Name: bovine ovarian cortex tissue culture
Uploaded: 2021-01-14T14:00:00
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Questa ricerca è stata supportata dal National Institute of Food and Agriculture 2013-67015-20965 ad ASC, University of Nebraska Food for Health Competitive Grants to ASC. United States Department of Agriculture Hatch grant NEB26-202/W3112 Accession #1011127 to ASC, Hatch–NEB ANHL Accession #1002234 to ASC. Quantitative Life Sciences Initiative Summer Postdoctoral Scholar Support - Premio COVID-19 per i finanziamenti estivi per CMS.
Gli autori vorrebbero estendere il loro apprezzamento al Dr. Robert Cushman, U.S. Meat Animal Research Center, Clay Center, NE per ringraziarlo per aver fornito le ovaie in una precedente pubblicazione, che sono state poi utilizzate nell'attuale articolo come prova di concetto nella convalida di questa tecnica.

Le ovaie sono state ottenute dal Centro di ricerca sugli animali da carne degli Stati Uniti16. Come affermato in precedenza16,tutte le procedure sono state approvate dal Comitato per la cura e l'uso degli animali del Centro di ricerca sugli animali da carne degli Stati Uniti (USMARC) in conformità con la guida per la cura e l'uso degli animali agricoli nella ricerca e nell'insegnamento agricolo. Le ovaie sono state portate al laboratorio riproduttivo dell'Università del N...

Il vantaggio della coltura in vitro della corteccia ovarica, come descritto in questo manoscritto, è che i follicoli si sviluppano in un ambiente normalizzato con stroma adiacente che circonda i follicoli. Le cellule somatiche e gli ovociti rimangono intatti e vi è un'appropriata comunicazione cellula-cellula come modello in vivo. Il nostro laboratorio ha scoperto che un sistema di coltura a 7 giorni fornisce dati rappresentativi di follicologenesi e steroidogenesi per il trattamento della corteccia ovarica. Altri prot...

