Name: controlled strain of 3d hydrogels under live microscopy imaging
Uploaded: 2020-12-04T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Controlled Strain of 3D Hydrogels under Live Microscopy Imaging at JoVE.com

Некоторые фигуры, включенные здесь, были адаптированы с разрешения Центра проверки авторских прав: Springer Nature, Annals of Biomedical Engineering. Процеживание 3D-гидрогелей с однородными деформациями оси Z при одновременном создании изображений в живой микроскопии, A. Roitblat Riba, S. Natan, A. Kolel, H. Rushkin, O. Tchaicheeyan, A. Lesman, Copyright© (2019).
https://doi.org/10.1007/s10439-019-02426-7

1. Подготовка раствора (производится заранее)
<ol><li>Маркировка фибриногена ПРИМЕЧАНИЕ: Этап маркировки требуется только в том случае, если требуется анализ деформации фибринового геля. Для клеточных экспериментов можно использовать немеченый гель.<ol>
<li>Добавьте 38 мкл 10 мг/мл флуоресц?...

Способ и протокол, представленные здесь, в значительной степени основаны на нашем предыдущем исследовании Roitblat Riba et al.41 Мы включаем здесь полное автоматизированное проектирование (CAD), Python и коды микроконтроллеров устройства SCyUS.
К основным преимущества...

