Name: an ex vivo choroid sprouting assay of ocular microvascular angiogenesis
Uploaded: 2020-08-06T16:30:00
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El trabajo fue apoyado por Grants de la Manpei Suzuki Diabetic Foundation (YT), Boston Children's Hospital OFD/BTREC/CTREC Faculty Career Development Grant, Boston Children's Hospital Ophthalmology Foundation, BCH Pilot Award, BCH Manton Center Fellowship y Little Giraffe Foundation (ZF), The German Research Foundation (DFG; BC [CA1940/1-1]), NIH R24EY024868, EY017017, R01EY01717-13S1, EY030904-01, BCH IDDRC (1U54HD090255), Massachusetts Lions Eye Foundation (LEHS).

Todos los experimentos con animales descritos fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales en boston Children's Hospital (protocolo ARCH número 19-04-3913R).
1. Preparación
<ol><li>Añadir 5 ml de penicilina/estreptomicina (10000 U/mL) y 5 ml y 10 ml de suplementos disponibles comercialmente a 500 ml de medio clásico completo con suero. Aliquot 50 mL del medio inicialmente. NOTA: No devuelva ningún medio a la población para evitar la contaminación.</li>...

<ol>
	<li>Zarbin, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Current+concepts+in+the+pathogenesis+of+age-related+macular+degeneration.">Current concepts in the pathogenesis of age-related macular degeneration.</a> Arch Ophthalmol. 122 (4), 598-614 (2004).</li><li>Pemp, B., Schmetterer, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ocular+blood+flow+in+diabetes+and+age-related+macular+degeneration.">Ocular blood flow in diabetes and age-related macular degeneration.</a> Canadian Journal of Ophthalmology. 43 (3), 295-301 (2008).</li><li>Murakami, Y., Ishikawa, K., Nakao, S., Sonoda, K. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Innate+immune+response+in+retinal+homeostasis+and+inflammatory+disorders.">Innate immune response in retinal homeostasis and inflammatory disorders.</a> Progress in Retinal and Eye Research. 74, 100778 (2020).</li><li>Fu, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dyslipidemia+in+retinal+metabolic+disorders.">Dyslipidemia in retinal metabolic disorders.</a> EMBO Molecular Medicine. 11 (10), 10473 (2019).</li><li>Daruich, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+macular+edema:+Beyond+the+surface.">Mechanisms of macular edema: Beyond the surface.</a> Progress in Retinal and Eye Research. 63, 20-68 (2018).</li><li>Tomita, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-Acting+FGF21+Inhibits+Retinal+Vascular+Leakage+in+In+Vivo+and+In+Vitro+Models.">Long-Acting FGF21 Inhibits Retinal Vascular Leakage in In Vivo and In Vitro Models.</a> International Journal of Molecular Sciences. 21 (4), 21041188 (2020).</li><li>Maisto, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ARPE-19-derived+VEGF-containing+exosomes+promote+neovascularization+in+HUVEC:+the+role+of+the+melanocortin+receptor+5.">ARPE-19-derived VEGF-containing exosomes promote neovascularization in HUVEC: the role of the melanocortin receptor 5.</a> Cell Cycle. 18 (4), 413-424 (2019).</li><li>Mazzoni, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Wnt+Inhibitor+Apcdd1+Coordinates+Vascular+Remodeling+and+Barrier+Maturation+of+Retinal+Blood+Vessels.">The Wnt Inhibitor Apcdd1 Coordinates Vascular Remodeling and Barrier Maturation of Retinal Blood Vessels.</a> Neuron. 96 (5), 1055-1069 (2017).</li><li>Fu, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adiponectin+Mediates+Dietary+Omega-3+Long-Chain+Polyunsaturated+Fatty+Acid+Protection+Against+Choroidal+Neovascularization+in+Mice.">Adiponectin Mediates Dietary Omega-3 Long-Chain Polyunsaturated Fatty Acid Protection Against Choroidal Neovascularization in Mice.</a> Investigative Ophthalmology and Visual Sciences. 58 (10), 3862-3870 (2017).</li><li>Gong, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytochrome+P450+Oxidase+2C+Inhibition+Adds+to+omega-3+Long-Chain+Polyunsaturated+Fatty+Acids+Protection+Against+Retinal+and+Choroidal+Neovascularization.">Cytochrome P450 Oxidase 2C Inhibition Adds to omega-3 Long-Chain Polyunsaturated Fatty Acids Protection Against Retinal and Choroidal Neovascularization.</a> Arteriosclerosis, Thrombosis and Vascular Biology. 36 (9), 1919-1927 (2016).</li><li>Nicosia, R. F., Zorzi, P., Ligresti, G., Morishita, A., Aplin, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Paracrine+regulation+of+angiogenesis+by+different+cell+types+in+the+aorta+ring+model.">Paracrine regulation of angiogenesis by different cell types in the aorta ring model.</a> International Journal of Developmental Biology. 55 (4-5), 447-453 (2011).</li><li>Bellacen, K., Lewis, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aortic+ring+assay.">Aortic ring assay.