Name: live imaging of chemokine receptors in zebrafish neutrophils during wound responses
Uploaded: 2020-12-04T13:30:00
Duration: 6 min 48 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Live Imaging of Chemokine Receptors in Zebrafish Neutrophils During Wound Responses at JoVE.com

نشكر كريستين هولت وبيل هاريس على المساعدة في الفحص المجهري البؤري. نشكر دارين غيلمور على تركيبات العمود الفقري لمؤقت الفلورسنت وآنا هوتنلوتشر على ناقل العمود الفقري Tol2-Lyz. نشكر ستيف رينشو على خط Tg (mpx: GFP) i114 . وقد دعم هذا العمل مركز البحوث والبحوث (MR/L019523/1)، وصندوق ويلكوم الاستئماني [204845/Z/16/Z]؛ إسحاق نيوتن ترست [12.21 (أ)i] ومنحة إسحاق نيوتن ترست 19.23 (ن). C.C. بدعم من منحة MRC DTP وجزئيا من قبل Wellcome Trust [204845/Z/16/Z]؛ إسحاق نيوتن ترست [12.21 (أ)i] منحة. تم دعم H.W. من قبل MRC DTP Studentship. تم دعم H.P. من خلال منحة الدكتوراه Wellcome Trust (105391/Z/14/Z) وجزئيا من قبل Wellcome Trust [204845/Z/16/Z]؛ منحة إسحاق نيوتن ترست [12.21 (أ)i] و MRC (MR/L019523/1).

<ol>
	<li>Rot, A., von Andrian, U. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemokines+in+innate+and+adaptive+host+defense:+basic+chemokinese+grammar+for+immune+cells.">Chemokines in innate and adaptive host defense: basic chemokinese grammar for immune cells.</a> Annual Review of Immunology. 22, 891-928 (2004).</li><li>Cotton, M., Claing, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=G+protein-coupled+receptors+stimulation+and+the+control+of+cell+migration.">G protein-coupled receptors stimulation and the control of cell migration.</a> Cellular Signalling. 21 (7), 1045-1053 (2009).</li><li>Liu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bidirectional+regulation+of+neutrophil+migration+by+mitogen-activated+protein+kinases.">Bidirectional regulation of neutrophil migration by mitogen-activated protein kinases.</a> Nature Immunology. 13 (5), 457-464 (2012).</li><li>Wen, X., Jin, T., Xu, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+G+Protein-coupled+Receptor-mediated+Chemotaxis+and+its+Signaling+Events+in+Neutrophil-like+HL60+Cells.">Imaging G Protein-coupled Receptor-mediated Chemotaxis and its Signaling Events in Neutrophil-like HL60 Cells.</a> Journal of Visualized Experiments. (115), e54511 (2016).</li><li>Arnon, T. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GRK2-dependent+S1PR1+desensitization+is+required+for+lymphocytes+to+overcome+their+attraction+to+blood.">GRK2-dependent S1PR1 desensitization is required for lymphocytes to overcome their attraction to blood.</a> Science. 333 (6051), 1898-1903 (2011).</li><li>Jung, H., Mithal, D. S., Park, J. E., Miller, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Localized+CCR2+Activation+in+the+Bone+Marrow+Niche+Mobilizes+Monocytes+by+Desensitizing+CXCR4.">Localized CCR2 Activation in the Bone Marrow Niche Mobilizes Monocytes by Desensitizing CXCR4.</a> PloS One. 10 (6), 0128387 (2015).</li><li>Kwan, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Tol2kit:+a+multisite+gateway-based+construction+kit+for+Tol2+transposon+transgenesis+constructs.">The Tol2kit: a multisite gateway-based construction kit for Tol2 transposon transgenesis constructs.</a> Developmental Dynamics: An Official Publication of the American Association of Anatomists. 236 (11), 3088-3099 (2007).</li><li>Don&#224;, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directional+tissue+migration+through+a+self-generated+chemokine+gradient.">Directional tissue migration through a self-generated chemokine gradient.</a> Nature. 503 (7475), 285-289 (2013).</li><li>Venkiteswaran, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+and+dynamics+of+an+endogenous,+self-generated+signaling+gradient+across+a+migrating+tissue.">Generation and dynamics of an endogenous, self-generated signaling gradient across a migrating tissue.</a> Cell. 155 (3), 674-687 (2013).</li><li>Minina, S., Reichman-Fried, M., Raz, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+receptor+internalization,+signaling+level,+and+precise+arrival+at+the+target+in+guided+cell+migration.">Control of receptor internalization, signaling level, and precise arrival at the target in guided cell migration.</a> Current Biology. 17 (13), 1164-1172 (2007).</li><li>Yoo, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+microtubules+in+neutrophil+polarity+and+migration+in+live+zebrafish.">The role of microtubules in neutrophil polarity and migration in live zebrafish.</a> Journal of Cell Science. 125, 5702-5710 (2012).</li><li>Yoo, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+regulation+of+protrusion+and+polarity+by+PI3K+during+neutrophil+motility+in+live+zebrafish.">Differential regulation of protrusion and polarity by PI3K during neutrophil motility in live zebrafish.</a> Developmental Cell. 18 (2), 226-236 (2010).</li><li>Buchan, K. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+transgenic+zebrafish+line+for+in+vivo+visualisation+of+neutrophil+myeloperoxidase.">A transgenic zebrafish line for in vivo visualisation of neutrophil myeloperoxidase.</a> PLoS One. 14 (4), 0215592 (2019).</li><li>Coombs, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemokine+receptor+trafficking+coordinates+neutrophil+clustering+and+dispersal+at+wounds+in+zebrafish.">Chemokine receptor trafficking coordinates neutrophil clustering and dispersal at wounds in zebrafish.</a> Nature Communications. 10 (1), 5166 (2019).</li><li>Hall, C., Flores, M. V., Storm, T., Crosier, K., Crosier, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+zebrafish+lysozyme+C+promoter+drives+myeloid-specific+expression+in+transgenic+fish.">The zebrafish lysozyme C promoter drives myeloid-specific expression in transgenic fish.</a> BMC Developmental Biology. 7, 42 (2007).</li><li>Renshaw, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+transgenic+zebrafish+model+of+neutrophilic+inflammation.">A transgenic zebrafish model of neutrophilic inflammation.</a> Blood. 108 (13), 3976-3978 (2006).</li><li>Khmelinskii, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tandem+fluorescent+protein+timers+for+in+vivo+analysis+of+protein+dynamics.">Tandem fluorescent protein timers for in vivo analysis of protein dynamics.</a> Nature Biotechnology. 30 (7), 708-714 (2012).</li><li>Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The zebrafish book. A guide for the laboratory use of zebrafish (Brachydanio rerio). , (2007).</li><li>Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microinjection+of+Zebrafish+Embryos+to+Analyze+Gene+Function.">Microinjection of Zebrafish Embryos to Analyze Gene Function.</a> Journal of Visualized Experiments. (25), 1115 (2009).</li><li>Detrich, H. W., Zon, L. I., Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Zebrafish: Genetics, Genomics and Informatics. , (2004).</li><li>Le Guyader, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Origins+and+unconventional+behavior+of+neutrophils+in+developing+zebrafish.">Origins and unconventional behavior of neutrophils in developing zebrafish.</a> Blood. 111 (1), 132-141 (2008).</li><li>Chan, T. F., Vese, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Active+contours+without+edges.">Active contours without edges.</a> IEEE Transactions on Image Processing. 10 (2), 266-277 (2001).</li><li>Haralick, R. M., Shanmugam, K., Dinstein, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Textural+features+for+image+Classification.">Textural features for image Classification.</a> IEEE Transactions on Systems, Man, and Cybernetics. SMC-3 (6), 610-621 (1973).</li><li>Deng, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Localized+bacterial+infection+induces+systemic+activation+of+neutrophils+through+Cxcr2+signaling+in+zebrafish.">Localized bacterial infection induces systemic activation of neutrophils through Cxcr2 signaling in zebrafish.</a> Journal of Leukocyte Biology. 93 (5), 761-769 (2013).</li><li>Torraca, V., Mostowy, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+infection:+From+pathogenesis+to+cell+biology.">Zebrafish infection: From pathogenesis to cell biology.</a> Trends in Cell Biology. 28 (2), 143-156 (2018).</li><li>Feng, Y., Santoriello, C., Mione, M., Hurlstone, A., Martin, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+imaging+of+innate+immune+cell+sensing+of+transformed+cells+in+zebrafish+larvae:+parallels+between+tumor+initiation+and+wound+inflammation.">Live imaging of innate immune cell sensing of transformed cells in zebrafish larvae: parallels between tumor initiation and wound inflammation.</a> PLoS Biology. 8 (12), 1000562 (2010).</li><li>Poplimont, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+swarming+in+damaged+tissue+is+orchestrated+by+connexins+and+cooperative+calcium+alarm+signals.">Neutrophil swarming in damaged tissue is orchestrated by connexins and cooperative calcium alarm signals.</a> Current Biology. 30 (14), 2761-2776.e7 (2020).</li><li>Cornet, C., Di Donato, V., Terriente, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combining+Zebrafish+and+CRISPR/Cas9:+Toward+a+more+efficient+drug+discovery+pipeline.">Combining Zebrafish and CRISPR/Cas9: Toward a more efficient drug discovery pipeline.</a> Frontiers in Pharmacology. 9, 703 (2018).</li><li>Kienle, K., L&#228;mmermann, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+swarming:+an+essential+process+of+the+neutrophil+tissue+response.">Neutrophil swarming: an essential process of the neutrophil tissue response.</a> Immunological Reviews. 273 (1), 76-93 (2016).</li><li>Lisse, T. S., Brochu, E. A., Rieger, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Capturing+tissue+repair+in+zebrafish+larvae+with+time-lapse+brightfield+stereomicroscopy.">Capturing tissue repair in zebrafish larvae with time-lapse brightfield stereomicroscopy.</a> Journal of Visualized Experiments. (95), e52654 (2015).</li></ol>

