Name: bovine ovarian cortex tissue culture
Uploaded: 2021-01-14T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Bovine Ovarian Cortex Tissue Culture at JoVE.com

Denne forskningen ble støttet av National Institute of Food and Agriculture 2013-67015-20965 til ASC, University of Nebraska Food for Health Competitive Grants til ASC. UsAs landbruksdepartement Hatch grant NEB26-202/W3112 Tiltredelse #1011127 til ASC, Hatch-NEB ANHL Tiltredelse #1002234 til ASC. Quantitative Life Sciences Initiative Summer Postdoctoral Scholar Support – COVID-19 Award for sommerfinansiering for CMS.
Forfatterne ønsker å utvide sin takknemlighet til Dr. Robert Cushman, U.S. Meat Animal Research Center, Clay Center, NE for å takke ham for å ha gitt eggstokkene i en tidligere publikasjon, som deretter ble brukt i den nåværende artikkelen som et konseptbevis for å validere denne teknikken.

Eggstokkene ble hentet fra U. S. Meat Animal Research Center16. Som nevnt tidligere16, ble alle prosedyrer godkjent av U.S. Meat Animal Research Center (USMARC) Animal Care and Use Committee i samsvar med guiden for omsorg og bruk av landbruksdyr i landbruksforskning og undervisning. Eggstokkene ble brakt til University of Nebraska-Lincoln Reproduktive Laboratory hvor de ble behandlet og dyrket.
1. Utarbeidelse av nødvendige medier
<ol><li>
<s...

Fordelen med in vitro ovariebarkkultur, som beskrevet i dette manuskriptet, er at folliklene utvikler seg i et normalisert miljø med tilstøtende stroma rundt folliklene. De somatiske cellene og oocytten forblir intakte, og det er passende celle-til-celle-kommunikasjon som en in vivo-modell. Vårt laboratorium har funnet ut at et 7-dagers kultursystem gir representativ folliculogenesis og steroidogenese data for behandling av ovarial cortex. Andre ovarievevskulturprotokoller har enten relativt korte kulturperioder 1-6 d...

