Name: live imaging of chemokine receptors in zebrafish neutrophils during wound responses
Uploaded: 2020-12-04T13:30:00
Duration: 6 min 48 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Live Imaging of Chemokine Receptors in Zebrafish Neutrophils During Wound Responses at JoVE.com

Vi takker Christine Holt og Bill Harris for hjælp med konfokalmikroskopi. Vi takker Darren Gilmour for de fluorescerende timer-rygradskonstruktioner og Anna Huttenlocher for Tol2-Lyz-rygradsvektoren. Vi takker Steve Renshaw for Tg(mpx:GFP)i114-linjen . Dette arbejde blev støttet af MRC (MR/L019523/1), Wellcome Trust [204845/Z/16/Z]; Isaac Newton Trust [12.21(a)i] og et Isaac Newton Trust-tilskud 19.23(n). C.C. blev støttet af et MRC DTP-studieopmål og delvist af Wellcome Trust [204845/Z/16/Z]; Isaac Newton Trust [12.21(a)i] tilskud. H.W. blev støttet af et MRC DTP Studentship. H.P. blev støttet af et Wellcome Trust ph.d.-stipendium (105391/Z/14/Z) og dels af en Wellcome Trust [204845/Z/16/Z]; Isaac Newton Trust [12.21(a)i] tilskud og MRC (MR/L019523/1).

<ol>
	<li>Rot, A., von Andrian, U. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemokines+in+innate+and+adaptive+host+defense:+basic+chemokinese+grammar+for+immune+cells.">Chemokines in innate and adaptive host defense: basic chemokinese grammar for immune cells.</a> Annual Review of Immunology. 22, 891-928 (2004).</li><li>Cotton, M., Claing, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=G+protein-coupled+receptors+stimulation+and+the+control+of+cell+migration.">G protein-coupled receptors stimulation and the control of cell migration.</a> Cellular Signalling. 21 (7), 1045-1053 (2009).</li><li>Liu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bidirectional+regulation+of+neutrophil+migration+by+mitogen-activated+protein+kinases.">Bidirectional regulation of neutrophil migration by mitogen-activated protein kinases.</a> Nature Immunology. 13 (5), 457-464 (2012).</li><li>Wen, X., Jin, T., Xu, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+G+Protein-coupled+Receptor-mediated+Chemotaxis+and+its+Signaling+Events+in+Neutrophil-like+HL60+Cells.">Imaging G Protein-coupled Receptor-mediated Chemotaxis and its Signaling Events in Neutrophil-like HL60 Cells.</a> Journal of Visualized Experiments. (115), e54511 (2016).</li><li>Arnon, T. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GRK2-dependent+S1PR1+desensitization+is+required+for+lymphocytes+to+overcome+their+attraction+to+blood.">GRK2-dependent S1PR1 desensitization is required for lymphocytes to overcome their attraction to blood.</a> Science. 333 (6051), 1898-1903 (2011).</li><li>Jung, H., Mithal, D. S., Park, J. E., Miller, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Localized+CCR2+Activation+in+the+Bone+Marrow+Niche+Mobilizes+Monocytes+by+Desensitizing+CXCR4.">Localized CCR2 Activation in the Bone Marrow Niche Mobilizes Monocytes by Desensitizing CXCR4.</a> PloS One. 10 (6), 0128387 (2015).</li><li>Kwan, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Tol2kit:+a+multisite+gateway-based+construction+kit+for+Tol2+transposon+transgenesis+constructs.">The Tol2kit: a multisite gateway-based construction kit for Tol2 transposon transgenesis constructs.</a> Developmental Dynamics: An Official Publication of the American Association of Anatomists. 236 (11), 3088-3099 (2007).</li><li>Don&#224;, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directional+tissue+migration+through+a+self-generated+chemokine+gradient.">Directional tissue migration through a self-generated chemokine gradient.</a> Nature. 503 (7475), 285-289 (2013).</li><li>Venkiteswaran, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+and+dynamics+of+an+endogenous,+self-generated+signaling+gradient+across+a+migrating+tissue.">Generation and dynamics of an endogenous, self-generated signaling gradient across a migrating tissue.</a> Cell. 155 (3), 674-687 (2013).</li><li>Minina, S., Reichman-Fried, M., Raz, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+receptor+internalization,+signaling+level,+and+precise+arrival+at+the+target+in+guided+cell+migration.">Control of receptor internalization, signaling level, and precise arrival at the target in guided cell migration.