</a> Journal of Visulaized Experiments. (33), e1564 (2009).</li><li>Masson, V. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+Aortic+Ring+Assay:+A+New+Approach+of+the+Molecular+Genetics+of+Angiogenesis.">Mouse Aortic Ring Assay: A New Approach of the Molecular Genetics of Angiogenesis.</a> Biological Procedures Online. 4, 24-31 (2002).</li><li>Katakia, Y. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ex+vivo+model+for+studying+endothelial+tip+cells:+Revisiting+the+classical+aortic-ring+assay.">Ex vivo model for studying endothelial tip cells: Revisiting the classical aortic-ring assay.</a> Microvascular Research. 128, 103939 (2020).</li><li>Rezzola, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+and+ex+vivo+retina+angiogenesis+assays.">In vitro and ex vivo retina angiogenesis assays.</a> Angiogenesis. 17 (3), 429-442 (2014).</li><li>Rezzola, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+ex+vivo+murine+retina+angiogenesis+(EMRA)+assay.">A novel ex vivo murine retina angiogenesis (EMRA) assay.</a> Experimental Eye Research. 112, 51-56 (2013).</li><li>Shao, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Choroid+sprouting+assay:+an+ex+vivo+model+of+microvascular+angiogenesis.">Choroid sprouting assay: an ex vivo model of microvascular angiogenesis.</a> PLoS One. 8 (7), 69552 (2013).</li><li>Tomita, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Free+fatty+acid+receptor+4+activation+protects+against+choroidal+neovascularization+in+mice.">Free fatty acid receptor 4 activation protects against choroidal neovascularization in mice.</a> Angiogenesis. 23, 385-394 (2020).</li><li>Li, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+TWIST1+promotes+pathological+ocular+angiogenesis.">Endothelial TWIST1 promotes pathological ocular angiogenesis.</a> Investigative Ophthalmology and Vision Science. 55 (12), 8267-8277 (2014).</li><li>Liu, C. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+microRNA-150+is+an+intrinsic+suppressor+of+pathologic+ocular+neovascularization.">Endothelial microRNA-150 is an intrinsic suppressor of pathologic ocular neovascularization.</a> Proceedings of the National Academy of Science U. S. A. 112 (39), 12163-12168 (2015).</li><li>Zhou, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LncEGFL7OS+regulates+human+angiogenesis+by+interacting+with+MAX+at+the+EGFL7/miR-126+locus.">LncEGFL7OS regulates human angiogenesis by interacting with MAX at the EGFL7/miR-126 locus.</a> Elife. 8, 40470 (2019).</li><li>Kobayashi, S., Fukuta, M., Kontani, H., Yanagita, S., Kimura, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+quantitative+assay+for+angiogenesis+of+cultured+choroidal+tissues+in+streptozotocin-diabetic+Wistar+and+spontaneously+diabetic+GK+rats.">A quantitative assay for angiogenesis of cultured choroidal tissues in streptozotocin-diabetic Wistar and spontaneously diabetic GK rats.</a> Japanese Journal of Pharmacology. 78 (4), 471-478 (1998).</li><li>Kobayashi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibitory+effects+of+tetrandrine+and+related+synthetic+compounds+on+angiogenesis+in+streptozotocin-diabetic+rodents.">Inhibitory effects of tetrandrine and related synthetic compounds on angiogenesis in streptozotocin-diabetic rodents.</a> Biological and Pharmaceutical Bulletin. 22 (4), 360-365 (1999).</li><li>Kobayashi, S., Shinohara, H., Tsuneki, H., Nagai, R., Horiuchi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=N(epsilon)-(carboxymethyl)lysine+proliferated+CD34(+)+cells+from+rat+choroidal+explant+in+culture.">N(epsilon)-(carboxymethyl)lysine proliferated CD34(+) cells from rat choroidal explant in culture.</a> Biological and Pharmaceutical Bulletin. 27 (9), 1382-1387 (2004).</li><li>Kobayashi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overproduction+of+N(epsilon)-(carboxymethyl)lysine-induced+neovascularization+in+cultured+choroidal+explant+of+streptozotocin-diabetic+rat.">Overproduction of N(epsilon)-(carboxymethyl)lysine-induced neovascularization in cultured choroidal explant of streptozotocin-diabetic rat.</a> Biological and Pharmaceutical Bulletin. 27 (10), 1565-1571 (2004).</li><li>Bergers, G., Song, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+pericytes+in+blood-vessel+formation+and+maintenance.">The role of pericytes in blood-vessel formation and maintenance.</a> Neuro-Oncology. 7 (4), 452-464 (2005).</li><li>Browning, A. C., Stewart, E. A., Amoaku, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reply+to:+Phenotypic+plasticity+of+human+umbilical+vein+endothelial+cells.">Reply to: Phenotypic plasticity of human umbilical vein endothelial cells.</a> British Journal of Ophthalmology. 96 (9), 1275-1276 (2012).</li></ol>