Ovariebarken representerer det ytre laget av eggstokken der follikkelutviklingen skjer1. Primordial follikler, opprinnelig arrestert i utvikling, vil bli aktivert til å bli primære, sekundære, og deretter antral eller tertiære follikler basert på parakrine og gonadotropin innganger1,2,3,4. For bedre å forstå fysiologiske prosesser innen eggstokken, kan vevskultur brukes som en in vitro-modell, og dermed tillate et kontrollert miljø å utføre eksperimenter. Mange studier har brukt eggstokkvev kultur for forskning i assistert reproduktiv teknologi, fruktbarhet bevaring, og ovariekreft5,6,7. Ovarievevskultur har også fungert som en modell for å undersøke reproduktive giftstoffer som skader eggstokkhelsen og etiologien til reproduktive lidelser som Polycystic Ovary Syndrome (PCOS)8,9,10,11. Dermed gjelder dette kultursystemet for et bredt spekter av spesialiteter.
Hos gnagere har hele foster- eller perinatale gonader blitt brukt i reproduktive biologiforsøk12,13,14,15. Imidlertid kan gonader fra større husdyr ikke dyrkes som hele organer på grunn av deres store størrelse og potensielle degenerasjon. Derfor er bovin og ikke-menneskelig primat ovarial cortex kuttet i mindre stykker16,17,18. Mange studier har dyrket små ovariebarkstykker for å studere ulike vekstfaktorer i primordial follikkelinitiering i husdyr og ikke-menneskelige primater1,17,18,19. Bruken av ovarial cortex kultur har også vist primordial follikkel initiering i fravær av serum for storfe og primat kortikale stykker dyrket i 7 dager20. Yang og Fortune i 2006 behandlet foster ovariebark kultur medium med en rekke testosteron doser over 10 dager og observert at10-7 M konsentrasjonen av testosteron økt follikkel rekruttering, overlevelse, og økt progresjon av tidlig stadium follikler19. I 2007 rapporterte Yang og Fortune en rolle for Vaskulær endotel vekstfaktor A (VEGFA) i primær til sekundær follikkelovergang21. Videre har laboratoriet vårt brukt ovariebarkkulturer for å demonstrere hvordan VEGFA-isoformer (angiogene, antiangiogene og en kombinasjon) kan regulere forskjellige signaltransduksjonsveier gjennom Kinase-domenereseptoren (KDR), som er hovedsignaltransduksjonsreseptoren som VEGFA binder16. Denne informasjonen ga en bedre forståelse av hvordan ulike VEGFA-isoformer påvirker signalveier for å fremkalle follikkelprogresjon eller arrestasjon. Samlet sett kan culturing av ovariebarkstykker in vitro med forskjellige steroider eller vekstfaktorer være en verdifull analyse for å bestemme effekter på mekanismer som regulerer folliculogenesis. På samme måte kan dyr som er utviklet på forskjellige ernæringsregimer ha endret eggstokkmikromiljøet, noe som kan fremme eller hemme folliculogenesis som påvirker kvinnelig reproduktiv modenhet. Dermed er vårt mål i det nåværende manuskriptet å rapportere bovin cortex-kulturteknikken og avgjøre om det er forskjeller i eggstokkmikromiljøet etter in vitrokultur av bovin cortex fra kvier matet enten Kontroll eller Trappetrinn dietter samlet inn ved 13 måneders alder som beskrevet tidligere16.
Derfor var vårt neste trinn å bestemme eggstokkmikromiljøet i disse kvier som ble utviklet med forskjellige ernæringsmessige dietter. Vi evaluerte ovariebark fra kvier matet med enten et trappetrinn eller kontrolldiett. Kontroller kvier ble tilbudt en vedlikeholdsdiett på 97,9 g/kg0,75 i 84 dager. Trappetrinn dietten ble initiert på 8 måneder som inneholder et begrenset matet kosthold på 67,4 g / kg0,75 i 84 dager. Etter de første 84 dagene, mens kontroll kvier fortsatte å motta 97.9 g/kg0.75, trappetrinnet biff kvier ble tilbudt 118.9 g/kg0.75 for ytterligere 68 dager, hvoretter de ble ovariectomized på 13 måneder avalder 16 for å studere endringer i follikulære stadier og morphology før og etter kultur. Vi også analysert for forskjeller i steroider, steroid metabolitter, kjemokiner, og cytokiner utskilt i cortex media. Steroider og andre metabolitter ble målt for å avgjøre om det var noen direkte effekter fra behandlinger utført in vivo og / eller in vitro på vev levedyktighet og produktivitet. Endringer i eggstokkmikromiljøet før og etter kultur ga et øyeblikksbilde av det endokrine miljøet og folliculogenesis før kultur og hvordan kultur eller behandling under kultur påvirker follikkelprogresjon eller arrestasjon.