</a> Current Biology. 17 (13), 1164-1172 (2007).</li><li>Yoo, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+microtubules+in+neutrophil+polarity+and+migration+in+live+zebrafish.">The role of microtubules in neutrophil polarity and migration in live zebrafish.</a> Journal of Cell Science. 125, 5702-5710 (2012).</li><li>Yoo, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+regulation+of+protrusion+and+polarity+by+PI3K+during+neutrophil+motility+in+live+zebrafish.">Differential regulation of protrusion and polarity by PI3K during neutrophil motility in live zebrafish.</a> Developmental Cell. 18 (2), 226-236 (2010).</li><li>Buchan, K. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+transgenic+zebrafish+line+for+in+vivo+visualisation+of+neutrophil+myeloperoxidase.">A transgenic zebrafish line for in vivo visualisation of neutrophil myeloperoxidase.</a> PLoS One. 14 (4), 0215592 (2019).</li><li>Coombs, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemokine+receptor+trafficking+coordinates+neutrophil+clustering+and+dispersal+at+wounds+in+zebrafish.">Chemokine receptor trafficking coordinates neutrophil clustering and dispersal at wounds in zebrafish.</a> Nature Communications. 10 (1), 5166 (2019).</li><li>Hall, C., Flores, M. V., Storm, T., Crosier, K., Crosier, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+zebrafish+lysozyme+C+promoter+drives+myeloid-specific+expression+in+transgenic+fish.">The zebrafish lysozyme C promoter drives myeloid-specific expression in transgenic fish.</a> BMC Developmental Biology. 7, 42 (2007).</li><li>Renshaw, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+transgenic+zebrafish+model+of+neutrophilic+inflammation.">A transgenic zebrafish model of neutrophilic inflammation.</a> Blood. 108 (13), 3976-3978 (2006).</li><li>Khmelinskii, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tandem+fluorescent+protein+timers+for+in+vivo+analysis+of+protein+dynamics.">Tandem fluorescent protein timers for in vivo analysis of protein dynamics.</a> Nature Biotechnology. 30 (7), 708-714 (2012).</li><li>Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The zebrafish book. A guide for the laboratory use of zebrafish (Brachydanio rerio). , (2007).</li><li>Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microinjection+of+Zebrafish+Embryos+to+Analyze+Gene+Function.">Microinjection of Zebrafish Embryos to Analyze Gene Function.</a> Journal of Visualized Experiments. (25), 1115 (2009).</li><li>Detrich, H. W., Zon, L. I., Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Zebrafish: Genetics, Genomics and Informatics. , (2004).</li><li>Le Guyader, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Origins+and+unconventional+behavior+of+neutrophils+in+developing+zebrafish.">Origins and unconventional behavior of neutrophils in developing zebrafish.</a> Blood. 111 (1), 132-141 (2008).</li><li>Chan, T. F., Vese, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Active+contours+without+edges.">Active contours without edges.</a> IEEE Transactions on Image Processing. 10 (2), 266-277 (2001).</li><li>Haralick, R. M., Shanmugam, K., Dinstein, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Textural+features+for+image+Classification.">Textural features for image Classification.</a> IEEE Transactions on Systems, Man, and Cybernetics. SMC-3 (6), 610-621 (1973).</li><li>Deng, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Localized+bacterial+infection+induces+systemic+activation+of+neutrophils+through+Cxcr2+signaling+in+zebrafish.">Localized bacterial infection induces systemic activation of neutrophils through Cxcr2 signaling in zebrafish.</a> Journal of Leukocyte Biology. 93 (5), 761-769 (2013).</li><li>Torraca, V., Mostowy, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+infection:+From+pathogenesis+to+cell+biology.">Zebrafish infection: From pathogenesis to cell biology.</a> Trends in Cell Biology. 28 (2), 143-156 (2018).</li><li>Feng, Y., Santoriello, C., Mione, M., Hurlstone, A., Martin, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+imaging+of+innate+immune+cell+sensing+of+transformed+cells+in+zebrafish+larvae:+parallels+between+tumor+initiation+and+wound+inflammation.">Live imaging of innate immune cell sensing of transformed cells in zebrafish larvae: parallels between tumor initiation and wound inflammation.