Реакция тканей на механические силы является неотъемлемой частью широкого спектра биологических функций, включая экспрессию генов1,дифференцировку клеток2и ремоделированиетканей 3. Кроме того, вызванные силой изменения во внеклеточном матриксе (ECM), такие как выравнивание и уплотнение волокон, могут влиять на поведение клеток и формирование тканей4,5,6. Структура волокнистой сетки ECM обладает интригующими механическими свойствами, такими как нелинейная упругость, неаффинная деформация и пластические деформации7,8,9,10,11,12. Эти свойства влияют на то, как клетки и окружающая их микросреда реагируют на внешние механические силы13,14. Понимание того, как ECM и ткани реагируют на механические силы, позволит прогрессировать в области тканевой инженерии и в разработке более точных вычислительных и теоретических моделей.
Наиболее распространенные методы механического растяжения образцов были сосредоточены на 2D-субстратах, нагруженных клетками, чтобы изучить влияние на поведение клеток. К ним относятся, например, нанесение деформации на подложки из полидиметилсилоксана (PDMS) и анализ углов переориентации клеток по отношению к направлению растяжения15,16,17,18,19. Тем не менее, методы, исследующие реакцию 3D-гидрогелей, встроенных в клетки, на внешнее растяжение, ситуацию, которая более точно имитирует микроокружение тканей, более ограничены. Достижения в области методов 3D-растяжения имеют особое значение, потому что клетки ведут себя по-разному на 2D-подложках по сравнению с 3D-матрицами20. Это поведение включает клеточную перестройку, уровни экспрессии белка и модели миграции21,22,23.
Методы и устройства, позволяющие растягивать 3D-образец, включают как коммерчески доступные24,25,26,27,28, так и разработанные для лабораторных исследований29. В этих методах используются рассываемые силиконовые трубки30,многозаборные камеры31,зажимы26,32,биореакторы11,33,консольныекамеры 34,35,36и магниты37,38. Некоторые методы генерируют растяжение, которое локально деформирует 3D-гидрогели, например, путем вытягивания игл из двух отдельных точек вгеле 5,в то время как другие допускают деформацию всей массы геля16. Более того, большинство из этих систем сосредоточены на анализе поля деформации в плоскости X-Y, с ограниченной информацией о поле деформации в Z-направлении. Кроме того, только несколько из этих устройств способны к микроскопической визуализации in situ. Основной проблемой визуализации in situ с высоким увеличением (например, конфокального микроскопа) является ограниченное рабочее расстояние в несколько сотен микрон от объектива до образца. Устройства, которые действительно позволяют визуализировать в реальном времени во время растяжения, жертвуют однородностью деформации в оси Zили относительно сложны и трудно воспроизводятся в других лабораториях39,40.
Такой подход к растяжению 3D-гидрогелей позволяет проводить статическую или циклическую одноосную деформацию во время живой конфокальной микроскопии. Растягивающее устройство (называемое «Smart Cyclic Uniaxial Stretcher — SCyUS») построено с использованием 3D-печатных деталей и недорогого оборудования, что позволяет легко воспроизводить в других лабораториях. К устройству прилагается коммерчески доступная силиконовая резина с геометрическим вырезом в центре. Компоненты гидрогеля полимеризуются для заполнения выреза. Во время полимеризации биологические гидрогели, такие как фибрин или коллаген, естественным образом прилипают к внутренним стенкам выреза. Используя SCyUS, силиконовая полоса ненатягивается, передавая контролируемые деформации во встроенный 3D-гидрогель41.
Эта система позволяет обеспечить уникальное сочетание функций и преимуществ по сравнению с другими существующими методами. Во-первых, система позволяет одноосное растяжение толстых 3D-мягких гидрогелей (толщиной >100 мкм, жесткость <1 кПа) с их периферии с Z-однороднойдеформацией по всему гидрогелю. Эти гидрогели слишком мягкие, чтобы их можно было сжимать и растягивать обычными методами растяжения. Во-вторых, растягивающее устройство может быть легко воспроизведено в других лабораториях, поскольку 3D-печать легко доступна для исследователей, а электроника, используемая в дизайне, является недорогой. В-третьих, и, возможно, самая привлекательная особенность, геометрия и размер выреза в силиконовой полосе могут быть легко обработаны, что позволяет настраивать градиенты деформации и граничные условия, а также использовать различные объемы образцов, вплоть до нескольких микролитров.
Представленный протокол состоит из формования фибринового геля в диски диаметром ~2 мм в силиконовых резиновых полосах толщиной 0,5 мм, продолженных одноосным растяжением под живой конфокальной микроскопией. Далее подробно обсуждаются экспериментальные процедуры измерения и анализа деформаций, действующих на геометрический вырез, внутренние деформации, выработанные в гидрогеле, а также результирующее выравнивание волокон после различных манипуляций с растяжением. Наконец, обсуждается возможность встраивания клеток в гидрогель и воздействия на них контролируемого внешнего растяжения.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 546 carboxylic acid, succinimidyl ester</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A20002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Medium (DMEM High Glucose)</td>
			<td>Biological Industries</td>
			<td>01-052-1A</td>
			<td>Add 10% FBS, 1% PNS, 1% L-Glutamine, 1% Sodium Pyruvate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cover Slip #1.5</td>
			<td>Bar-Naor Ltd.</td>
			<td>BN72204-30</td>
			<td>22&#215;40 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DIMETHYL SULPHOXIDE 99.5% GC DMSO</td>
			<td>Sigma-Aldrich Inc.</td>
			<td>D-5879-500 ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Phosphate-Buffered Saline</td>
			<td>Biological Industries</td>
			<td>02-023-1A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EVICEL Fibrin Sealant (Human)</td>
			<td>Omrix Biopharmaceuticals</td>
			<td>3902</td>
			<td>Fibrinogen: 70 mg/mL, Thrombin: 800-1200 IU/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibrinogen Buffer</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
			<td>Recipe for 1L: 7g NaCl, 2.94g trisodium citrate dihydrate, 9g glycine, 20g arginine hydrochloride &#38; 0.15g calcium chloride dihydrate. Bring final volume to 1L with PuW (pH 7.0-7.2)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescent micro-beads FluoSpheres (1 &#181;m)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>F8820</td>
			<td>Orange (540/560) 
			Provided as suspension (2% solids) in water plus 2 mM sodium azide</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High-Temperature Silicone Rubber</td>
			<td>McMaster-Carr</td>
			<td>3788T41</td>
			<td>580 &#181;m-thick 
			E = 1.5 Mpa 
			Poisson Ratio = 0.48 
			Tensile Strength = 4.8 MPa 
			Upper limit of stretch = +300% engineering strain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HiTrap desalting column 5 mL (Sephadex G-25 packed)</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>17-1408-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HIVAC-G High Vacuum Sealing Compound</td>
			<td>Shin-Etsu Chemical Co., Ltd.</td>
			<td>HIVAC-G 100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ FIJI software39</td>
			<td>National Institute of Health, Bethesda, MD</td>
			<td>Version 1.8.0_112</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcontroller (Adruino Uno + Adafruit Motorshield v2.3)</td>
			<td>Arduino/Adafruit</td>
			<td>Arduino-DK001/Adafruit-1438</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MicroVL 21R Centrifuge</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>75002470</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm</td>
			<td>Bemis</td>
			<td>PM-996</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primovert Light Microscope</td>
			<td>Carl Zeiss Suzhou Co., Ltd.</td>
			<td>491206-0011-000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SCyUS CAD (Solidworks)</td>
			<td>Dassault Syst&#232;mes</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SCyUS Code37</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Servomotor - TowerPro SG-5010</td>
			<td>Adafruit</td>
			<td>155</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SL 16R Centrifuge</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>75004030</td>
			<td>For 50 mL tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile 10 cm non-culture plates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430167</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thrombin buffer</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
			<td>Recipe for 1L: 20g mannitol, 8.77g NaCl, 2.72g sodium acetate trihydrate, 24 mL 25% Human Serum Albumin, 5.88g calcium chloride. Bring final volume to 1L with PuW (pH 7.0)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin EDTA Solution B (0.25%), EDTA (0.05%)</td>
			<td>Biological Industries</td>
			<td>03-052-1B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>USB Cable (Type B Male to Type A Male)</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss LSM 880 Confocal Microscope</td>
			<td>Carl Zeiss AG</td>
			<td>2811000417</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZEN 2.3 SP1 FP3 (black)</td>
			<td>Carl Zeiss AG</td>
			<td>Release Version 14.0.0.0</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