ويعلن صاحبا البلاغ عدم وجود تضارب في المصالح

تسمح الطريقة الموصوفة بالتصوير الحي لديناميات المستقبلات استجابة للروابط الداخلية في الموقع أثناء الاستجابة الالتهابية لتلف الأنسجة. يمكن توسيع استخدام مراسلات العدلات Cxcr1 / Cxcr2 ليشمل إعدادات فسيولوجية أخرى ، مثل العدوى أو نماذج الأورام أو أنواع أخرى من تلف الأنسجة14،25،26،27. بالإضافة إلى ذلك، يمكن أن توفر خطوط الإنقاذ المعدلة وراثيا، التي يتم فيها قمع المستقبل الداخلي وإنقاذه بواسطة مستقبل متحور خارجي، أدوات مفيدة لتشريح أهمية أنماط هجرة العدلات المحددة في الاستجابات المناعية. على سبيل المثال ، تسبب طفرات مستقبلات Cxcr1 التي أضعفت إزالة الحساسية تجمعا أكثر بروزا في العدلات في المواقع الالتهابية14. يمكن استخدام هذا الكسب من النمط الظاهري الوظيفي لفهم دور تجمع العدلات في العمليات الفسيولوجية المختلفة ، على سبيل المثال ، إصلاح الجروح ، والأمراض المعدية ، أو تطور الورم ، واستكمال تجارب الضربة القاضية / الضربة القاضية للمستقبلات. وتوفر المنهجية أيضا أساسا لتوسيع نطاق المراسلين المتاحين. من المهم النظر في اختيار مراسل الفلورسنت ويعتمد على السؤال البيولوجي. وجدنا أن معدل الدوران التأسيسي لمستقبلات الكيموكين هذه في العدلات كان مرتفعا ، مقارنة بالخلايا الظهارية ، وأن المراسلين ذوي النضج السريع (على سبيل المثال ، sfGFP) كانوا مطالبين بالإبلاغ عن مستويات الغشاء في حالة ثابتة وحل الاختلافات حول تحفيز العدلات 8,14. وبالتالي ، فإن نسب الغشاء من sfGFP / tagRFP لا تنطبق على قياس الاستيعاب الناجم عن الليغاند في هذا النوع من الخلايا ، ولكن نمط tagRFP يسمح بتتبع المصائر داخل الخلايا للمستقبل ، والتي قد تكون مفيدة في بعض الدراسات. وجدنا أيضا أن الإشارة داخل الخلايا الأكثر تركيزا من tagRFP مفيدة لفحص اليرقات الفردية. وهناك نهج بديل لقياس مستويات المستقبلات في غشاء البلازما يتمثل في التعبير المشترك عن علامة غشاء الفلورسنت في العدلات إما في نفس الجين المحور9 أو في الجين14 المستقل المتحول. في السيناريو الأول ، سيوفر الجين المحور وسيلة إضافية لفحص الأسماك وستكون مستويات التعبير قابلة للمقارنة بين العلامة والمستقبل. سيكون النهج الأخير أكثر معيارية ، حيث يمكن دمج خط الزرد مع مراسل مستقبلات مع خطوط مراسل مختلفة. في كلتا الحالتين ، تجدر الإشارة إلى أن تحديد كمية الغشاء لمستويات المستقبلات يمثل تحديا في العدلات العنقودية (انظر أدناه). وأخيرا، نلاحظ أن التمديد المحتمل لهذا البروتوكول هو متابعة التصوير الحي بواسطة الكيمياء النسيجية المناعية لإجراء تحليلات توطين أكثر تفصيلا.
نظام Tol2 transgenesis راسخ7 وتم استخدام مروج الليزوزيم C على نطاق واسع للتعبير عن العدلات11,15. وبالتالي ، فإن نهج التكوين المتبادل مباشر نسبيا ومستوى التعبير الذي تم تحقيقه مع هذا المروج مرتفع بما يكفي لتوفير تباين كاف لتحليل ديناميكيات المستقبلات. أحد القيود المحتملة هو أن مستوى التعبير لا يلخص مستويات التعبير عن المستقبلات الذاتية. ويمكن نشر تقنيات كريسبر الجديدة لإنشاء خطوط غير مباشرة للمستقبلات ذات الأهمية الخاصة28. لا تزال هذه التقنيات مرهقة وقد لا تضمن مستويات التعبير المطلوبة للتصوير تحت الخلوي ، لكن تطويرها الناجح سيكون اختراقا مهما لفهم ديناميكيات الإشارات الذاتية. تعد عمليات التحقق الوظيفية مهمة لتفسير البيانات باستخدام تركيبات المستقبلات المعدلة وراثيا. على سبيل المثال ، يمكن استخدام اختبارات التعرف على الليغاند لإثبات أن بروتين الاندماج الفلوري وظيفي ويمكن استخدام إنقاذ الأنماط الظاهرية بالضربة القاضية لإثبات أن مستويات التعبير العدلة المعدلة وراثيا متوافقة مع الوظيفة14. وأخيرا، فإن الطريقة الأكثر مباشرة للتحقق من صحة اندماج المستقبلات هي استخدام اختبار وظيفي في المختبر مع مستقبلات موسومة إلى جانب الإصدارات14 غير المصنفة.