</a> PLoS Biology. 8 (12), 1000562 (2010).</li><li>Poplimont, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+swarming+in+damaged+tissue+is+orchestrated+by+connexins+and+cooperative+calcium+alarm+signals.">Neutrophil swarming in damaged tissue is orchestrated by connexins and cooperative calcium alarm signals.</a> Current Biology. 30 (14), 2761-2776.e7 (2020).</li><li>Cornet, C., Di Donato, V., Terriente, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combining+Zebrafish+and+CRISPR/Cas9:+Toward+a+more+efficient+drug+discovery+pipeline.">Combining Zebrafish and CRISPR/Cas9: Toward a more efficient drug discovery pipeline.</a> Frontiers in Pharmacology. 9, 703 (2018).</li><li>Kienle, K., L&#228;mmermann, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+swarming:+an+essential+process+of+the+neutrophil+tissue+response.">Neutrophil swarming: an essential process of the neutrophil tissue response.</a> Immunological Reviews. 273 (1), 76-93 (2016).</li><li>Lisse, T. S., Brochu, E. A., Rieger, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Capturing+tissue+repair+in+zebrafish+larvae+with+time-lapse+brightfield+stereomicroscopy.">Capturing tissue repair in zebrafish larvae with time-lapse brightfield stereomicroscopy.</a> Journal of Visualized Experiments. (95), e52654 (2015).</li></ol>

Forfatterne erklærer ingen interessekonflikt

Den beskrevne metode tillader levende billeddannelse af receptordynamik som reaktion på endogene ligander in situ under et inflammatorisk respons på vævsskade. Brugen af Cxcr1/Cxcr2 neutrofile indberettere kan udvides til andre fysiologiske indstillinger, såsom infektion, tumormodeller eller andre former for vævsskade 14,25,26,27. Derudover kan transgene redningslinjer, hvor den endogene receptor undertrykkes og reddes af en eksogen mutantreceptor, give nyttige værktøjer til at dissekere betydningen af specifikke neutrofile migrationsmønstre i immunresponser. For eksempel forårsager Cxcr1-receptormutanter, der har nedsat desensitisering, mere fremtrædende neutrofil klyngedannelse på inflammatoriske steder14. Denne gevinst af funktion fænotype kan bruges til at forstå neutrofilmenighedens rolle i forskellige fysiologiske processer, f.eks. sårreparation, infektionssygdom eller tumorudvikling og komplementere receptor knockdown / knockout-eksperimenter. Metoden giver også grundlag for at udvide rækken af tilgængelige indberettere. Valget af fluorescerende reporter er vigtigt at overveje og afhænger af det biologiske spørgsmål. Vi fandt ud af, at den konstitutive omsætning af disse kemokinreceptorer i neutrofiler var høj sammenlignet med epitelceller, og at journalister med hurtig modning (f.eks. sfGFP) var forpligtet til at rapportere membranniveauer i stabil tilstand og løse forskelle ved neutrofilstimulering 8,14. Således er membranforholdet mellem sfGFP / tagRFP ikke anvendeligt til måling af ligandinduceret internalisering i denne celletype, men mønsteret af tagRFP tillader sporing af receptorens intracellulære skæbner, hvilket kan være nyttigt i nogle undersøgelser. Vi fandt også, at det mere koncentrerede intracellulære signal fra tagRFP er nyttigt til screening af individuelle larver. En alternativ metode til måling af receptorniveauer ved plasmamembranen ville være at co-udtrykke en fluorescerende membranmarkør i neutrofiler enten i det samme transgen9 eller i et uafhængigt transgen14. I førstnævnte scenarie ville transgenet udgøre et yderligere middel til screening af fiskene, og ekspressionsniveauerne ville være sammenlignelige mellem markøren og receptoren. Sidstnævnte tilgang ville være mere modulær, idet en zebrafiskelinje med en receptorreporter kunne kombineres med forskellige reporterlinjer. I begge tilfælde er det værd at bemærke, at membrankvantificering af receptorniveauerne er udfordrende i klyngede neutrofiler (se nedenfor). Endelig bemærker vi, at en mulig udvidelse af denne protokol ville være at følge op på den levende billeddannelse ved hjælp af immunhistokemi for mere detaljerede lokaliseringsanalyser.