La corteccia ovarica rappresenta lo strato esterno dell'ovaio in cui si verifica lo sviluppo del follicolo1. I follicoli primordiali, inizialmente arrestati nello sviluppo, saranno attivati per diventare follicoli primari, secondari e quindi antrali o terziari basati su input paracrini e gonadotropine1,2,3,4. Per comprendere meglio i processi fisiologici all'interno dell'ovaio, la coltura tissutale può essere utilizzata come modello in vitro, consentendo così un ambiente controllato per condurre esperimenti. Molti studi hanno utilizzato la coltura del tessuto ovarico per la ricerca nella tecnologia di riproduzione assistita, nella conservazione della fertilità e nel cancro ovarico5,6,7. La coltura del tessuto ovarico è servita anche come modello per studiare le tossine riproduttive che danneggiano la salute ovarica e l'eziologia di disturbi riproduttivi come la sindrome dell'ovaio policistico (PCOS)8,9,10,11. Pertanto, questo sistema di cultura è applicabile a una vasta gamma di specialità.
Nei roditori, gonadi fetali o perinatali intere sono state utilizzate negli esperimenti di biologia riproduttiva12,13,14,15. Tuttavia, le gonadi di bestiame domestico più grande non possono essere coltivate come organi interi a causa delle loro grandi dimensioni e della potenziale degenerazione. Pertanto, la corteccia ovarica dei primati bovini e non umani viene tagliata in pezzi più piccoli16,17,18. Molti studi hanno coltivato piccoli pezzi di corteccia ovarica per studiare vari fattori di crescita nell'iniziazione del follicolo primordiale nel bestiame domestico e nei primati non umani1,17,18,19. L'uso della coltura della corteccia ovarica ha anche dimostrato l'inizio del follicolo primordiale in assenza di siero per pezzi corticali bovini e primati coltivati per 7 giorni20. Yang e Fortune nel 2006 hanno trattato il terreno di coltura della corteccia ovarica fetale con una gamma di dosi di testosterone nell'arco di 10 giorni e hanno osservato che la concentrazione di10-7 M di testosterone aumentava il reclutamento del follicolo, la sopravvivenza e l'aumento della progressione dei follicoli in fase iniziale19. Nel 2007, utilizzando colture di corteccia ovarica da feti bovini (5-8 mesi di gestazione), Yang e Fortune hanno riportato un ruolo per il fattore di crescita endoteliale vascolare A (VEGFA) nella transizione del follicolo primario-secondario21. Inoltre, il nostro laboratorio ha utilizzato colture di corteccia ovarica per dimostrare come le isoforme VEGFA (angiogeniche, antiangiogeniche e una combinazione) possono regolare diverse vie di trasduzione del segnale attraverso il recettore del dominio chinasico (KDR), che è il principale recettore di trasduzione del segnale che VEGFA lega16. Queste informazioni hanno permesso una migliore comprensione di come le diverse isoforme di VEGFA influenzano le vie di segnalazione per provocare la progressione o l'arresto del follicolo. Nel loro insieme, la coltura di pezzi di corteccia ovarica in vitro con diversi steroidi o fattori di crescita può essere un saggio prezioso per determinare gli effetti sui meccanismi che regolano la follicologenesi. Allo stesso modo, gli animali che si sviluppano su diversi regimi nutrizionali possono avere microambienti ovarici alterati, che possono promuovere o inibire la follicologenesi che influenza la maturità riproduttiva femminile. Pertanto, il nostro obiettivo nel manoscritto attuale è quello di riportare la tecnica di coltura della corteccia bovina e determinare se ci sono differenze nei microambienti ovarici dopo la coltura in vitro della corteccia bovina da giovenche alimentate con diete di controllo o Stair-Step raccolte a 13 mesi di età come descritto in precedenza16.
Pertanto, il nostro passo successivo è stato quello di determinare il microambiente ovarico in queste giovenche che sono state sviluppate con diverse diete nutrizionali. Abbiamo valutato la corteccia ovarica da giovenche alimentate con una dieta Stair-Step o Control. Alle giovenche di controllo è stata offerta una dieta di mantenimento di 97,9 g / kg0,75 per 84 giorni. La dieta Stair-Step è stata iniziata a 8 mesi contenente una dieta ristretta di 67,4 g / kg0,75 per 84 giorni. Dopo i primi 84 giorni, mentre le giovenche di controllo hanno continuato a ricevere 97,9 g/kg0,75,alle giovenche di manzo Stair-Step sono stati offerti 118,9 g/kg0,75 per altri 68 giorni, dopo di che sono state ovariectomizzate a 13 mesi di età16 anni per studiare i cambiamenti negli stadi follicolari e nella morfologia prima e dopo la coltura. Abbiamo anche analizzato le differenze in steroidi, metaboliti steroidei, chemochine e citochine secrete nei mezzi della corteccia. Gli steroidi e altri metaboliti sono stati misurati per determinare se ci fossero effetti diretti dai trattamenti condotti in vivo e/o in vitro sulla vitalità e la produttività dei tessuti. I cambiamenti nel microambiente ovarico prima e dopo la coltura hanno fornito un'istantanea dell'ambiente endocrino e della follicologenesi prima della coltura e di come la coltura o il trattamento durante la coltura influisce sulla progressione o sull'arresto del follicolo.
Le ovaie sono state raccolte dopo che le ovariectomie sono state eseguite presso il Meat Animal Research Center (USMARC) degli Stati Uniti secondo le loro procedure IACUC dalle giovenche control e stair-step a 13 mesi di età16anni, pulite con lavaggi sterili di soluzione salina tampone fosfato (PBS) con antibiotico allo 0,1% per rimuovere sangue e altri contaminanti, tagliato il tessuto in eccesso e trasportato al laboratorio di fisiologia riproduttiva UNL dell'Università del Nebraska-Lincoln (UNL) a 37 ° C23 . All'UNL, i pezzi della corteccia ovarica sono stati tagliati in piccoli pezzi quadrati (~ 0,5-1 mm3; Figura 1) e coltivato per 7 giorni (Figura 2). L'istologia è stata condotta sui vetrini di coltura della corteccia prima e dopo la coltura per determinare gli stadi follicoli16,24 (Figura 3 e Figura 4)e le proteine della matrice extracellulare che possono indicare la fibrosi (Picro-Sirus Red, PSR; Figura 5). Ciò ha permesso la determinazione dell'effetto dei regimi nutrizionali in vivo sugli stadi follicolari e ha permesso il confronto di 7 giorni di corteccia ovarica sugli stadi follicolari e sulla progressione del follicolo. Durante tutta la coltura, il mezzo è stato raccolto e cambiato ogni giorno (circa il 70% dei media è stato raccolto ogni giorno; 250 μL / bene) in modo che gli ormoni giornalieri / citochine / chemochine possano essere valutati o raggruppati su giorni per ottenere concentrazioni medie. Gli steroidi come l'androstenedione (A4) e l'estrogeno (E2) possono essere raggruppati nell'arco di 3 giorni e valutati attraverso il test radioimmunologico (RIA; Figura 6) e raggruppati nell'arco di 4 giorni per animale e analizzati tramite cromatografia liquida ad alte prestazioni-spettrometria di massa (HPLC-MS)24,25 (Tabella 1). Gli array di citochine sono stati utilizzati per valutare le concentrazioni di citochine e chemochine nel terreno di coltura della corteccia ovarica26 (Tabella 2). Le piastre di analisi della reazione a catena della polimerasi in tempo reale (RT-PCR) sono state condotte per determinare l'espressione genica per specifiche vie di trasduzione del segnale, come dimostrato in precedenza16. Tutti gli steroidi, le citochine, lo stadio follicolare e i marcatori istologici forniscono un'istantanea del microambiente ovarico e indizi sulla capacità di quel microambiente di promuovere la follicologenesi "normale" o "anormale".