يعالج نهج القياس الكمي صعوبات محددة في تجزئة الأغشية الدقيقة في العدلات في الجسم الحي. في الخلايا ذات الطبيعة الظهارية ، يمكن تنفيذ القياس الكمي لمستويات المستقبلات تلقائيا عن طريق تطبيع مستويات مستقبلات الغشاء إلى علامة تحكم ، والتي يمكن التعبير عنها جنبا إلى جنب أو بشكل منفصل9. في الواقع ، لقد طبقنا مثل هذا النهج ، عند استخدام اختبار التعرف على الليغاند في أجنة المعدة14. ومع ذلك ، تخضع العدلات لتغيرات معقدة وسريعة في شكل الخلية في الجسم الحي ، مما يجعل تجزئة الغشاء صعبة في كل من 2D و 3D14. هذا أكثر تحديا عندما تتجمع العدلات ، والتي تحدث في العديد من الإعدادات الفسيولوجية29. يتغلب مقياس التباين على هذا القيد لأنه لا يتطلب تجزئة الغشاء ولكنه يعكس بدلا من ذلك الحالة العامة لتوزيع المستقبلات في الخلية (غشائية / ناعمة مقابل حويصلة / نقطة). من المهم ملاحظة أن مقياس التباين يمكن أن يتأثر بالتباين الكلي للصورة ، لذلك يلزم تطبيع قيم الخلايا الفردية إلى مرجع داخلي لحساب تباين الإشارة في الأجنة / العينات المختلفة. على سبيل المثال، استخدمنا متوسط قيمة تباين الخلايا للعدلات غير المستجيبة في CHT (أي العدلات التي تظل ثابتة ولا تهاجر إلى الزعنفة البطنية)14. وهناك احتمال إضافي يتمثل في التطبيع مع قيم التباين لعلامة تحكم في نفس الخلية. وهذا من شأنه أن يوفر حلا عندما لا يتوفر مرجع داخلي للخلايا غير المستجيبة وقد يحل على الأرجح الاختلافات الكمية الدقيقة في ديناميكيات المستقبلات بين الظروف المختلفة.
موقع التصوير هو متغير آخر يجب مراعاته. سبب اختيار جرح الزعنفة البطنية هنا ، على عكس نموذج جرح زعنفة الذيل الأكثر استخداما16,30 ، هو أن موقع الجرح قريب من موقع إقامة العدلات / أصل الهجرة. هذا يسرع الجدول الزمني للفحص ، حيث يستغرق الأمر وقتا قليلا نسبيا حتى تصل العدلات. بالإضافة إلى ذلك ، فإنه يوفر الفرصة لالتقاط سلوك الخلية في كل من أصل الهجرة (CHT) والموقع المستهدف للاهتمام (الجرح). هذا مهم هنا ، لأن الدقة المكانية والزمانية المطلوبة للتصوير تحت الخلوي يصعب دمجها مع مجال رؤية كبير أو مسح ضوئي متعدد المواضع. وبالتالي ، فإن فحص جرح الزعنفة البطنية يسمح بتتبع تطور استجابة الهجرة من أصل الهجرة والتقاط تقلبات المستقبلات غير المحددة في الخلايا التي لا تستجيب في وقت واحد. وكما ذكر أعلاه، فإن هذا الأخير مفيد لأغراض القياس الكمي لأنه يوفر مرجعا داخليا للديناميات غير المحددة. وفي نظم أخرى، قد لا يكون من الممكن الحصول على مثل هذا المرجع الداخلي، وفي هذه الحالة توفر قيم التباين لعلامة غشاء مشتركة التعبير عنها تحكما بديلا.
وباختصار، نتوقع أن تكون المنهجية قابلة للتطبيق على النظم الأخرى ويمكن نشرها لأغراض متنوعة. على سبيل المثال ، يمكن استخدام نفس المراسلين في إعدادات التهابية أخرى ، مثل إعدادات العدوى أو نماذج الأمراض الأخرى. يمكن توسيع ذخيرة خطوط مراسل مستقبلات الزرد إلى مستقبلات إشارات أخرى ، لفهم آليات الإشارة أو الإبلاغ عن ديناميكيات الليغاند في الجسم الحي. يمكن الجمع بين هذا النهج وتقنيات الضربة القاضية / الضربة القاضية لاستجواب الأساس الميكانيكي للديناميكيات المرصودة. على سبيل المثال ، يمكن أن يشير اضطراب تعبير الرباط إلى اعتماد الليغاند على ديناميكيات المستقبلات المرصودة. وفي المستقبل، نتوخى أن يتم زيادة صقل النظام ليشمل الإدخال غير المباشر للمراسلين. وفي نهاية المطاف، فإن النتائج التي تستخدم هذه المنهجية من شأنها أن توفر رؤى جديدة قيمة تتجاوز مجتمع أسماك الزرد، بالنظر إلى الحفاظ على مستقبلات الإشارات هذه في الثدييات والتحدي النسبي المتمثل في إجراء هذه الدراسات على الكائنات الحية الأكبر.