Tol2-transgenesesystemet er veletableret7, og lysozym C-promotoren er blevet anvendt i vid udstrækning til neutrofilekspression11,15. Transgenesetilgangen er derfor relativt ligetil, og ekspressionsniveauet opnået med denne promotor er højt nok til at give tilstrækkelig kontrast til analyse af receptordynamik. En mulig begrænsning er, at ekspressionsniveauet ikke rekapitulerer endogene receptorekspressionsniveauer. Nye CRISPR-teknologier kan anvendes til at etablere knock-in-linjer for receptorer af særlig interesse28. Disse teknologier er stadig besværlige og garanterer muligvis ikke de krævede ekspressionsniveauer for subcellulær billeddannelse, men deres vellykkede udvikling ville være et vigtigt gennembrud for forståelsen af endogen signaldynamik. Funktionelle valideringer er vigtige for fortolkning af data med transgene receptorkonstruktioner. For eksempel kan ligandgenkendelsesassays bruges til at fastslå, at det fluorescerende fusionsprotein er funktionelt, og redning af knockout-fænotyper kan bruges til at fastslå, at de transgene neutrofile ekspressionsniveauer er kompatible med funktionalitet14. Endelig ville en mere direkte måde at validere receptorfusionen på være at anvende et in vitro-funktionelt assay med mærket receptor sammen med ikke-mærkede versioner14.
Kvantificeringsmetoden adresserer specifikke vanskeligheder med nøjagtig membransegmentering i neutrofiler in vivo. I celler af epitelmæssig karakter kan kvantificering af receptorniveauer udføres automatisk ved at normalisere membranreceptorniveauer til en kontrolmarkør, som kan udtrykkes i tandem eller separat9. Faktisk har vi anvendt en sådan tilgang, når vi bruger ligandgenkendelsesassayet i gastrulerende embryoner14. Imidlertid gennemgår neutrofiler komplekse, hurtige ændringer i celleform in vivo, hvilket gør membransegmenteringen vanskelig både i 2D og 3D14. Dette er endnu mere udfordrende, når neutrofiler klynger sig, hvilket forekommer i mange fysiologiske omgivelser29. Kontrastmetrikken overvinder denne begrænsning, da den ikke kræver membransegmentering, men i stedet afspejler den overordnede tilstand af receptorfordeling i cellen (membranøs / glat vs vesikulær / prikket). Det er vigtigt at bemærke, at kontrastmetrik kan påvirkes af billedets overordnede kontrast, så normalisering af individuelle celleværdier til en intern reference er nødvendig for at tage højde for signalets variabilitet i forskellige embryoner / prøver. For eksempel brugte vi den gennemsnitlige cellekontrastværdi af ikke-responsive neutrofiler i CHT (dvs. neutrofiler, der forbliver stationære og ikke migrerer ind i den ventrale fin)14. En yderligere mulighed ville være at normalisere med kontrastværdier af en kontrolmarkør i samme celle. Dette ville give en løsning, når en intern reference af ikke-responderende celler ikke er tilgængelig og kan sandsynligvis løse finere kvantitative forskelle i receptordynamik mellem forskellige forhold.
Placeringen af billeddannelse er en anden variabel at overveje. Årsagen til at vælge det ventrale finnesår her, i modsætning til den mere almindeligt anvendte halefinnesårmodel16,30, er fordi sårstedet ligger i nærheden af stedet for neutrofil bopæl / migrerende oprindelse. Dette fremskynder tidslinjen for analysen, da det tager relativt lidt tid for neutrofiler at ankomme. Derudover giver det mulighed for at fange celleadfærd både ved migrationsoprindelsen (CHT) og målplaceringen af interesse (såret). Dette er relevant her, fordi den rumlige og tidsmæssige opløsning, der kræves til subcellulær billeddannelse, er vanskelig at kombinere med et stort synsfelt eller scanning med flere positioner. Således tillader det ventrale finsårassay sporing af udviklingen af det migrerende respons fra migrationsoprindelsen og samtidig indfangning af uspecifikke receptorudsving i celler, der ikke reagerer. Som nævnt ovenfor er sidstnævnte nyttig til kvantificeringsformål, da den giver en intern reference for uspecifik dynamik. I andre systemer er det muligvis ikke muligt at have en sådan intern reference, i hvilket tilfælde kontrastværdierne for en co-udtrykt membranmarkør ville give en alternativ kontrol.