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>#11 Scapel Blade</td>
			<td>Swann-Morton&#160;</td>
			<td>303</td>
			<td>Scaple Blade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>#21 Scapel Blade</td>
			<td>Swann-Morton&#160;</td>
			<td>307</td>
			<td>Scaple Blade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>500mL Bottle Top Filter</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430514</td>
			<td>Bottle Top Filter 0.22 &#181;m pore for filtering medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AbsoluteIDQ Sterol17 Assay</td>
			<td>Biocrates</td>
			<td>Sterol17 Kit</td>
			<td>Samples are sent off to Biocrates and steroid panels are run and results are returned&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Androstenedione Double Antibody RIA Kit</td>
			<td>MPBio</td>
			<td>7109202</td>
			<td>RIA to determine androstenedione from culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Belgium A4 Assay Kit&#160;</td>
			<td>DIA Source&#160;</td>
			<td>KIP0451</td>
			<td>RIA to determine androstenedione from culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Cytokine Array Q3</td>
			<td>RayBiotech</td>
			<td>QAB-CYT-3-1</td>
			<td>Cytokine kit to determine cytokines from culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cellSens Software Standard 1.3</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>7790</td>
			<td>Imaging Software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin-Transferrin-Selenium-X</td>
			<td>Gibco ThermoFisher Scientific</td>
			<td>5150056</td>
			<td>Addative to the culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leibovitz&#39;s L-15 Medium</td>
			<td>Gibco ThermoFisher Scientific</td>
			<td>4130039</td>
			<td>Used for tissue washing on clean bench, and in the biosafety cabniet&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope&#160;</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>SZX16</td>
			<td>Disection microscope used for imaging tissue culture pieces&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Camera&#160;</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>DP71</td>
			<td>Microscope cameraused for imaging tissue culture pieces&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Millicell Cell Culture Inserts 0.4&#181;m, 12,mm Diameter</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>PICM01250</td>
			<td>Inserts that allow the tissue to rest against the medium without being submerged in it</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multiwell 24 well plate</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353047</td>
			<td>Plate used to hold meduim, inserts, and tissues</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish 60 x 15 mm</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>351007</td>
			<td>Petri dish used for washing steps prior to culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-Buffered Saline (PBS 1X)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>21-040-CV</td>
			<td>Used for tissue washing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SAS Version 9.3</td>
			<td>SAS Institute&#160;</td>
			<td>9.3 TS1M2</td>
			<td>Statistical analysis software&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thomas Stadie-Riggs Tissue Slicer</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td>6727C10</td>
			<td>Tissue slicer for preperation of thin uniform sections of fresh tissue</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Waymouth MB 752/1 Medium</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>W1625</td>
			<td>Medium used for tissue cultures</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