هجرة الكريات البيض لها أهمية قصوى للاستجابات المناعية. الخلايا المناعية هي خلايا مهاجرة نموذجية ، وهي قادرة بشكل ملحوظ على عبور الأنسجة والأوعية الدموية واستشعار مجموعة من إشارات التوجيه الكيميائي للهجرة في الاتجاه نحو الميكروبات أو الخلايا المضيفة الأخرى ذات الأهمية. يعتمد التوجيه الصحيح على التعرف على الجاذبات الكيميائية ، من بينها الكيموكينات التي تمثل الفئة1 الأبرز. يتم التعرف على الكيموكينات من خلال مستقبلات محددة للغاية من البروتين G عبر الغشاء المقترن. عند ربط الكيموكين ، تغير مستقبلات الكيموكين التشكيل مما يؤدي إلى تنشيط بروتينات G الثلاثية المرتبطة بها وانفصالها إلى وحدات فرعية وظيفية للإشارة تعزز التغيرات الهيكلية الخلوية والهجرة الموجهة1. ثانيا ، يتم فسفور مستقبلات الكيموكين ، ويؤدي هذا التعديل إلى إزالة الحساسية إلى الجاذب ، والذي يمكن أن يتبعه إعادة تحسس / إعادة تدوير سريعة أو تدهور داخل الخلايا وخفض التنظيم من سطح الخلية2. تؤثر ديناميكيات المستقبلات هذه على مدة وجرعة الإشارات التي تتلقاها الخلايا ولكن من الصعب توضيح كيفية تأثيرها على سلوك هجرة الكريات البيض في الجسم الحي.
يواجه تتبع ديناميكيات المستقبلات في الكريات البيض الحية في أنظمة الثدييات التقليدية العديد من التحديات. بالنسبة للدراسات الحية ، يجب التعبير عن اندماج المستقبلات مع البروتينات الفلورية في الخلايا. هذا أمر صعب في الكريات البيض الأولية ، وخاصة في العدلات ، وقد استخدمت الدراسات حتى الآن خطوط خلايا العدلات البديلة للتعبير عن مستقبلات الكيموكين 3,4. إن توليد نماذج الفئران المعدلة وراثيا ، التي تعبر فيها الكريات البيض عن مستقبلات الفلورسنت أو المستقبلات المتحولة ذات عيوب الاتجار بالمعلومات 5,6 ، يستلزم استثمارا كبيرا في الوقت والموارد. حتى في هذه الحالات ، يمكن أن تكون دقة التصوير والتباين لديناميكيات مستقبلات التصوير في الحيوان الحي محدودة وقد استخدمت الدراسات الكيمياء النسيجية المناعية على أقسام الأنسجة الثابتة5. وبالنظر إلى هذه التحديات التقنية، فإن فهمنا لكيفية تأثير ديناميكيات مستقبلات الجاذبات الكيميائية على سلوك الخلايا في بيئة الأنسجة الحية محدود حاليا.
هنا نقدم منهجية لرصد الاتجار بالمستقبلات في عدلات أسماك الزرد. الزرد قابل للسحب وراثيا ، مثل الفئران ، ولكن التحول أكثر وضوحا نسبيا من خلال استخدام أنظمة transposon الفعالة والتلاعب المباشر بالزيجوت7. اليرقة الشفافة قابلة للتصوير بشكل مثالي. تم تصور ديناميكيات مستقبلات الكيموكين في الخلايا الجرثومية البدائية والخط الجانبي البدائي من خلال التعبير عن الانصهارات المقابلة مع مراسلي الفلورسنت8،9،10. تم تجهيز يرقات أسماك الزرد بالعدلات الناضجة التي لها خصائص وراثية وخلوية محفوظة للغاية فيما يتعلق بالعدلات الثديية. تم تصور ديناميكيات الإشارات تحت الخلوية مثل ديناميكيات الهيكل الخلوي ومنظمات القطبية في هذه الخلايا عن طريق توليد خطوط معدلة وراثيا مقابلة11،12،13. في الآونة الأخيرة ، قمنا بتصور وتحليل ديناميكيات مستقبلات الكيموكين وظيفيا في العدلات أثناء الاستجابات الالتهابية لتلف الأنسجة14. هنا ، نصف توليد خطوط المراسل المعدلة وراثيا لإشارات الكيموكين في العدلات ، وإعداد الأجنة للتصوير الحي ، وفحص الجرح لدراسة إشارات العدلات وبروتوكول الحصول على الصور وتحليلها. كما نقدم بروتوكولا جانبيا لاختبار استجابات مستقبلات الكيموكين للروابط المرشحة ، وهو أمر مفيد عند محاولة إنشاء أنماط التعرف على الليغاند في المستقبلات غير المميزة. يمكن استخدام هذه التقنيات بالاقتران مع المزيد من التلاعب الجيني ، مثل تثبيط تعبير الكيموكين الداخلي أو توليد المستقبلات المتحولة مع الاتجار المتغير الناجم عن الرباط ، لاستجواب كيفية تأثير ديناميكيات الإشارات المحددة على سلوك الكريات البيض في الجسم الحي. يمكن أيضا استخدام الخطوط المعدلة وراثيا التي تعبر عن مستقبلات الكيموكين الموسومة بالفلورسنت كمراسلين لتدرجات الكيموكين الذاتية المنشأ ، والتي يصعب اكتشافها عن طريق تلطيخ الأجسام المضادة المباشر. توفر المنهجية الموصوفة مجالا لتوسيع نطاق توليد المراسلين ليشمل مستقبلات أخرى للإشارات المناعية.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>1-phenyl-2-thiourea</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P7629-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50mL CellStar Centrifuge Tube</td>
			<td>Grenier Bio-One Limited</td>
			<td>210270</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clark capillary glass</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>30-0020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cleanline Thin Bleach</td>
			<td>Scientific Laboratory Supplies</td>
			<td>CLE0301</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting scope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>SMZ645</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dri Block heater</td>
			<td>Techne</td>
			<td>FDB02AD</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiji</td>
			<td>National Institutes of Health, Bethesda, MD</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps, Jewelers Dumont No. 5</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F6521</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass bottom microwell dishes</td>
			<td>MatTek</td>
			<td>P35G-1.5-14-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass pasteur pipette</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>11795098</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Invitrogen Ambion mMESSAGE mMACHINE SP6 Transcription Kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>10391175</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica SP8 confocal microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low melting point agarose</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>16520-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic stand</td>
			<td>Narishige</td>
			<td>GJ-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MATLAB</td>
			<td>The MathWorks, Inc., Natick, MA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methylene blue</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M9140-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgSO4</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M-2643</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microinjection system</td>
			<td>Parker</td>
			<td>Picospritzer III</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microloader pipette tips</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5242956003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micromanipulator</td>
			<td>Narishige</td>
			<td>M-152</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette Puller</td>
			<td>Sutter Instrument Company</td>
			<td>Flaming/Brown P-97</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope slide</td>
			<td>Thermo-Scientific</td>
			<td>J1800AMNZ</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PerkinElmer Spinning Disk UltraVIEW ERS, Olympus IX81 spinnng disk confocal microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish (120mm)</td>
			<td>Grenier Bio-One Limited</td>
			<td>632180</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenol red</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P0290-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly(A) Tailing Kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM1350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prism</td>
			<td>GraphPad Software</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Small paintbrush</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectral Applied Research LMM5 laser module</td>
			<td></td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical Scalpel Blade No. 23</td>
			<td>Swann-Morton</td>
			<td>233-5528</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tricaine MS222</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E10521-50G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Volocity software</td>
			<td></td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yokogawa CSU10 spinning disc confocal scanner</td>
			<td>Yokogawa</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