controlled strain of 3d hydrogels under live microscopy imaging

Внешние силы являются важным фактором в формировании, развитии и поддержании тканей. Воздействие этих сил часто изучается с использованием специализированных методов растяжения in vitro. Различные доступные системы используют носилки на основе 2D-подложки, в то время как доступность 3D-методов для деформации мягких гидрогелей более ограничена. Здесь мы описываем метод, который позволяет внешне растягивать мягкие гидрогели от их окружности, используя упругую силиконовую полосу в качестве носителя образца. Система растяжения, используемая в этом протоколе, построена из 3D-печатных деталей и недорогой электроники, что делает ее простой и легкой для воспроизведения в других лабораториях. Экспериментальный процесс начинается с полимеризации толстых (>100 мкм) мягких гидрогелей фибрина (модуль упругости ~100 Па) в вырезе в центре силиконовой полосы. Силикон-гелевые конструкции затем прикрепляются к печатно-растягивающей устройству и помещаются на ступень конфокального микроскопа. При живой микроскопии активируется растягивающее устройство, и гели визуаизируются с различной величиной растяжения. Затем обработка изображений используется для количественной оценки результирующих деформаций геля, демонстрируя относительно однородные деформации и выравнивание волокон по всей толщине геля 3D (осьZ). Преимущества этого метода включают в себя возможность деформации чрезвычайно мягких гидрогелей в 3D при выполнении микроскопии in situ и свободу манипулировать геометрией и размером образца в соответствии с потребностями пользователя. Кроме того, при правильной адаптации этот метод может быть использован для растяжения других типов гидрогелей (например, коллагена, полиакриламида или полиэтиленгликоля) и может позволить анализировать реакцию клеток и тканей на внешние силы в более биомиметических 3D-условиях.

Репрезентативные данные статического растяжения возрастающих величин, нанесенного на силиконовую полосу, несущий 3D-гидрогель фибрина, встроенный флуоресцентными шариками 1 мкм, показаны на рисунке 9. Анализ демонстрирует влияние растяжения силикона на геометрич?...

Watch this Scientific Journal Video about Controlled Strain of 3D Hydrogels under Live Microscopy Imaging at JoVE.com

Controlled Strain of 3D Hydrogels under Live Microscopy Imaging

Представленный способ включает одноосное растяжение 3D мягких гидрогелей, встроенных в силиконовую резину, при этом позволяя проводить живую конфокальную микроскопию. Показано определение характеристик внешних и внутренних деформаций гидрогеля, а также выравнивание волокон. Разработанное устройство и протокол могут оценивать реакцию клеток на различные режимы деформации.

Контролируемое напряжение 3D-гидрогелей при визуализации живой микроскопии

External forces are an important factor in tissue formation, development, and maintenance. The effects of these forces are often studied using specialized ...

