Name: an ex vivo choroid sprouting assay of ocular microvascular angiogenesis
Uploaded: 2020-08-06T16:30:00
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この研究は、鈴木マンペイ糖尿病財団(YT)、ボストン小児病院OFD/BTREC/CTREC教員キャリア開発助成金、ボストン小児病院眼科学財団、BCHパイロット賞、BCHマントンセンターフェローシップ、マントンセンターフェローシップの助成金によって支援されました。 そしてリトルキリン財団(ZF)、ドイツ研究財団(DFG;紀元前[CA1940/1-1])、NIH R24EY024868、EY017017、R01EY01717-13S1、EY030904-01、BCH IDDRC(1U54HD09025)、マサチューセッツ州ライオンズ財団(1U54HD09025)、マサチューセッツ州ライオンズ財団(1U54HD09025)、LEHS財団(

記載されているすべての動物実験は、ボストン小児病院の施設動物ケアおよび使用委員会(ARCHプロトコル番号19-04-3913R)によって承認されました。
1. 準備
<ol><li>ペニシリン/ストレプトマイシン(10000 U/mL)5 mLと5mLと10mLの市販サプリメントを、完全な古典的な培地の500 mLに血清で加えます。初期の培地のアリコート50mL。 注:汚染を避けるために、在庫に媒体を戻さないよう?...

<ol>
	<li>Zarbin, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Current+concepts+in+the+pathogenesis+of+age-related+macular+degeneration.">Current concepts in the pathogenesis of age-related macular degeneration.</a> Arch Ophthalmol. 122 (4), 598-614 (2004).</li><li>Pemp, B., Schmetterer, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ocular+blood+flow+in+diabetes+and+age-related+macular+degeneration.">Ocular blood flow in diabetes and age-related macular degeneration.</a> Canadian Journal of Ophthalmology. 43 (3), 295-301 (2008).</li><li>Murakami, Y., Ishikawa, K., Nakao, S., Sonoda, K. 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V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+Aortic+Ring+Assay:+A+New+Approach+of+the+Molecular+Genetics+of+Angiogenesis.">Mouse Aortic Ring Assay: A New Approach of the Molecular Genetics of Angiogenesis.</a> Biological Procedures Online. 4, 24-31 (2002).</li><li>Katakia, Y. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ex+vivo+model+for+studying+endothelial+tip+cells:+Revisiting+the+classical+aortic-ring+assay.">Ex vivo model for studying endothelial tip cells: Revisiting the classical aortic-ring assay.</a> Microvascular Research. 128, 103939 (2020).</li><li>Rezzola, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+and+ex+vivo+retina+angiogenesis+assays.">In vitro and ex vivo retina angiogenesis assays.</a> Angiogenesis. 17 (3), 429-442 (2014).</li><li>Rezzola, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+ex+vivo+murine+retina+angiogenesis+(EMRA)+assay.">A novel ex vivo murine retina angiogenesis (EMRA) assay.</a> Experimental Eye Research. 112, 51-56 (2013).</li><li>Shao, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Choroid+sprouting+assay:+an+ex+vivo+model+of+microvascular+angiogenesis.">Choroid sprouting assay: an ex vivo model of microvascular angiogenesis.</a> PLoS One. 8 (7), 69552 (2013).</li><li>Tomita, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Free+fatty+acid+receptor+4+activation+protects+against+choroidal+neovascularization+in+mice.">Free fatty acid receptor 4 activation protects against choroidal neovascularization in mice.</a> Angiogenesis. 23, 385-394 (2020).</li><li>Li, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+TWIST1+promotes+pathological+ocular+angiogenesis.">Endothelial TWIST1 promotes pathological ocular angiogenesis.