bovine ovarian cortex tissue culture

Lo sviluppo del follicolo dallo stadio primordiale a quello antrale è un processo dinamico all'interno della corteccia ovarica, che include fattori endocrini e paracrini da cellule somatiche e comunicazione cellula-ovocita cumulo. Poco si sa sul microambiente ovarico e su come le citochine e gli steroidi prodotti nell'ambiente circostante influenzino la progressione o l'arresto del follicolo. La coltura in vitro della corteccia ovarica consente ai follicoli di svilupparsi in un ambiente normalizzato che rimane supportato da stroma adiacente. Il nostro obiettivo era determinare l'effetto della dieta nutrizionale Stair-Step sul microambiente ovarico (sviluppo follicolare, produzione di steroidi e citochine) attraverso la coltura in vitro della corteccia ovarica bovina. Per raggiungere questo obiettivo, i pezzi corticali ovarici sono stati rimossi dalle giovenche sottoposte a due diversi schemi nutrizionalmente sviluppati prima della pubertà: Control (sviluppo nutrizionale tradizionale) e Stair-Step (alimentazione e restrizione durante lo sviluppo) che sono stati tagliati in circa 0,5-1 mm3 pezzi. Questi pezzi sono stati successivamente passati attraverso una serie di lavaggi e posizionati su un inserto di coltura tissutale che è incastonato in un pozzo contenente il terreno di coltura di Waymouth. La corteccia ovarica è stata coltivata per 7 giorni con cambiamenti quotidiani dei terreni di coltura. Il sezionamento istologico è stato eseguito per determinare i cambiamenti dello stadio follicolare prima e dopo la coltura per determinare gli effetti della nutrizione e l'impatto della coltura senza ulteriori trattamenti. Il terreno di coltura della corteccia è stato raggruppato per giorni per misurare steroidi, metaboliti steroidei e citochine. C'erano tendenze per l'aumento degli ormoni steroidei nel microambiente ovarico che ha permesso la progressione del follicolo nelle colture di corteccia ovarica Stair-Step versus Control. La tecnica di coltura della corteccia ovarica consente una migliore comprensione del microambiente ovarico e di come le alterazioni della secrezione endocrina possono influenzare la progressione e la crescita del follicolo da trattamenti sia in vivo che in vitro. Questo metodo di coltura può anche rivelarsi utile per testare potenziali terapie che possono migliorare la progressione del follicolo nelle donne per promuovere la fertilità.

Questa procedura di coltura della corteccia bovina può essere utilizzata per determinare un'ampia varietà di dati ormonali, citochine e istologici da piccoli pezzi dell'ovaio. La colorazione, come l'ematossilina e l'eosina (H & E), può essere utilizzata per determinare la morfologia ovarica attraverso la stadiazione del follicolo16,23,31 ( Figura3). In breve, i follicoli sono stati classificati c...

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Bovine Ovarian Cortex Tissue Culture

Viene presentata la coltura in vitro della corteccia ovarica bovina e l'effetto della dieta nutrizionale a gradini sul microambiente ovarico. I pezzi di corteccia ovarica sono stati coltivati per sette giorni e sono stati valutati steroidi, citochine e stadi follicolari. Il trattamento dietetico Stair-Step aveva aumentato la steroidogenesi con conseguente progressione del follicolo in coltura.

Coltura tissutale della corteccia ovarica bovina

Follicle development from the primordial to antral stage is a dynamic process within the ovarian cortex, which includes endocrine and paracrine factors ...