El ensayo coral de brotes ayuda a la investigación en NEOvascular AMD9,10,18,19,20. Los explantes de coroide se pueden aislar de ratones, así como ratas y humanos17,21. El explanto coroides incluye ECs, macrófagos y pericitos17. En este ensayo la interacción entre las CE cor...

La desregulación de la angiogénesis coroidal se asocia con la degeneración macular neovascular relacionada con la edad (AMD)1. La coroides es un lecho microvascular presente debajo del epitelio pigmentario de la retina (RPE). Se ha demostrado que la reducción del flujo sanguíneo en la coroides se asocia con la progresión de AMD2. La intrincada relación entre el endotelio vascular, RPE, macrófagos, pericitos y otras células es responsable de la homeostasis del tejido3,4,5. Por lo tanto, un ensayo reproducible que modela el microambiente coroideo es fundamental para el estudio de la DMAE neovascular.
Los ensayos de angiogénesis ex vivo y los cultivos celulares endoteliales in vitro pueden complementar los estudios del comportamiento microvascular in vivo, para la prueba de nuevos fármacos y para estudios de patogénesis. Células endoteliales tales como células endoteliales microvasculares de la retina humana (HRMEC), células endoteliales de vena umbilical humana (HUVEC), cerebro animal primario aislado o EC de la retina se utilizan a menudo en estudios in vitro para la investigación de la angiogénesis ocular6,7,8. Los HDH, en particular, se han utilizado ampliamente como modelo de neovascularización coroidal in vitro (CNV)9 mediante la evaluación de la proliferación endotelial, la migración, la formación tubular y la fuga vascular para evaluar las intervenciones6,10. Sin embargo, las CE en el cultivo son limitadas como modelo de CNV debido a la falta de interacciones con otros tipos de células que se encuentran en la coroides y porque la mayoría de las CE utilizadas en estos ensayos no se originan en la coroides. Las ECs coroideales de ratón son difíciles de aislar y mantener en el cultivo.
El ensayo de anillo aórtico es ampliamente utilizado como un modelo de proliferación macro vascular. Los brotes vasculares de explantes aórticos incluyen ECs, pericitos y macrófagos11. El ensayo de anillo aórtico modela bien de angiogénesis de vasos grandes12,13,14. Sin embargo, tiene limitaciones como modelo de neovascularización coroidal ya que los anillos aórticos son un tejido macrovascular que carece del entorno microvascular coroidal característico, y los brotes de grandes vasos pueden diferir de los brotes de redes capilares implicadas en la patología microvascular. Recientemente un grupo publicó un ensayo de retina ex vivo15,16. Aunque, es adecuado para la enfermedad neovascular de la retina, no es tan apropiado para la neovascularización coroidal como se ve en la DMAE.
El ensayo coral de brotación utilizando RPE de ratón, tejido coroides y explantado escleral fue desarrollado para modelar mejor el CNV. El tejido se puede aislar fácilmente de los ojos de ratón (u otras especies)17. Este ensayo permite una evaluación reproducible del potencial pro y anti-angiogénico de los compuestos farmacológicos y la evaluación del papel de vías específicas en la neovascularización coroidacional utilizando tejido de ratones modificados genéticamente y controles18. Este ensayo coral de brotación ha sido referenciado en muchas publicaciones posteriores9,10,18,19,20. Aquí se demuestra el método implicado en el uso de este ensayo.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>AnaSed (Xylazine)</td>
			<td>AKORN</td>
			<td>59339-110-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Basal membrane extract (BME) Matrigel</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>354230</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture dish</td>
			<td>NEST</td>
			<td>704001</td>
			<td>10cm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Complete classic medium with serum and CultureBoost</td>
			<td>Cell systems</td>
			<td>4Z0-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethyl alcohol 200 Proof</td>
			<td>Pharmco</td>
			<td>111000200</td>
			<td>use for 70%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kimwipes</td>
			<td>Kimberly-Clark</td>
			<td>06-666</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope</td>
			<td>ZEISS</td>
			<td>Axio Observer Z1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>15140</td>
			<td>10000 U/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue culture plate (24-well)</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>25-107</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VetaKet CIII (Ketamine)</td>
			<td>AKORN</td>
			<td>59399-114-10</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an ex vivo choroid sprouting assay of ocular microvascular angiogenesis