</a> Investigative Ophthalmology and Vision Science. 55 (12), 8267-8277 (2014).</li><li>Liu, C. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+microRNA-150+is+an+intrinsic+suppressor+of+pathologic+ocular+neovascularization.">Endothelial microRNA-150 is an intrinsic suppressor of pathologic ocular neovascularization.</a> Proceedings of the National Academy of Science U. S. A. 112 (39), 12163-12168 (2015).</li><li>Zhou, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LncEGFL7OS+regulates+human+angiogenesis+by+interacting+with+MAX+at+the+EGFL7/miR-126+locus.">LncEGFL7OS regulates human angiogenesis by interacting with MAX at the EGFL7/miR-126 locus.</a> Elife. 8, 40470 (2019).</li><li>Kobayashi, S., Fukuta, M., Kontani, H., Yanagita, S., Kimura, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+quantitative+assay+for+angiogenesis+of+cultured+choroidal+tissues+in+streptozotocin-diabetic+Wistar+and+spontaneously+diabetic+GK+rats.">A quantitative assay for angiogenesis of cultured choroidal tissues in streptozotocin-diabetic Wistar and spontaneously diabetic GK rats.</a> Japanese Journal of Pharmacology. 78 (4), 471-478 (1998).</li><li>Kobayashi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibitory+effects+of+tetrandrine+and+related+synthetic+compounds+on+angiogenesis+in+streptozotocin-diabetic+rodents.">Inhibitory effects of tetrandrine and related synthetic compounds on angiogenesis in streptozotocin-diabetic rodents.</a> Biological and Pharmaceutical Bulletin. 22 (4), 360-365 (1999).</li><li>Kobayashi, S., Shinohara, H., Tsuneki, H., Nagai, R., Horiuchi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=N(epsilon)-(carboxymethyl)lysine+proliferated+CD34(+)+cells+from+rat+choroidal+explant+in+culture.">N(epsilon)-(carboxymethyl)lysine proliferated CD34(+) cells from rat choroidal explant in culture.</a> Biological and Pharmaceutical Bulletin. 27 (9), 1382-1387 (2004).</li><li>Kobayashi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overproduction+of+N(epsilon)-(carboxymethyl)lysine-induced+neovascularization+in+cultured+choroidal+explant+of+streptozotocin-diabetic+rat.">Overproduction of N(epsilon)-(carboxymethyl)lysine-induced neovascularization in cultured choroidal explant of streptozotocin-diabetic rat.</a> Biological and Pharmaceutical Bulletin. 27 (10), 1565-1571 (2004).</li><li>Bergers, G., Song, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+pericytes+in+blood-vessel+formation+and+maintenance.">The role of pericytes in blood-vessel formation and maintenance.</a> Neuro-Oncology. 7 (4), 452-464 (2005).</li><li>Browning, A. C., Stewart, E. A., Amoaku, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reply+to:+Phenotypic+plasticity+of+human+umbilical+vein+endothelial+cells.">Reply to: Phenotypic plasticity of human umbilical vein endothelial cells.</a> British Journal of Ophthalmology. 96 (9), 1275-1276 (2012).</li></ol>