Eggstokkene ble samlet inn etter at ovariectomies ble utført ved U.S. Meat Animal Research Center (USMARC) i henhold til deres IACUC-prosedyrer fra kontroll- og trappetrinns kvier ved 13 måneders alderav 16, rengjort med steril fosfatbuffersalin (PBS) vasker med 0,1% antibiotika for å fjerne blod og andre forurensninger, trimmet overflødig vev, og transportert til University of Nebraska-Lincoln (UNL) Reproduktiv fysiologi laboratorium UNL ved 37°C23 . Ved UNL ble eggstokk cortex stykker kuttet i små firkantede stykker (~ 0,5-1 mm3; Figur 1) og dyrket i 7 dager (figur 2). Histologi ble utført på cortex kultur lysbilder før og etter kultur for å bestemme follikler stadier16,24 (Figur 3 og Figur 4), og ekstracellulære matrise proteiner som kan indikere fibrose (Picro-Sirus Red, PSR; Figur 5). Dette tillot bestemmelse av effekt av in vivo ernæringsregimer på follikkel stadier og tillot sammenligning av 7 dager med ovarial cortex på follikkel stadier og follikkel progresjon. Gjennom hele kulturen ble mediet samlet inn og endret daglig (ca. 70% av mediene ble samlet hver dag; 250 μL / brønn) slik at enten daglige hormoner / cytokiner / kjemokiner kan vurderes eller samles over dager for å oppnå gjennomsnittlige konsentrasjoner. Steroider som androstenedione (A4) og østrogen (E2) kan samles over 3 dager og vurderes gjennom radioimmunoassay (RIA; Figur 6) og samlet over 4 dager per dyr og analysert via høyytelses væskekromatografi-massespektrometri (HPLC-MS)24,25 ( tabell1). Cytokinkjeder ble brukt til å vurdere cytokin- og kjemokinkonsentrasjoner i ovarial cortexkultur middels26 (tabell 2). Sanntids polymerasekjedereaksjon (RT-PCR) analyseplater ble utført for å bestemme genuttrykk for spesifikke signaltransduksjonsveier som vist tidligere16. Alle steroid, cytokin, follikkel stadium og histologiske markører gir et øyeblikksbilde av ovarie mikromiljøet og ledetråder om evnen til at mikromiljøet for å fremme "normal" eller "unormal" folliculogenesis.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>#11 Scapel Blade</td>
			<td>Swann-Morton&#160;</td>
			<td>303</td>
			<td>Scaple Blade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>#21 Scapel Blade</td>
			<td>Swann-Morton&#160;</td>
			<td>307</td>
			<td>Scaple Blade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>500mL Bottle Top Filter</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430514</td>
			<td>Bottle Top Filter 0.22 &#181;m pore for filtering medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AbsoluteIDQ Sterol17 Assay</td>
			<td>Biocrates</td>
			<td>Sterol17 Kit</td>
			<td>Samples are sent off to Biocrates and steroid panels are run and results are returned&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Androstenedione Double Antibody RIA Kit</td>
			<td>MPBio</td>
			<td>7109202</td>
			<td>RIA to determine androstenedione from culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Belgium A4 Assay Kit&#160;</td>
			<td>DIA Source&#160;</td>
			<td>KIP0451</td>
			<td>RIA to determine androstenedione from culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Cytokine Array Q3</td>
			<td>RayBiotech</td>
			<td>QAB-CYT-3-1</td>
			<td>Cytokine kit to determine cytokines from culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cellSens Software Standard 1.3</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>7790</td>
			<td>Imaging Software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin-Transferrin-Selenium-X</td>
			<td>Gibco ThermoFisher Scientific</td>
			<td>5150056</td>
			<td>Addative to the culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leibovitz&#39;s L-15 Medium</td>
			<td>Gibco ThermoFisher Scientific</td>
			<td>4130039</td>
			<td>Used for tissue washing on clean bench, and in the biosafety cabniet&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope&#160;</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>SZX16</td>
			<td>Disection microscope used for imaging tissue culture pieces&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Camera&#160;</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>DP71</td>
			<td>Microscope cameraused for imaging tissue culture pieces&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Millicell Cell Culture Inserts 0.4&#181;m, 12,mm Diameter</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>PICM01250</td>
			<td>Inserts that allow the tissue to rest against the medium without being submerged in it</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multiwell 24 well plate</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353047</td>
			<td>Plate used to hold meduim, inserts, and tissues</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish 60 x 15 mm</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>351007</td>
			<td>Petri dish used for washing steps prior to culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-Buffered Saline (PBS 1X)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>21-040-CV</td>
			<td>Used for tissue washing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SAS Version 9.3</td>
			<td>SAS Institute&#160;</td>
			<td>9.3 TS1M2</td>
			<td>Statistical analysis software&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thomas Stadie-Riggs Tissue Slicer</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td>6727C10</td>
			<td>Tissue slicer for preperation of thin uniform sections of fresh tissue</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Waymouth MB 752/1 Medium</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>W1625</td>
			<td>Medium used for tissue cultures</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