La angiogénesis coroidal patológica, una característica destacada de la degeneración macular relacionada con la edad, conduce a un deterioro de la visión y ceguera. Los ensayos de proliferación de células endoteliales (EC) que utilizan células endoteliales microvasculares de retina humana (HRMEC) o EC de retina primaria aisladas se utilizan ampliamente en modelos in vitro para estudiar la angiogénesis retiniana. Sin embargo, aislar las células endoteliales de la retina murina pura es técnicamente difícil y las CE de la retina pueden tener diferentes respuestas de proliferación que las células endoteliales coroidales y diferentes interacciones celulares/células. Se desarrolló un ensayo de brotación coroidacional ex vivo altamente reproducible como modelo de proliferación microvascular coroidal. Este modelo incluye la interacción entre la vasculatura coroides (EC, macrófagos, pericitos) y el epitelio pigmentario de la retina (RPE). Los explantes de RPE/coroide/escleral de ratón se aíslan e incuban en el extracto de membrana basal (BME) con factor de crecimiento reducido (BME) (día 0). El medio se cambia cada dos días y la brotación coroides se cuantifica en el día 6. Las imágenes de la explanta de coroides individuales se toman con un microscopio de fase invertida y el área de brotación se cuantifica utilizando un macro plug-in semiautomático para el software ImageJ desarrollado en este laboratorio. Este ensayo de brotación coroidal ex vivo reproducible se puede utilizar para evaluar compuestos para el tratamiento potencial y para la investigación de enfermedades microvasculares para evaluar las vías implicadas en la proliferación de micro vasos coroidacionales utilizando tejido de ratón de tipo salvaje y modificado genéticamente.

Comparación del crecimiento de brotes de coroides por día
Diseccionamos la coroides con esclerótica, incrustada en BME y la cultivamos durante 6 días(Figura 1). El coroides que brota en ratones C57BL/6J desde el día 3 hasta el día 6 fueron examinados con un microscopio y cuantificados con SWIFT-Choroid un método de cuantificación semiautomático en ImageJ. En un caso representativo, la zona de brotación coroidal (los vasos que se extiende...

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An Ex Vivo Choroid Sprouting Assay of Ocular Microvascular Angiogenesis

Este protocolo presenta el ensayo de brotación coroides, un modelo ex vivo de proliferación microvascular. Este ensayo se puede utilizar para evaluar las vías implicadas en la proliferación de micro vasos corooidales y evaluar los tratamientos farmacológicos utilizando tejido de ratón de tipo salvaje y modificado genéticamente.

Un ensayo ex vivo de brotes de coroides de angiogénesis microvascular ocular

Pathological choroidal angiogenesis, a salient feature of age-related macular degeneration, leads to vision impairment and blindness. Endothelial cell ...

Research

JoVE Journal

Biology

Christopher Hughes:  An in vitro model for the Study of Angiogenesis (Interview)

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Christopher Hughes: un modelo in vitro para el estudio de la angiogénesis (Entrevista)

Christopher C.W. Hughes describes the utility of his culture system for studying angiogenesis in vitro.  He explains the importance of fibroblasts that ...

Investigación

Biología

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Optimizado de gel de fibrina bolas de ensayo para el Estudio de la angiogénesis

Angiogenesis is a complex multi-step process, where, in response to angiogenic stimuli, new vessels are created from the existing vasculature.  These ...

Ex vivo Mechanical Loading of Tendon

Ex vivo Carga mecánica del tendón

Injuries to the tendon (e.g., wrist tendonitis, epicondyltis) due to overuse are common in sports activities and the workplace.  Most are associated with ...

Rat Mesentery Angiogenesis Assay

Rata mesenterio ensayo angiogénesis

The adult rat mesentery window angiogenesis assay is biologically appropriate and is exceptionally well suited to the 
study of sprouting angiogenesis in ...

A System for ex vivo Culturing of Embryonic Pancreas

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