脈絡膜発芽アッセイは、新血管AMD9、10、18、19、20の研究を助ける。脈絡膜外植は、マウスだけでなく、ラットおよびヒト17、21から単離することができる。脈絡膜外植は、IC、マクロファージ、およびペリサイト17<...

脈絡膜血管新生調節異常は、新血管加齢黄斑変性症(AMD)1と関連している。脈絡膜は、網膜色素上皮(RPE)の下に存在する微小血管床である。脈絡膜における血流の減少は、AMD2の進行と関連することが示されている。血管内皮、RPE、マクロファージ、包皮細胞および他の細胞との間の複雑な関係は、組織3、4、5の恒常性を担う。従って、再生可能なアッセイは、新血管AMDの研究に重要な脈絡膜微小環境をモデル化する。
Ex vivo血管新生アッセイおよびインビトロ内皮細胞培養は、生体内の微小血管挙動の研究、新薬の試験、および病原性の研究を補完することができる。ヒトの眼内小血管内皮細胞(HRMEC)、ヒトアンビリカル静脈内皮細胞(HUVEC)、単離された原発性動物の脳または眼内脳の脳などの内皮細胞は、眼血管新生研究6、7、8の体外研究でしばしば使用される。特にHRMECは、内皮増殖、移動、管形成、および血管漏れを評価することによってインビトロ脈絡膜新血管新生(CNV)9のモデルとして広く使用され、介入を評価する6,10。しかし、培養中のECは、脈絡膜に見られる他の細胞型との相互作用が欠如し、これらのアッセイで使用されるほとんどのECが脈絡膜に由来しないため、CNVのモデルとして制限されています。マウス脈絡膜電子株は培養中に分離し維持することが困難である。
大動脈環アッセイは、マクロ血管増殖のモデルとして広く用いられている。大動脈外植植物からの血管芽は、IC、ペリサイトおよびマクロファージ11を含む。大動脈環アッセイは、大血管血管新生ウェル12、13、14をモデル化する。しかし、大動脈環としての脈絡膜新血管化のモデルとしての限界があり、特徴的な脈絡膜微小血管環境を欠いた大血管組織であり、大血管からの芽は微小血管病理に関与する毛細血管ネットワークとは異なる可能性がある。最近、グループは、元生体のレティナルアッセイ15、16を発表しました。しかし、それは、疾患性新血管疾患に適しているが、それはAMDに見られるほど脈絡膜新血管化に適していない。
マウスRPE、脈絡膜、および硬化分離組織を用いた脈絡膜発芽アッセイは、より良いモデルCNVのために開発された。組織はマウス(または他の種)の目17から容易に単離することができる。このアッセイは、薬理学的化合物のプロおよび抗血管新生電位の再現性評価及び遺伝子組換えマウスおよび対照18からの組織を用いた脈絡膜新生血管形成における特定の経路の役割の評価を可能にする。この脈絡膜発芽アッセイは、その後の多くの出版物9、10、18、19、20で参照されています。ここでは、このアッセイの使用に関与する方法が示される。

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>AnaSed (Xylazine)</td>
			<td>AKORN</td>
			<td>59339-110-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Basal membrane extract (BME) Matrigel</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>354230</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture dish</td>
			<td>NEST</td>
			<td>704001</td>
			<td>10cm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Complete classic medium with serum and CultureBoost</td>
			<td>Cell systems</td>
			<td>4Z0-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethyl alcohol 200 Proof</td>
			<td>Pharmco</td>
			<td>111000200</td>
			<td>use for 70%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kimwipes</td>
			<td>Kimberly-Clark</td>
			<td>06-666</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope</td>
			<td>ZEISS</td>
			<td>Axio Observer Z1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>15140</td>
			<td>10000 U/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue culture plate (24-well)</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>25-107</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VetaKet CIII (Ketamine)</td>
			<td>AKORN</td>
			<td>59399-114-10</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an ex vivo choroid sprouting assay of ocular microvascular angiogenesis

加齢黄斑変性症の顕著な特徴である病的脈絡膜血管新生は、視力障害および失明を引き起こしうる。ヒトのレチナル微小血管内皮細胞(HRMEC)または単離された一次性の腎細胞を用いた内皮細胞(EC)増殖アッセイは、腎血管新生を研究するために、インビトロモデルで広く使用されている。しかし、純粋なマウスのレチナル内皮細胞を単離することは技術的に困難であり、RETINAL ECは脈絡膜内皮細胞および異なる細胞/細胞相互作用とは異なる増殖応答を有する可能性がある。脈絡膜微小血管増殖のモデルとして、再現性の高いex vivo脈絡膜発芽アッセイが開発された。このモデルには、脈絡膜血管系(EC、マクロファージ、ペリサイト)と網膜色素上皮(RPE)の相互作用が含まれます。マウス RPE/脈絡膜/鎖状外植体は、成長因子減少基底膜抽出物(BME)(0日目)で単離され、インキュベートされる。培地は1日おきに変化し、6日目に脈絡芽が定量される。個々のチョロイド外植の画像は反転した位相顕微鏡で撮影され、発芽領域は、本研究室で開発されたImageJソフトウェアへの半自動マクロプラグインを使用して定量化されます。この再現性ex vivo脈絡膜発芽アッセイは、潜在的な治療のための化合物を評価し、微小血管疾患研究のために、野生型および遺伝子組み換えマウス組織を用いた脈絡膜微小血管増殖に関与する経路を評価するために使用することができる。

1日あたりの脈絡芽成長の比較
BMEに埋め込まれた鎖骨で脈絡膜を解剖し、6日間培養した(図1)。C57BL/6Jマウスで3日目から6日目までの脈絡芽を顕微鏡で調べ、ImageJでの半自動定量法をSWIFT-チョロイドで定量した。代表的な場合、発脈芽領域(外植から伸びる血管は、外植自体を除く)は、3日目(図3A)、4日目(図3B)で1.47mm2?...