live imaging of chemokine receptors in zebrafish neutrophils during wound responses

توجيه الكريات البيض عن طريق التدرجات الكيميائية ضروري للاستجابات المناعية. العدلات هي الخلايا الأولى التي يتم تجنيدها إلى مواقع تلف الأنسجة حيث تقوم بتنفيذ وظائف حاسمة مضادة للميكروبات. يتم تنظيم الاتجار بهم إلى هذه المواقع من قبل العديد من الجاذبات الكيميائية الالتهابية ، بما في ذلك chemokines. على المستوى الجزيئي ، يتم تنظيم إشارات الجاذب الكيميائي من خلال الاتجار داخل الخلايا للمستقبلات المقابلة. ومع ذلك ، لا يزال من غير الواضح كيف تؤثر التغيرات تحت الخلوية في مستقبلات الكيموكين على ديناميكيات هجرة الكريات البيض على مستوى الخلايا والأنسجة. هنا نصف منهجية للتصوير الحي والتحليل الكمي لديناميكيات مستقبلات الكيموكاين في العدلات أثناء الاستجابات الالتهابية لتلف الأنسجة. وقد كشفت هذه الأدوات أن الاتجار بمستقبلات الكيموكين التفاضلية في عدلات أسماك الزرد ينسق تجمع العدلات وتشتتها في مواقع تلف الأنسجة. هذا له آثار على فهمنا لكيفية حل الاستجابات الالتهابية ذاتيا. ويمكن استخدام الأدوات الموصوفة لفهم أنماط هجرة العدلات في مجموعة متنوعة من البيئات الفسيولوجية والمرضية، ويمكن توسيع نطاق المنهجية لتشمل مستقبلات إشارات أخرى.