Questo protocollo consente un esame in vitro approfondito del microambiente ovarico. Consentire agli utenti di determinare la crescita e lo sviluppo del follicolo, nonché la steroidogenesi e l'abbondanza di molecole immunitarie. Un vantaggio di questa tecnica è la capacità di valutare direttamente i cambiamenti nel microambiente ovarico e nei follicoli emergenti e valutare l'interazione unica causata dall'aggiunta di ormoni specifici.Questa tecnica può essere utilizzata per studiare una varietà di disturbi riproduttivi che causano arresti follicolari. Ad esempio, sindrome dell'ovaio policistico. Dal momento che possiamo valutare direttamente il microambiente ovarico in vitro, a dimostrare la procedura sarà Brooke Bell, una ricercatrice universitaria del mio laboratorio.Usando una pinza mascellare cerata, fissare l'ovaio, tagliare a metà e iniziare a rimuovere le fette esterne. Garantire che non più di uno o due millimetri di profondità della superficie venga tagliato lontano dall'ovaio in modo che non venga raccolto alcun midollo. Tagliare tre o quattro strisce sottili della corteccia ovarica con un bisturi e posizionare le strisce nella terza capsula di Petri piena di PBS.Tagliare le strisce in piccoli pezzi quadrati da 0,5 a un millimetro cubo con una lama di bisturi. Utilizzare un righello sotto le piastre di Petri per assicurarsi che i pezzi siano di dimensioni e spessore simili per creare pezzi di corteccia ovarica coerenti. Lavare i pezzi corticali ovarici in tutte e tre le piastre di Petri PBS e campo antibiotico, usando pinze a punta curva per spostare i pezzi tra i lavaggi.Sposta i pezzi della corteccia attraverso la serie di lavaggi LB-15 e posizionali in una piastra di Petri finale piena di LB-15. Etichettare il coperchio con l'ID animale e il lato ovarico. Raccogli quattro pezzi di corteccia ovarica per ovaio e fissali per l'istologia del giorno zero e congela pezzi aggiuntivi per la purificazione dell'RNA.Utilizzare i restanti pezzi di tessuto per la coltura. Preparare un armadio di sicurezza biologica per un lavaggio finale dei tessuti e la preparazione della coltura. Disinfettare le forniture con il 70% di etanolo prima di metterle nell'armadio di sicurezza biologica.Spostare tutti i pezzi della corteccia ovarica destinati alla coltura nell'armadio di sicurezza biologica e lavarli ancora una volta in una capsula di Petri piena di LB-15. Pipettare 350 microlitri di Waymouth medium per pozzo in una piastra di coltura tissutale a 24 pozzetti. Posizionare gli inserti del pozzo di coltura non rivestiti in ogni pozzetto usando una pinza assicurandosi che non si formino bolle sotto la base dell'inserto.Posizionare con cura e delicatezza quattro pezzi di corteccia ovarica sulla rete di ciascun inserto senza forare la rete. Incubare il tessuto a 37 gradi Celsius con il 5% di anidride carbonica. Cambiare la coltura della corteccia ovarica media ogni giorno per sette giorni assicurandosi di utilizzare il mezzo Waymouth preriscaldato.Durante i cambi di mezzo, utilizzare una pinza per sollevare delicatamente l'inserto dal pozzo e raccogliere il mezzo Waymouth coltivato in tubi da 0,5 millilitri. Riposizionare l'inserto nel pozzetto e aggiungere 350 microlitri di terreno di coltura fresco erogandolo tra il lato dell'inserto e il pozzetto. Conservare il mezzo raccolto dalla coltura tissutale a meno 20 gradi Celsius.Dopo sette giorni di coltura, immagina i pezzi della corteccia ovarica usando un microscopio di dissezione con una fotocamera collegata e un programma software di imaging per computer. Fissare due pezzi di corteccia ovarica per pozzetto nella soluzione di Bouin per l'istologia e il congelamento flash ai pezzi di corteccia ovarica in azoto liquido per ottenere RNA per cDNA. Ripeti questo passaggio per tutti i pozzetti con il tessuto, quindi raccogli il mezzo dal settimo giorno e conservalo meno 20 gradi.Lasciare che i pezzi della corteccia ovarica rimangano immersi nella soluzione di Bouin per circa 1,5 ore, quindi lavarli con etanolo al 70% tre volte, mantenere il tessuto in etanolo al 70% e pulirlo ogni giorno fino a quando la soluzione non è più gialla. La colorazione di ematossilina ed eosina è stata eseguita per follicoli primordiali, follicoli primari precoci, follicolo primario, follicolo secondario e follicolo antrale. La stadiazione del follicolo è stata condotta su una corteccia ovarica fissata prima e dopo la coltura per valutare la follicologenesi.La differenza nella morfologia determinata dalla deposizione di collagene può indicare fibrosi nella corteccia ovarica da gradini o giovenche di controllo. Un confronto dell'area media della colorazione rossa positiva di picrosirius per corteccia ovarica riempita tra le giovenche di controllo e le giovenche a gradini è mostrato qui. La raccolta giornaliera del terreno di coltura è stata raggruppata in tre giorni per valutare la produzione di vari ormoni steroidei, utilizzando un test radioimmunologico.I metaboliti steroidei e la produzione di citochine sono stati misurati anche nel terreno di coltura della corteccia ovarica da un pozzetto per ogni animale raggruppato in quattro giorni di coltura. Più a lungo il tessuto si siede, più difficile può essere lavorare. Potrebbe essere necessario praticare tagli precisi.Questa tecnica viene utilizzata per comprendere gli effetti sulle vie di trasduzione del segnale per salvare l'eccesso di steroidogenesi per determinare gli effetti degli steroidi in eccesso sulla produzione di citochine e chemochine e per determinare gli effetti sulla progressione o l'arresto del follicolo all'interno del tessuto ovarico.

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