Biological tissues grow in three-dimensional soft environments through which cells are exposed to various mechanical cues. Our method allows the stretching of hydrogels in a three-dimensional manner for the investigation of biomechanical responses. This technique enables the uniform stretching of hydrogels along their thickness while live imaging is performed.Additionally, the hydrogel's geometry can be manipulated to any size or shape. Knowledge about how cells and extracellular matrix respond to forces is important for revealing how tissues develop and diseases progress. This can lead to potential development of cancer therapies and tissue engineering models.Begin by using a laser or manual cutter to create a rubber strip with a hole in the center. Cut a rectangle of hydrophobic film so that it is wider than the silicone strips and wash a plastic dish with 70%ethanol. After drying with lint-free wipes, place the sealing film into the dish and place one silicone strip with the plastic wrap removed from one side into the center of each piece of sealing film.For fibrin gel formation, uniformly deliver 2.5 microliters of cold labeled fibrinogen into the silicone cutout of each strip so that the entire circumference of each cutout is in contact with fibrinogen, taking care not to allow any air pockets or bubbles to form anywhere in the solutions. Immediately add 2.5 microliters of cooled thrombin directly to each fibrinogen solution and quickly mix the solutions with careful pipetting, moving the tip around the entire mixture to create as homogenous a solution as possible. After mixing, place the covered dish in the incubator for 30 minutes for gel polymerization.At the end of the incubation, add enough PBS to the dish to submerge the gel silicone constructs and carefully lift each sample from the dish, making sure that the sealing film layer remains adhered to the strip. Slowly peeling from one end of the silicone to the other, carefully detach the sealing film from each piece of silicone, then place the strip back into the dish and place the dish on the stage of a light microscope to assess the condition of the sample. To load the sample onto the stretching device, fill the bath with PBS and place the silicone strip containing the sample gel across the top of the bath so the ends of the strip are sitting on each side of the bath.Place the clamps and fabric strips, and then tighten so that all of the pieces are connected to form one straight strip with the cutout in the center. Place the material on the well and secure a cover slip on the bottom of the well, then place an aluminum liquid well into the stretching device. Fill the well with one to two milliliters of PBS cell medium and place the strip fabric gel construct into the device.Clamp the fabric strip into the bracket so that the cutout of the gel is in the center before carefully placing and locking the pin down insert into place in the device. Place and lock other fabric side into the spindle and place the stretching device and the attached sample onto the stage of a confocal microscope. Use a USB cable to connect the microcontroller to the computer and connect the servo motor to the microcontroller.Then open the stretching device control module on the computer to image the sample. To determine whether the sample is adequate for an experiment, use low resolution live imaging to scan the entire gel and determine the lowest Z position at which full adhesion to the inner walls of the cutout is apparent with no tears or bubbles. After noting the Z location of the microscope, scan the interface of the fluorescent label of the gel and silicone strip to determine the full adhesion of the gel to the silicone throughout its circumference.After scanning, move the stage in the Z direction until there is no longer continuity in the gel and note the upper limit of the Z position. Then subtract the upper limit of the Z direction from the lower limit to calculate the sample thickness. To determine the pre-stretch position of the sample, click Go to Zero Servo POS in the module software to make sure the servo motor is at its zero position and attach the servo motor to the stretching device, taking care and not to put any strain on the sample.While imaging, click the plus one button to move the motor one degree at a time in the clockwise direction. When the right side of the cutout moves, click the minus one button to reverse the sample to the penultimate position to maintain the sample under minimal tension. Click Set Min Servo Position to set the reference position and capture a 40 time magnification, high resolution, single Z slice tile image of the entire gel area as a baseline reference for the post-processing analysis.When all of the images have been acquired, advance the servo motor one degree per second until the desired stretch magnitude is reached. At each stretch magnitude for which an analysis is desired, verify that the gel has not detached from the silicone at any point throughout its circumference by scanning the interface between the gel and the silicone, then capture a high resolution tile Z stack image set of the entire gel area for post-processing analysis. Zooming in and manually tracking bead aggregates during gel stretching allows calculation of the local gel strains in the axial and perpendicular directions.Typically the axial strands propagate relatively linearly from the silicone cutout edge to the center of the gel and are larger than the compressive perpendicular strains. Here, high magnification images of a typical unstretched and relatively isotropic hydrogel, and a hydrogen under high 80%cutout strain depicting highly aligned fibers in the stretch direction are shown. Analysis of the fiber reorientation revealed an approximately linear dependence between the fiber alignment and the external strain on the cutout up to strains of 40%with moderate saturation at strains above 40%As illustrated in this fiber alignment analysis, as the external strain on the cutout increases, the fiber alignment increases, following an overall non-linear curve.Note that the gel response to stretch is relatively uniform along its Z thickness. As illustrated in this preliminary finite element simulation performed on 2D continuous material, the color mat ranges from 38 to 42%indicating that the gel strains are relatively homogenous throughout the circular gel area. It is important to ensure the hydrogel completely adheres to the inner walls of the geometric cutout, as adhesion and continuity is crucial for reliable stretching of samples.By modifying the geometry of the silicone cutout, we can program gradients in strain and fiber alignment, so when embedding cells we can analyze the response to these gradients.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Three-dimensional Optical-resolution Photoacoustic Microscopy