يتبع جرح الزعنفة البطنية تعبئة العدلات السريعة من CHT إلى الزعنفة البطنية والتجمع على هامش الجرح ، في غضون 30-60 دقيقة (الشكل 1). لقد تصورنا توزيع اثنين من مستقبلات الكيموكين ، Cxcr1 و Cxcr2 ، والتي يتم التعبير عنها بواسطة عدلات الزرد24 والتعرف على Cxcl8a و Cxcl8b14 ، باستخدام المجهر البؤري للقرص الغزل. لقد أنشأنا خطين معدلين وراثيا مطابقين ، Tg (lyz: Cxcr1-FT) و Tg (lyz: Cxcr2-FT) ، حيث تعبر العدلات عن بناء مؤقت الفلورسنت (FT) للمستقبل ، أي اندماج مع ترادف من sfGFP و tagRFP (الشكل 2 والمرجع14). كان الهدف من استخدام اثنين من الفلوروفورات هو السماح بمراقبة مجموعة واسعة من مصائر المستقبلات وتقديم تقديرات لوقت دوران البروتين في غشاء البلازما ، حيث أن المستقبلات المركبة حديثا سوف تتألق باللون الأخضر وتصبح حمراء تدريجيا مع تقدم عمرهافي 8,14. ومع ذلك ، فقد وجد أن هذه المستقبلات لها دوران تأسيسي سريع في غشاء البلازما العدلة وأن وقت الإقامة كان أقصر من وقت نضج tagRFP ، حيث أظهر sfGFP توطين الغشاء و tagRFP يظهر توطين الحويصلات في حالة ثابتة (الفيديو التكميلي 1 والمرجع14). لذلك ، ركزنا على توزيع sfGFP لمراقبة الاستيعاب الناجم عن الليغاند في مواقع تلف الأنسجة. تم تحديد نمط توزيع المستقبلات كميا باستخدام مقياس التباين ، الذي يبلغ عن الاختلافات في الكثافة بين وحدات البكسل المجاورة. الأساس المنطقي هو أنه عندما يكون توزيع المستقبلات غشائيا وسلسا ، تكون قيمة التباين منخفضة. عندما يكون توزيع المستقبلات حويصليا وأكثر ثقبا ، تكون قيمة التباين عالية (الشكل 3).
وهناك طريقة بديلة تتمثل في تحديد نسبة مستويات المستقبلات (شدة sfGFP) على مستويات علامة غشاء التحكم مثل غشاء CFP (mCFP) (الشكل 3). يمكن لكلتا الطريقتين اكتشاف استيعاب المستقبلات ، كما هو موضح في نمط توزيع المستقبلات الحويصلية على مستوى العالم في الخلية (قيمة تباين أعلى) أو انخفاض مستويات المستقبلات في الغشاء (انخفاض نسبة sfGFP / mCFP). ومع ذلك، يمكن لمقياس التباين أيضا الكشف عن استيعاب المستقبلات في مجموعات العدلات عند الجرح، حيث يكون تجزئة الغشاء أقل دقة وغير قابلة للتطبيق (الشكل 3). باستخدام هذا المقياس، تمكنا من تحديد الاختلافات المرئية بين Cxcr1 و Cxcr2 في الاتجار بالعدلات عند الجروح (الشكل 4 والفيديو التكميلي 2). Cxcr1-FT داخليا في الخلايا الموجودة في الجرح بينما ظل Cxcr2-FT غشائيا في العدلات عند الجرح (الشكل 4A-C ، الفيديو التكميلي 2 والفيديو التكميلي 3). قمع Cxcl8a و Cxcl8b ، من خلال العلاج المورفولينو ، يؤثر بشكل تفاضلي على استيعاب Cxcr1-FT في الجروح (الشكل 4C ، D). لمزيد من التحقق من أن Cxcr1-FT يستجيب ل Cxcl8a ، أجرينا اختبارات استجابة chemokine في الأجنة المبكرة. وجدنا أن Cxcr1-FT تم استيعابه بشكل ملحوظ في الأجنة التي تم فيها التعبير عن Cxcl8a بشكل مشترك (الشكل 5). تشير هذه النتائج إجمالا إلى أنه يمكن نشر الطرق الموصوفة لقياس استيعاب المستقبلات التي يسببها الكيموكين في العدلات وتحديد هوية الليغاند الذي يتوسط في هذه الآثار.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61679/61679fig01.jpg"> الشكل 1: هجرة العدلات إلى جروح الزعانف البطنية. (أ) (يسار) رسم كاريكاتوري ليرقة 3 dpf يوضح موقع النسيج المكون للدم الذيلي (CHT) ، والدورة الدموية في الزهرة (VC ، الأزرق) ، والزعنفة البطنية (VF) وموقع الجرح. (يمين) رسم كاريكاتوري يصور منطقة الجرح (W) مع العدلات التي يتم تعبئتها من CHT وتتجمع عند الجرح. يتم رسم الضفيرة الوريدية الذيلية (CVP) لأنسجة CHT باللون الأزرق. (ب) صورة المجال الساطع (يسار) والإسقاط البؤري (يمين) تظهر جرح الزعنفة البطنية وتوزيع العدلات في يرقات Tg (mpx: GFP) عند 2 ساعة بعد الجرح. تظهر الخطوط المتقطعة الخطوط العريضة VF و CHT. شريط المقياس = 25 ميكرومتر. صورة كرتونية وفلورسنت معدلة من المرجع 14 (http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61679/61679fig01large.jpg" target="_blank">يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61679/61679fig02.jpg"> الشكل 2: التصوير الحي للاتجار بمستقبلات الكيموكين في العدلات. (أ) التركيبات المستخدمة للتعبير الوراثي الخاص بالعدلات ل Cxcr1-FT (مؤقت الفلورسنت) و Cxcr2-FT. الإسقاطات البؤرية للعدلات في رأس يرقة معدلة وراثيا 3 dpf (Tg(lyz:Cxcr1-FT) ، أعلى ؛ Tg(lyz:Cxcr2-FT)، أسفل) تعرض قنوات tRFP (أرجواني) وsfGFP (أخضر). شريط المقياس = 20 ميكرومتر (ب) مخطط تشريحي من يرقة 3 dpf كما في الشكل 1A. أسفل اليرقة توجد مخططات تصور منطقة الجرح (W) مع العدلات التي يتم تعبئتها من CHT (أعلى) أو إجراء التاكسي الكيميائي عند دخول الزعنفة البطنية (أسفل). يشير المربع المتقطع إلى المساحة التي تم تصويرها في لقطات على اليمين. (ج) العدلات في يرقات Tg(lyz:Cxcr1-FT) (يظهر sfGFP) عند التعبئة من CHT (الألواح العلوية) أو التاكسي الكيميائي نحو الجرح (الألواح السفلية). تعرض الأسهم الخلايا نفسها بمرور الوقت. النقاط الزمنية على الصورة اليمنى هي دقائق منقضية بعد الصورة على اليسار. شريط المقياس = 10 ميكرومتر (D) التمثيل التخطيطي للنهج التجريبي للتصوير الحي للاتجار بمستقبلات الكيموكين. () عدلت اللوحات من ألف إلى جيم من المرجع 14 (http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61679/61679fig02large.jpg" target="_blank">يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61679/61679fig03.jpg"> الشكل 3: أمثلة كمية لديناميكيات المستقبلات. تم تقسيم العدلات المفردة (الزرقاء) أو العنقودية (الخضراء) عند الجروح أو العدلات غير المعبأة في CHT (الأحمر والبرتقالي) وتحليلها بطرق مختلفة لمقارنة النتائج. تم تحليل نفس الخلايا النموذجية المعروضة بطريقتين لربط ما يظهر في الصورة بنطاق القيم المستخرجة. (أ) تم تقسيم سطح الخلايا النموذجية المختارة استنادا إلى تعريف الكفاف في قناة sfGFP. (ب) تم حساب التباين من الخلايا النموذجية الموضحة في A. (C) تم تقسيم غشاء الخلايا النموذجية المختارة بناء على تعريف الكفاف في قناة CFP. وتبع ذلك تحليل نسبي ل sfGFP / CFP. (د) تم حساب نسبة sfGFP/CFP على الخلايا النموذجية المبينة في C. تمثل أشرطة الخطأ S.E.M. من الخلايا الفردية، وفي حالات n>1، لم تستخدم القيم هنا للتحليل الإحصائي ولكن فقط لتجسيد القياسات التي تم الحصول عليها باستخدام طرق القياس الكمي المختلفة. شريط المقياس = 10 ميكرومتر. () عدل الشكل من المرجع 14 (http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61679/61679fig03large.jpg" target="_blank">يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61679/61679fig04v2.jpg"> الشكل 4: الديناميات التفاضلية ل Cxcr1 و Cxcr2 استجابة للجرح. (أ) الإسقاط البؤري للعدلات في يرقات Tg(lyz:Cxcr1-FT) أو Tg(lyz:Cxcr2-FT) عند الجرح في 80 دقيقة بعد الجرح (قناة sfGFP المعروضة). شريط المقياس = 10 ميكرومتر.  (ب) عدلة Cxcr1-FT مكبرة (يسار) و Cxcr2-FT (يمين) عند الجرح. يظهر المستقبل الأخضر باللون الرمادي. شريط المقياس = 5 ميكرومتر (C) التباين الطبيعي (التباين لكل عدلة فردية يتم تطبيعه إلى متوسط تباين الخلايا غير المعبأة في CHT). يشير cxcl8a إلى حقن حجب الوصلة مع مورفولينو مانع للترجمة ل cxcl8a. يشير cxcl8b إلى الحقن باستخدام مورفولينو مانع للوصلة ل cxcl8b. بالنسبة ل Tg(lyz:Cxcr1-FT): n = 24 خلية (CHT) ، n = 47 خلية (جرح) من 8 يرقات. بالنسبة ل Tg (lyz: Cxcr1-FT) مع المورفولينوهات: n = 28 خلية (Cxcl8a-MO) من 5 يرقات ، n = 16 خلية (Cxcl8b-MO) من 5 يرقات. بالنسبة ل Tg(lyz:Cxcr2-FT): n = 10 خلايا (CHT) و n = 20 خلية (جرح) من 3 يرقات. تم تجميع البيانات من يرقات مستقلة تم الحصول عليها في 1-5 جلسات تصوير. اختبار Kruskal-Wallis مع اختبار المقارنات المتعددة من Dunn ل Tg (lyz: Cxcr1-FT) ، اختبار Mann-Whitney غير المقترن ثنائي الذيل ل Tg (lyz: Cxcr2-FT). (د) الإسقاط البؤري للعدلات في اليرقات المعدلة وراثيا Tg(lyz:Cxcr1-FT) المعالجة ب cxcl8a morpholino (MO) (يسار) و cxcl8b MO (يمين) استجابة لجروح الزعانف (قناة sfGFP الموضحة باللون الأخضر). لقطة تم التقاطها في نقاط زمنية لتراكم العدلات المكافئة (85 دقيقة بعد الجرح في الصورة اليسرى و 45 دقيقة بعد الجرح في الصورة اليمنى). شريط المقياس = 10 ميكرومتر. () عدل الشكل من المرجع 14 (http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61679/61679fig04large.jpg" target="_blank">يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61679/61679fig05.jpg"> الشكل 5: فحص استجابة الكيموكين في الأجنة المبكرة. تم حقن شرائح متحدة البؤرة للمسح الضوئي بالليزر من الأجنة المعدة التي تظهر التعبير عن وتوزيع Cxcr1-FT. 100 pg من Cxcr1-FT mRNA في بيض واحد في مرحلة الخلية مع أو بدون 150 pg Cxcl8a mRNA. تظهر المستقبلات الخضراء والحمراء في قنوات منفصلة. تظهر علامة CFP غشاء التحكم (mCFP) في القناة السماوية. شريط المقياس = 20 ميكرومتر. () عدل الشكل من المرجع 14 (http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61679/61679fig05large.jpg" target="_blank">يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>
الفيلم التكميلي 1: العدلات المعدلة وراثيا في رأس يرقة Tg(lyz:Cxcr1-FT) (يسار) و Tg(lyz:Cxcr2-FT) (يمين) عند 3 dpf. sfGFP (أخضر)، tagRFP (أرجواني). الفاصل الزمني للإطار هو 30 ثانية ومعدل الإطارات هو 5 إطارات في الثانية. شريط المقياس = 20 ميكرومتر. ينشأ الفيديو من المرجع 14 (http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/). <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61679/Supplementary_Movie1.avi" target="_blank">يرجى النقر هنا لتنزيل هذا الفيديو.</a>
الفيلم التكميلي 2: العدلات في Tg(lyz:Cxcr1-FT) (يسار) و Tg (lyz:Cxcr2-FT) (يمين) يرقات معدلة وراثيا تستجيب لجروح الزعانف. يبدأ الفيلم في غضون 10 دقائق بعد الجرح ويستمر لمدة 60 دقيقة. sfGFP (أخضر) ، tagRFP (أرجواني). الفاصل الزمني للإطار هو 30 ثانية ومعدل الإطارات هو 10 إطارات في الثانية. CHT = الأنسجة المكونة للدم الذيلي. VF = الزعنفة البطنية. شريط المقياس = 25 ميكرومتر. ينشأ الفيديو من المرجع 14 (http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/). <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61679/Supplementary_Movie2.avi" target="_blank">يرجى النقر هنا لتنزيل هذا الفيديو.</a>
الفيلم التكميلي 3. أمثلة إضافية على العدلات من يرقة معدلة وراثيا Tg(lyz:Cxcr1- FT) مصابة (يرقة مختلفة عن تلك الموضحة في الفيديو 2) ، تم الحصول عليها بدقة أعلى ، تظهر استيعاب المستقبلات (قناة sfGFP الموضحة باللون الأخضر) عند التعبئة في CHT أو عند الدخول و chemotaxis في الزعنفة البطنية. الفاصل الزمني للإطار هو 30 ثانية ومعدل الإطارات هو 2 إطارا في الثانية. شريط المقياس = 10 ميكرومتر. ينشأ الفيديو من المرجع 14 (http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/). <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61679/Supplementary_Movie3.avi" target="_blank">يرجى النقر هنا لتنزيل هذا الفيديو.</a>
الملف التكميلي 1: <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61679/Supplementary%20file%201.m" target="_blank">يرجى الضغط هنا لتحميل هذا الملف.</a>
الملف التكميلي 2: <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61679/Supplementary%20file%202.m" target="_blank">يرجى الضغط هنا لتحميل هذا الملف.</a>
الملف التكميلي 3: <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61679/Supplementary%20file%203.m" target="_blank">يرجى النقر هنا لتنزيل هذا الملف.</a>
الملف التكميلي 4: <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61679/Supplementary%20file%204.m" target="_blank">يرجى النقر هنا لتنزيل هذا الملف.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Live Imaging of Chemokine Receptors in Zebrafish Neutrophils During Wound Responses at JoVE.com