Sammenfattende forventer vi, at metoden kan anvendes på andre systemer og kan implementeres til en række forskellige formål. For eksempel kan de samme journalister bruges i andre inflammatoriske indstillinger, såsom infektionsindstillinger eller andre sygdomsmodeller. Repertoiret af zebrafiskreceptor reporterlinjer kunne udvides til andre signalreceptorer for at forstå signalmekanismer eller rapportere liganddynamik in vivo. Tilgangen kan kombineres med knockdown/knockout teknikker til at forhøre det mekanistiske grundlag for observeret dynamik. For eksempel kan forstyrrelse af ligandekspression indikere ligandafhængigheden for observeret receptordynamik. I fremtiden forestiller vi os, at systemet kan forbedres yderligere for at indarbejde indsættelse af journalister. I sidste ende vil resultater, der bruger denne metode, give ny indsigt, der er værdifuld ud over zebrafiskesamfundet, i betragtning af bevarelsen af disse signalreceptorer hos pattedyr og den relative udfordring ved at gennemføre disse undersøgelser i større organismer.

Leukocytmigration er af afgørende betydning for immunresponser. Immunceller er prototypiske vandrende celler, som er bemærkelsesværdigt i stand til at krydse væv og blodkar og fornemme en række kemiske vejledningssignaler for at migrere retningsbestemt mod mikrober eller andre værtsceller af betydning. Korrekt vejledning er afhængig af anerkendelse af kemotiltrentriva, blandt hvilke kemokiner repræsenterer den mest fremtrædende kategori1. Kemokiner genkendes af meget specifikke syv-transmembranE G-proteinkoblede receptorer. Ved kemokinbinding ændrer kemokinreceptorer konformation, hvilket fører til aktivering af associerede trimere G-proteiner og deres dissociation i funktionelle signalunderenheder, der fremmer cytoskeletale ændringer og rettet migration1. Sekundært fosforyleres kemokinreceptorer, og denne modifikation fører til desensibilisering over for tiltrækningsmiddel, som kan efterfølges af hurtig resensibilisering /genanvendelse eller intracellulær nedbrydning og nedregulering fra celleoverfladen2. Disse receptordynamikker påvirker varigheden og dosis af signalering modtaget af cellerne, men hvordan de påvirker leukocytmigrationsadfærd har været vanskeligt at belyse in vivo.
Sporing af receptordynamik i levende leukocytter i traditionelle pattedyrssystemer står over for flere udfordringer. Til levende undersøgelser skal receptorfusioner med fluorescerende proteiner udtrykkes i cellerne. Dette er udfordrende i primære leukocytter, især i neutrofiler, og undersøgelser har hidtil brugt surrogatnetrofile cellelinjer til at udtrykke kemokinreceptorer 3,4. Generering af transgene musemodeller, hvor leukocytter udtrykker en fluorescerende receptor eller mutantreceptorer med informative trafficking-defekter 5,6, indebærer en betydelig investering af tid og ressourcer. Selv i disse tilfælde kan billeddannelsesopløsningen og kontrasten for billeddannelsesreceptordynamikken i det levende dyr begrænses, og undersøgelser har anvendt immunhistokemi på faste vævsafsnit5. I betragtning af disse tekniske udfordringer er vores forståelse af, hvordan kemotiltrækreceptordynamikken påvirker celleadfærd i en levende vævsindstilling, i øjeblikket begrænset.