bovine ovarian cortex tissue culture

Follikkelutvikling fra primordial til antral stadium er en dynamisk prosess innen ovarial cortex, som inkluderer endokrine og parakriminelle faktorer fra somatiske celler og cumulus celle-oocytt kommunikasjon. Lite er kjent om ovariemikromiljøet og hvordan cytokiner og steroider produsert i det omkringliggende miljøet påvirker follikkelprogresjonen eller arrestasjonen. In vitro kultur av ovarial cortex gjør det mulig for follikler å utvikle seg i et normalisert miljø som forblir støttet av tilstøtende stroma. Vårt mål var å bestemme effekten av ernæringsmessig Trappetrinn diett på ovarie mikromiljøet (follikkel utvikling, steroid, og cytokin produksjon) gjennom in vitro kultur av bovine ovarial cortex. For å oppnå dette ble eggstokkkortikale stykker fjernet fra kvier som gjennomgår to forskjellige ernæringsmessig utviklede ordninger før puberteten: Kontroll (tradisjonell ernæringsutvikling) og Trappetrinn (fôring og begrensning under utvikling) som ble kuttet i ca. 0,5-1 mm3 stykker. Disse stykkene ble deretter passert gjennom en rekke vasker og plassert på en vevskulturinnsats som er satt inn i et godt inneholdende Waymouths kulturmedium. Ovariebark ble dyrket i 7 dager med daglige kulturmedieendringer. Histologisk seksjonering ble utført for å bestemme follikkelstadiumendringer før og etter kulturen for å bestemme effekter av ernæring og påvirkning av kultur uten ytterligere behandling. Cortex kultur medium ble samlet over dager for å måle steroider, steroid metabolitter, og cytokiner. Det var tendenser for økte steroidhormoner i ovariemikromiljøet som tillot follikkelprogresjon i Trappetrinnet versus Kontroll ovarian cortex kulturer. Ovariebarkkulturteknikken gir en bedre forståelse av eggstokkmikromiljøet, og hvordan endringer i endokrine sekresjon kan påvirke follikkelprogresjonen og veksten fra både in vivo- og in vitro-behandlinger. Denne kulturmetoden kan også være gunstig for å teste potensielle terapeutiske behandlinger som kan forbedre follikkelprogresjonen hos kvinner for å fremme fruktbarhet.

Denne bovine cortex kulturprosedyren kan brukes til å bestemme et bredt utvalg av hormon-, cytokin- og histologidata fra små biter av eggstokken. Farging, som hematoksylin og eosin (H&E), kan brukes til å bestemme ovariemorfologi gjennom follikkeloppsamling16,23,31 ( figur3). Kort sagt ble follikler klassifisert som primordial, som er en oocytt omgitt av et enkelt lag av squamous pre-granulosa ce...

Watch this Scientific Journal Video about Bovine Ovarian Cortex Tissue Culture at JoVE.com

Bovine Ovarian Cortex Tissue Culture

In vitro kultur av bovine ovarial cortex og effekten av ernæringsmessig Trappetrinn diett på ovarie mikromiljø presenteres. Ovariebarkstykker ble dyrket i syv dager, og steroider, cytokiner og follikkelstadier ble evaluert. Trappetrinnet diett behandling hadde økt steroidogenese resulterer i follikkel progresjon i kulturen.

Bovine Ovarie Cortex Vev Kultur

Follicle development from the primordial to antral stage is a dynamic process within the ovarian cortex, which includes endocrine and paracrine factors ...