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An Ex Vivo Choroid Sprouting Assay of Ocular Microvascular Angiogenesis

このプロトコルは、微小血管増殖の元生体モデルである脈絡芽発芽アッセイを提示する。このアッセイは、脈絡膜微小血管の増殖に関与する経路を評価し、野生型および遺伝子組み換えマウス組織を用いた薬物治療を評価するために使用することができる。

眼小血管血管新生のエキビボロイド発芽アッセイ

Pathological choroidal angiogenesis, a salient feature of age-related macular degeneration, leads to vision impairment and blindness. Endothelial cell ...

Research

JoVE Journal

Biology

Christopher Hughes:  An in vitro model for the Study of Angiogenesis (Interview)

Christopher Hughes:  An in vitro model for the Study of Angiogenesis Interview

クリストファーヒューズ：血管新生の研究のためのin vitroモデル（インタビュー）

Christopher C.W. Hughes describes the utility of his culture system for studying angiogenesis in vitro.  He explains the importance of fibroblasts that ...

Optimized Fibrin Gel Bead Assay for the Study of Angiogenesis

血管新生の研究のために最適化されたフィブリンゲルビーズアッセイ

Angiogenesis is a complex multi-step process, where, in response to angiogenic stimuli, new vessels are created from the existing vasculature.  These ...

Ex vivo Mechanical Loading of Tendon

腱の生体外で機械的負荷

Injuries to the tendon (e.g., wrist tendonitis, epicondyltis) due to overuse are common in sports activities and the workplace.  Most are associated with ...

Rat Mesentery Angiogenesis Assay

ラット間膜の血管新生アッセイ

The adult rat mesentery window angiogenesis assay is biologically appropriate and is exceptionally well suited to the 
study of sprouting angiogenesis in ...

A System for ex vivo Culturing of Embryonic Pancreas

A System for ex vivo Culturing of Embryonic Pancreas

のためのシステム<em&gt; ex vivoで</em胚膵臓&gt;培養

The pancreas controls vital functions of our body,  including the production of digestive enzymes and regulation of blood sugar  levels1. Although in the ...

Endothelial Cell Tube Formation Assay for the In Vitro Study of Angiogenesis

Endothelial Cell Tube Formation Assay for the In Vitro Study of Angiogenesis

のための内皮細胞チューブ形成アッセイ<em&gt;体外</em&gt;血管新生に関する研究

Angiogenesis is a vital process for normal tissue development and wound healing, but is also associated with a variety of pathological conditions. Using ...

An Ex vivo Culture System to Study Thyroid Development

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アン<em&gt;生体外</em甲状腺の開発を研究する&gt;文化システム

The thyroid is a bilobated endocrine gland localized at the base of the neck, producing the thyroid hormones T3, T4, and calcitonin. T3 and T4 are ...

The c-FOS Protein Immunohistological Detection: A Useful Tool As a Marker of Central Pathways Involved in Specific Physiological Responses In Vivo and Ex Vivo

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C-FOSタンパク質免疫組織学的検出：特定の生理反応に関与する中央経路のマーカーとして有用ツール<em&gt;インビボ</em&gt;と<em&gt; ex vivoで</em

Many studies seek to identify and map the brain regions involved in specific physiological regulations. The proto-oncogene c-fos, an immediate early gene, ...

An Ex Vivo Tissue Culture Model of Cartilage Remodeling in Bovine Knee Explants

牛膝剥離植物における軟骨改造のEx Vivo組織培養モデル

Ex vivo culture systems cover a broad range of experiments dedicated to studying tissue and cellular function in a native setting. Cartilage is a unique ...

Glomerular Outgrowth as an Ex Vivo Assay to Analyze Pathways Involved in Parietal Epithelial Cell Activation

上頭頂皮細胞活性化に関与する経路を解析するエクスビボアッセイとしての糸球体成長

Parietal epithelial cell (PEC) activation is one of the key factors involved in the development and progression of glomerulosclerosis. Inhibition of ...