Her giver vi en metode til at overvåge receptorhandel med zebrafisk neutrofiler. Zebrafisk er genetisk trækbare, ligesom mus, men transgenese er relativt mere ligetil ved brug af effektive transposonsystemer og direkte zygote manipulation7. Den gennemsigtige larve er ideelt tilgængelig til billeddannelse. Kemokinreceptordynamikken er blevet visualiseret i primordiale kimceller og sidelinjen primordium ved ekspression af tilsvarende fusioner med fluorescerende reportere 8,9,10. Zebrafisklarver er udstyret med modne neutrofiler, der har stærkt bevarede genetiske og cellulære egenskaber med hensyn til pattedyrs neutrofiler. Subcellulær signaldynamik såsom cytoskeletal dynamik og polaritetsregulatorer er blevet visualiseret i disse celler ved generering af tilsvarende transgene linjer 11,12,13. For nylig visualiserede og funktionelt analyserede vi kemokinreceptordynamikken i neutrofiler i løbet af inflammatoriske reaktioner på vævsskade14. Her beskriver vi genereringen af transgene reporterlinjer til kemokinsignalering i neutrofiler, forberedelse af embryoner til levende billeddannelse, et sårassay til undersøgelse af neutrofilsignalering og protokollen til erhvervelse og analyse af billeder. Vi leverer også en sideprotokol til test af kemokinreceptorresponser på kandidatligander, hvilket er nyttigt, når man forsøger at etablere ligandgenkendelsesmønstre i ukarakteriserede receptorer. Disse teknikker kan anvendes i kombination med yderligere genetiske manipulationer, såsom hæmning af endogen kemokinekspression eller generering af mutantreceptorer med ændret ligandinduceret handel, for at forhøre, hvordan specifik signaldynamik påvirker leukocytadfærd in vivo. De transgene linjer, der udtrykker fluorescerende mærkede kemokinreceptorer, kan også bruges som reportere for endogene kemokingradienter, som ellers er vanskelige at detektere ved direkte antistoffarvning. Den beskrevne metode giver mulighed for at udvide genereringen af indberettere til andre immunsignalreceptorer.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>1-phenyl-2-thiourea</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P7629-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50mL CellStar Centrifuge Tube</td>
			<td>Grenier Bio-One Limited</td>
			<td>210270</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clark capillary glass</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>30-0020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cleanline Thin Bleach</td>
			<td>Scientific Laboratory Supplies</td>
			<td>CLE0301</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting scope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>SMZ645</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dri Block heater</td>
			<td>Techne</td>
			<td>FDB02AD</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiji</td>
			<td>National Institutes of Health, Bethesda, MD</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps, Jewelers Dumont No. 5</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F6521</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass bottom microwell dishes</td>
			<td>MatTek</td>
			<td>P35G-1.5-14-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass pasteur pipette</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>11795098</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Invitrogen Ambion mMESSAGE mMACHINE SP6 Transcription Kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>10391175</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica SP8 confocal microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low melting point agarose</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>16520-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic stand</td>
			<td>Narishige</td>
			<td>GJ-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MATLAB</td>
			<td>The MathWorks, Inc., Natick, MA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methylene blue</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M9140-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgSO4</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M-2643</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microinjection system</td>
			<td>Parker</td>
			<td>Picospritzer III</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microloader pipette tips</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5242956003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micromanipulator</td>
			<td>Narishige</td>
			<td>M-152</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette Puller</td>
			<td>Sutter Instrument Company</td>
			<td>Flaming/Brown P-97</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope slide</td>
			<td>Thermo-Scientific</td>
			<td>J1800AMNZ</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PerkinElmer Spinning Disk UltraVIEW ERS, Olympus IX81 spinnng disk confocal microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish (120mm)</td>
			<td>Grenier Bio-One Limited</td>
			<td>632180</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenol red</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P0290-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly(A) Tailing Kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM1350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prism</td>
			<td>GraphPad Software</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Small paintbrush</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectral Applied Research LMM5 laser module</td>
			<td></td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical Scalpel Blade No. 23</td>
			<td>Swann-Morton</td>
			<td>233-5528</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tricaine MS222</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E10521-50G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Volocity software</td>
			<td></td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yokogawa CSU10 spinning disc confocal scanner</td>
			<td>Yokogawa</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

live imaging of chemokine receptors in zebrafish neutrophils during wound responses

Leukocytvejledning ved kemiske gradienter er afgørende for immunresponser. Neutrofiler er de første celler, der rekrutteres til steder med vævsskade, hvor de udfører vigtige antimikrobielle funktioner. Deres handel med disse loci er orkestreret af flere inflammatoriske kemotiltraptanter, herunder kemokiner. På molekylært niveau reguleres kemotatraktant signalering ved intracellulær handel med de tilsvarende receptorer. Det er dog stadig uklart, hvordan subcellulære ændringer i kemokinreceptorer påvirker leukocytmigrationsdynamikken på celle- og vævsniveau. Her beskriver vi en metode til levende billeddannelse og kvantitativ analyse af kemokinreceptordynamikken i neutrofiler under inflammatoriske reaktioner på vævsskade. Disse værktøjer har afsløret, at differentiel kemokinreceptorhandel med zebrafisk neutrofiler koordinerer neutrofil klyngedannelse og spredning på steder med vævsskade. Dette har konsekvenser for vores forståelse af, hvordan inflammatoriske reaktioner er selvopløste. De beskrevne værktøjer kunne bruges til at forstå neutrofile migrationsmønstre i en række fysiologiske og patologiske indstillinger, og metoden kunne udvides til andre signalreceptorer.