Denne protokollen tillater en in vitro i dybdeundersøkelse av ovariemikromiljøet. Gjør det mulig for brukere å bestemme follikkel vekst og utvikling, samt steroidogenese og overflod av immunmolekyler. En fordel med denne teknikken er evnen til å direkte evaluere endringer i ovariemikromiljøet og nye follikler og vurdere det unike samspillet forårsaket av tilsetning av spesifikke hormoner.Denne teknikken kan brukes til å studere en rekke reproduktive lidelser som forårsaker follikulære arrestasjoner. For eksempel polycystisk ovariesyndrom. Siden vi direkte kan evaluere ovariemikromiljøet in vitro, vil det å demonstrere prosedyren være Brooke Bell, en bachelorforsker fra laboratoriet mitt.Bruk cerated kjeve tang, sikre eggstokken, skjær i halvparten, og begynn å fjerne utvendige skiver. Sørg for at ikke mer enn en til to millimeter dybde av overflaten er kuttet bort fra eggstokken slik at ingen medulla samles. Klipp tre til fire tynne strimler av ovariebarken med en skalpell og legg strimlene i den tredje PBS-fylte Petri-parabolen.Klipp strimlene i små firkantede stykker på 0,5 til en kubikkmillimeter med et skalpellblad. Bruk en linjal under Petri-rettene for å sikre at brikkene er av lignende størrelse og tykkelse for å lage konsistente eggstokk cortex stykker. Vask eggstokkkortikale stykker i alle tre PBS og antibiotikafelt Petri retter, ved hjelp av buede spiss tang for å flytte brikkene mellom vasker.Flytt cortex stykker gjennom serien av LB-15 vasker og plassere dem i en siste LB-15-fylt Petri parabolen. Merk lokket med dyre-ID og eggstokkside. Samle fire ovarian cortex stykker per eggstokk og fikse dem for dag null histologi og fryse ekstra stykker for RNA rensing.Bruk de resterende vevstykkene til kultur. Forbered et biologisk sikkerhetsskap for endelig vevsvask og kulturpreparat. Desinfiser forsyninger med 70% etanol før du plasserer dem i det biologiske sikkerhetsskapet.Flytt alle ovariebarkstykker beregnet på kultur til det biologiske sikkerhetsskapet og vask dem igjen i en LB-15-fylt Petri-tallerken. Pipette 350 mikroliter Waymouth medium per brønn inn i en 24 brønn vev kultur plate. Plasser ubestrøket kultur godt innlegg i hver brønn ved hjelp av tang, og sørg for at det ikke dannes bobler under bunnen av innsatsen.Plasser forsiktig og delikat fire ovariebarkstykker på nettet av hver innsats uten å punktere nettet. Inkuber vevet ved 37 grader Celsius med 5% karbondioksid. Endre ovarian cortex kultur medium daglig i syv dager, sørg for å bruke forvarmet Waymouth medium.Under de middels endringene, bruk tang for å løfte innsatsen forsiktig ut av brønnen og samle det kultiverte Waymouth-mediet i 0,5 milliliterrør. Sett innsatsen tilbake i brønnen og tilsett 350 mikroliter ferskt kulturmedium ved å dispensere den mellom siden av innsatsen og brønnen. Oppbevar det innsamlede mediet fra vevskulturen ved minus 20 grader Celsius.Etter syv dager med kultur, bilde ovarian cortex stykker ved hjelp av en disseksjon mikroskop med et tilkoblet kamera og en dataavbildning program. Fest to ovariebarkstykker per brønn i Bouins løsning for histologi og blitsfrysing til ovariebarkstykker i flytende nitrogen for å oppnå RNA for cDNA. Gjenta dette trinnet for alle brønnene med vev, samle deretter mediet fra dag syv og lagret det minus 20 grader.La eggstokk cortex-brikkene forbli nedsenket i Bouins løsning i ca. 1,5 timer, vask dem deretter med 70% etanol tre ganger, hold vevet i 70% etanol og fjern det daglig til løsningen ikke lenger er gul. Hematoksylin og eosinflekk ble utført for primordiale follikler, tidlige primære follikler, primær follikkel, sekundær follikkel og antral follikkel. Follikkeloppsamling ble utført på en ovarial cortex fast før og etter kultur for å vurdere folliculogenesis.Forskjellen i morfologi som bestemt av kollagenavsetning kan indikere fibrose i ovarial cortex fra trappetrinn eller kontroll kvier. En sammenligning av det gjennomsnittlige arealet av picrosirius rød positiv farging per ovarial cortex fylt mellom kontroll og trappetrinn kvier er vist her. Daglig samling av kultur medium ble samlet over tre dager for å vurdere variert steroid hormon produksjon, ved hjelp av en radioimmunoassay.Steroid metabolitter og cytokin produksjon ble også målt i ovarial cortex kultur medium fra en brønn for hvert dyr samlet over fire dager med kultur. Jo lenger vevet sitter, jo vanskeligere kan det være å jobbe med. Du må kanskje øve på presise kutt.Denne teknikken brukes til å forstå effekten på signaltransduksjonsveier for å redde overflødig steroidogenese for å bestemme effekten av overflødige steroider på cytokin- og kjemokinproduksjon, og for å bestemme effekten på follikkelprogresjon eller arrestasjon i eggstokkvevet.