Трехмерная оптическая разрешением Фотоакустическая микроскопии

Optical microscopy, providing valuable insights at the cellular and organelle levels, has been widely recognized as an enabling biomedical technology. As ...

Magnetically-Assisted Remote Controlled Microcatheter Tip Deflection under Magnetic Resonance Imaging

Магнитно-Assisted дистанционным управлением отклонения Совет микрокатетер при магнитно-резонансной томографии

X-ray fluoroscopy-guided  endovascular procedures have several significant limitations, including  difficult catheter navigation and use of ionizing ...

Tunable Hydrogels from Pulmonary Extracellular Matrix for 3D Cell Culture

Настраиваемый гидрогели от легочного внеклеточной матрицы для 3D клеточных культур

Here we present a method for establishing multiple component cell culture hydrogels for in vitro lung cell culture. Beginning with healthy en bloc lung ...

Production of Elastin-like Protein Hydrogels for Encapsulation and Immunostaining of Cells in 3D

Производство белка эластина как гидрогели для инкапсуляции и иммуноокрашивания клеток в 3D

Two-dimensional (2D) tissue culture techniques have been essential for our understanding of fundamental cell biology. However, traditional 2D tissue ...

Visualizing Adhesion Formation in Cells by Means of Advanced Spinning Disk-Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy

Визуализация адгезии образование в клетках посредством передовых спиннинг диска всего внутреннего отражения микроскопии флуоресцирования

In living cells, processes such as adhesion formation involve extensive structural changes in the plasma membrane and the cell interior. In order to ...

Measuring Global Cellular Matrix Metalloproteinase and Metabolic Activity in 3D Hydrogels

Измерение глобального сотовой матрицы металлопротеиназ и метаболической активности в 3D гидрогели

Three-dimensional (3D) cell culture systems often more closely recapitulate in vivo cellular responses and functions than traditional two-dimensional (2D) ...

High-resolution Imaging of Nuclear Dynamics in Live Cells under Uniaxial Tensile Strain

Сканирование с высоким разрешением ядерной динамики в живых клетках под напряжением Uniаксиального натяжения

Extracellular mechanical strain is known to elicit cell phenotypic responses and has physiological relevance in several tissue systems. To capture the ...

Characterizing Single-Molecule Conformational Changes Under Shear Flow with Fluorescence Microscopy

Характеристика одномолекулярных конформационных изменений под стрижкой потока с флуоресценционной микроскопией

Single-molecule behavior under mechanical perturbation has been characterized widely to understand many biological processes. However, methods such as ...

A Custom Multiphoton Microscopy Platform for Live Imaging of Mouse Cornea and Conjunctiva

Пользовательская многофотонная микроскопическая платформа для живого изображения мыши Корнеа и Конъюнктивы

Conventional histological analysis and cell culture systems are insufficient to simulate in vivo physiological and pathological dynamics completely. ...

Near Simultaneous Laser Scanning Confocal and Atomic Force Microscopy (Conpokal) on Live Cells

Near Simultaneous Laser Scanning Confocal and Atomic Force Microscopy Conpokal on Live Cells

Рядом с одновременным лазерным сканированием конфокаловой и атомной микроскопии силы (Conpokal) на живых клетках

Techniques available for micro- and nano-scale mechanical characterization have exploded in the last few decades. From further development of the scanning ...