synovial Macrophages and Fibroblasts from Murine Arthritis Tissue

Forfatter Spotlight: Isolering og dyrkning af primære synoviale makrofager og fibroblaster fra musegigtvæv  

Isolering og dyrkning af primære synoviale makrofager og fibroblaster fra murine arthritisvæv

Rheumatoid arthritis is an autoimmune disease that leads to chronic inflammation of joints. Synovial macrophages and synovial fibroblasts have central ...