Research

JoVE Journal

Biology

Actin Co-Sedimentation Assay; for the Analysis of Protein Binding to F-Actin

The actin cytoskeleton within the cell is a network of actin filaments that allows the movement of cells and cellular processes, and that generates ...

Electrospinning Fibrous Polymer Scaffolds for Tissue Engineering and Cell Culture

As the field of tissue engineering evolves, there is a tremendous demand to produce more suitable materials and processing techniques in order to address ...

A Tissue Culture Model of Estrogen-producing Primary Bovine Granulosa Cells

En vev kultur modell av Estrogen-produserende primære bovin Granulosa celler

Ovarian granulosa cells (GC) are the major source of estradiol synthesis. Induced by the preovulatory luteinizing hormone (LH) surge, cells of the theca ...

Bovine Mammary Gland Biopsy Techniques

Storfe melkekjertlene biopsi teknikker

Bovine mammary gland biopsies allow researchers to collect tissue samples to study cell biology including gene expression, histological analysis, ...

Reproductive Techniques for Ovarian Monitoring and Control in Amphibians

Reproduktive teknikker for eggstokkene overvåking og kontroll i amfibier

Ovarian control and monitoring in amphibians require a multi-faceted approach. There are several applications that can successfully induce reproductive ...

An Ex Vivo Tissue Culture Model of Cartilage Remodeling in Bovine Knee Explants

En ex vivo tissue kultur modell av brusk remodeling i storfe kne Explants

Ex vivo culture systems cover a broad range of experiments dedicated to studying tissue and cellular function in a native setting. Cartilage is a unique ...

Tissue Collection of Bats for -Omics Analyses and Primary Cell Culture

Tissue innsamling av ball for-omics analyser og primær Cell kultur

As high-throughput sequencing technologies advance, standardized methods for high quality tissue acquisition and preservation allow for the extension of ...

Evaluating the Angiogenetic Properties of Ovarian Cancer Stem-Like Cells using the Three-Dimensional Co-Culture System, NICO-1

Evaluering av angiogenetiske egenskaper av stamceller for eggstokkreft ved hjelp av det tredimensjonale kokultursystemet, NICO-1

Cancer stem cells (CSCs) reside in a supportive niche, constituting a microenvironment comprised of adjacent stromal cells, vessels, and extracellular ...

Avduking av inflammatorisk leddgikt: Utforske funksjoner til synovialceller

Isolation and Culture of Primary Synovial Macrophages and Fibroblasts from Murine Arthritis Tissue

Forfatter Spotlight: Isolering og kultur av primære synoviale makrofager og fibroblaster fra museartrittvev  

Isolering og kultur av primære synoviale makrofager og fibroblaster fra murintartrittvev

Rheumatoid arthritis is an autoimmune disease that leads to chronic inflammation of joints. Synovial macrophages and synovial fibroblasts have central ...