Ventral fin såring efterfølges af hurtig neutrofil mobilisering fra CHT ind i den ventrale fin og klyngedannelse ved sårmargenen inden for 30-60 minutter (figur 1). Vi visualiserede fordelingen af to kemokinreceptorer, Cxcr1 og Cxcr2, som udtrykkes af zebrafisk neutrofiler24 og genkender Cxcl8a og Cxcl8b14 ved hjælp af konfokalmikroskopi med spindeskiven. Vi genererede to tilsvarende transgene linjer, Tg(lyz:Cxcr1-FT) og Tg(lyz:Cxcr2-FT), hvor neutrofiler udtrykker en fluorescerende timer (FT) konstruktion af receptoren, dvs. en fusion med en tandem af sfGFP og tagRFP (figur 2 og reference14). Anvendelsen af de to fluoroforer var beregnet til at muliggøre overvågning af en bred vifte af receptorskæbner og give estimater af proteinomsætningstiden ved plasmamembranen, da nyligt syntetiserede receptorer ville fluorescere i grønt og gradvist blive røde, når de bliver 8,14 år. Disse receptorer viste sig imidlertid at have hurtig konstitutiv omsætning ved neutrofilplasmamembranen, og at opholdstiden var kortere end modningstiden for tagRFP, hvor sfGFP viste membranlokalisering og tagRFP, der viste vesikulær lokalisering ved steady state (Supplerende video 1 og ref14). Derfor fokuserede vi på distributionen af sfGFP for at overvåge ligandinduceret internalisering på steder med vævsskade. Mønsteret af receptorfordeling blev kvantificeret ved hjælp af kontrastmetrikken, som rapporterer forskelle i intensitet mellem nabopixels. Begrundelsen er, at når receptorfordelingen er membranøs og glat, er kontrastværdien lav. Når receptorfordelingen er vesikulær og mere punkteret, er kontrastværdien høj (figur 3).
En alternativ metode er at kvantificere forholdet mellem receptorniveauer (sfGFP-intensitet) over niveauerne af en kontrolmembranmarkør, f.eks. membran-CFP (mCFP) (figur 3). Begge metoder kunne detektere receptorinternalisering, som indikeret af mere vesikulær receptorfordelingsmønster globalt i cellen (højere kontrastværdi) eller lavere receptorniveauer ved membranen (lavere sfGFP / mCFP-forhold). Kontrastmetrikken kunne imidlertid også detektere receptorinternalisering i neutrofile klynger ved såret, hvor membransegmentering var mindre nøjagtig og ikke anvendelig (figur 3). Ved hjælp af denne måling var vi i stand til at kvantificere synlige forskelle mellem Cxcr1 og Cxcr2-handel med neutrofiler ved sår (figur 4 og supplerende video 2). Cxcr1-FT internaliseret i celler placeret ved såret, mens Cxcr2-FT forblev membranøs i neutrofiler ved såret (figur 4A-C, Supplerende video 2 og supplerende video 3). Undertrykkelse af Cxcl8a og Cxcl8b gennem morpholino-behandling påvirkede forskelligt Cxcr1-FT-internalisering ved sår (figur 4C,D). For yderligere at validere, at Cxcr1-FT reagerer på Cxcl8a, udførte vi kemokinresponsassays i tidlige embryoner. Vi fandt ud af, at Cxcr1-FT markant internaliserede sig i embryoner, hvor Cxcl8a blev udtrykt sammen (figur 5). Alt i alt indikerer disse resultater, at de beskrevne metoder kan anvendes til at måle kemokininduceret receptorinternalisering i neutrofiler og fastslå identiteten af liganden, der formidler disse virkninger.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61679/61679fig01.jpg"> Figur 1: Neutrofil migration til ventrale finsår. (A) (Venstre) Tegneserie af 3 dpf larve, der viser placeringen af det kaudale hæmatopoietiske væv (CHT), venuscirkulationen (VC, blå), den ventrale fin (VF) og sårstedet. (Højre) Tegneserie, der viser sårets område (W) med neutrofiler, der mobiliseres fra CHT og klynger sig ved såret. Cht-vævets kaudale veneplexus (CVP) tegnes i blåt. (B) Lyst feltbillede (venstre) og konfokal projektion (højre), der viser det ventrale finnesår og fordelingen af neutrofiler i Tg(mpx:GFP) larver ved 2 timer efter såring. Stiplede linjer viser VF- og CHT-konturer. Skalastang = 25 μm. Tegneserie og fluorescerende billede modificeret fra ref.14 (http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61679/61679fig01large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af denne figur.