Live Imaging of Chemokine Receptors in Zebrafish Neutrophils During Wound Responses

هنا نصف بروتوكولات إجراء التصوير الحي والتحليل الكمي لديناميكيات مستقبلات الجاذب الكيميائي في عدلات أسماك الزرد

التصوير الحي لمستقبلات الكيموكين في عدلات الزرد أثناء استجابات الجرح

Leukocyte guidance by chemical gradients is essential for immune responses. Neutrophils are the first cells to be recruited to sites of tissue damage ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

In vivo Imaging of Transgenic Leishmania Parasites in a Live Host

In vivo Imaging of Transgenic Leishmania Parasites in a Live Host

في الجسم الحي التصوير الطفيليات الليشمانية المعدلة وراثيا في مضيف لايف

Distinct species of Leishmania, a protozoan parasite of the family Trypanosomatidae, typically cause different human disease manifestations. The most ...

Retroviral Transduction of T-cell Receptors in Mouse T-cells

تنبيغ من فيروسات تي خلية المستقبلات في الخلايا التائية ماوس

T-cell receptors (TCRs) play a central role in the immune system. TCRs on T-cell surfaces can specifically recognize peptide antigens presented by antigen ...

Non-invasive Imaging of Disseminated Candidiasis in Zebrafish Larvae

غير الغازية التصوير من المبيضات المنتشر في يرقات اسماك الزرد

Disseminated candidiasis caused by the pathogen Candida albicans is a clinically important problem in hospitalized individuals and is associated with a 30 ...

Visualization of Bacterial Toxin Induced Responses Using Live Cell Fluorescence Microscopy

تصور الردود السم البكتيري المستحثة عن طريق لايف مضان المجهري الخليوي

Bacterial toxins bind to cholesterol in membranes, forming pores that allow for leakage of cellular contents and influx of materials from the external ...

Real-time Imaging of Heterotypic Platelet-neutrophil Interactions on the Activated Endothelium During Vascular Inflammation and Thrombus Formation in Live Mice

في الوقت الحقيقي التصوير من التفاعلات صفائح الدم، العدلات غيروي على البطانة الوعائية التهاب المنشط خلال تشكيل خثرة في والفئران الحية

Interaction of activated platelets and leukocytes (mainly neutrophils) on the activated endothelium mediates thrombosis and vascular inflammation.1,2 ...

Characterization of Inflammatory Responses During Intranasal Colonization with Streptococcus pneumoniae

Characterization of Inflammatory Responses During Intranasal Colonization with Streptococcus pneumoniae

توصيف الاستجابات الالتهابية خلال الاستعمار داخل الشرج مع الالتهاب الرئوي العقدي

Nasopharyngeal colonization by Streptococcus pneumoniae is a prerequisite to invasion to the lungs or bloodstream1. This organism is capable of colonizing ...

Imaging Neutrophils and Monocytes in Mesenteric Veins by Intravital Microscopy on Anaesthetized Mice in Real Time

التصوير العدلات وحيدات في مساريقي الأوردة التي كتبها حيوي داخلي المجهري على الفئران مخدرة في الوقت الحقيقي

Efficient immune response is dependent on rapid mobilization of blood leukocytes to the site of infection or injury. Investigating leukocyte migration in ...

Measuring Physiological Responses of Drosophila Sensory Neurons to Lipid Pheromones Using Live Calcium Imaging

Measuring Physiological Responses of Drosophila Sensory Neurons to Lipid Pheromones Using Live Calcium Imaging

قياس الاستجابات الفسيولوجية لل<em&gt; ذبابة الفاكهة</em&gt; الخلايا العصبية الحسية إلى الدهن الفيرومونات عن طريق لايف التصوير الكالسيوم

Unlike mammals, insects such as Drosophila have multiple taste organs. The chemosensory neurons on the legs, proboscis, wings and ovipositor of Drosophila ...

Live Imaging of Antifungal Activity by Human Primary Neutrophils and Monocytes in Response to A. fumigatus

Live Imaging of Antifungal Activity by Human Primary Neutrophils and Monocytes in Response to A. fumigatus

التصوير المباشر لآخر مضاد من قبل العدلات الإنسان الأساسية وحيدات في الاستجابة لل<em&gt; A. فوميجاتوس</em

Aspergillus fumigatus is an opportunistic fungal pathogen causing invasive infections in immunocompromised hosts with a high case-fatality rate. Research ...