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61679/61679fig02.jpg"> Figur 2: Levende billeddannelse af kemokinreceptorhandel med neutrofiler. A) Konstruktioner, der anvendes til neutrofilspecifik transgen ekspression af Cxcr1-FT (fluorescerende timer) og Cxcr2-FT. Konfokale fremspring af neutrofiler i hovedet på en 3 dpf transgen larve (Tg(lyz:Cxcr1-FT), øverst Tg(lyz:Cxcr2-FT), nederst), der viser tRFP (magenta) og sfGFP (grøn) kanaler. Skalastang = 20 μm. (B) Anatomisk skema af 3 dpf larve som i figur 1A. Under larven er ordninger, der viser sårets område (W) med neutrofiler, der mobiliseres fra CHT (øverst) eller udfører kemotaxis, når de kommer ind i den ventrale fin (nederst). Stiplet firkant angiver område afbildet i snapshots til højre. (C) Neutrofiler i Tg(lyz:Cxcr1-FT) larver (sfGFP er vist) ved mobilisering fra CHT (toppaneler) eller kemotaxis mod såret (bundpaneler). Pile viser de samme celler over tid. Tidspunkter på højre billede er minutter, der er gået efter billedet til venstre. Skalabjælke = 10 μm. (D) Skematisk repræsentation af eksperimentel tilgang til levende billeddannelse af handel med kemokinreceptorer. Paneler A-C modificeret fra ref.14 (http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61679/61679fig02large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af denne figur.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61679/61679fig03.jpg"> Figur 3: Kvantificeringseksempler på receptordynamik. Enkelte (blå) eller klyngede neutrofiler (grøn) ved sår eller ikke-mobiliserede neutrofiler i CHT (rød, orange) blev segmenteret og analyseret ved forskellige metoder til sammenligning af resultater. De samme eksempelceller, der blev vist, blev analyseret med to metoder til at relatere, hvad der ses på billedet, med det ekstraherede værdiområde. (A) Overfladen af de valgte eksempelceller blev segmenteret baseret på konturdefinition i sfGFP-kanalen. (B) Kontrast blev beregnet ud fra eksempelcellerne vist i A. (C) Membranen i de udvalgte eksempelceller blev segmenteret baseret på konturdefinition i den fælles fiskeripolitikkanal. Ratiometrisk analyse af sfGFP/den fælles fiskeripolitik fulgte. (D) Forholdet mellem sfGFP/CFP blev beregnet på de eksempelceller, der er vist i C. Fejlbjælker repræsenterer S.E.M. fra individuelle celler, i tilfælde af n>1 blev værdier her ikke brugt til statistisk analyse, men blot til at eksemplificere målinger opnået med de forskellige kvantificeringsmetoder. Skalabjælke = 10 μm. Figur ændret fra ref.14 (http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61679/61679fig03large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af denne figur.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61679/61679fig04v2.jpg"> Figur 4: Differentiel dynamik i Cxcr1 og Cxcr2 som reaktion på såring. (A) Konfokal projektion af neutrofiler i Tg(lyz:Cxcr1-FT) eller Tg(lyz:Cxcr2-FT) larver ved såret ved 80 min efter såring (sfGFP kanal vist). Skalabjælke = 10 μm.  (B) Forstørret Cxcr1-FT neutrofil (venstre) og Cxcr2-FT (højre) ved såret. Grøn receptor er vist i gråt. Skalabjælke = 5 μm. (C) Normaliseret kontrast (kontrast pr. Individuel neutrofil normaliseret til den gennemsnitlige kontrast af ikke-mobiliserede celler i CHT). cxcl8a refererer til injektion af en splejsningsblokering sammen med en translationsblokerende morpholino for cxcl8a. cxcl8b refererer til injektion med en splejsningsblokerende morpholino til cxcl8b. For Tg(lyz:Cxcr1-FT): n=24 celler (CHT), n=47 celler (sår) fra 8 larver. For Tg(lyz:Cxcr1-FT) med morpholinos: n=28 celler (Cxcl8a-MO) fra 5 larver, n=16 celler (Cxcl8b-MO) fra 5 larver. For Tg(lyz:Cxcr2-FT): n=10 celler (CHT) og n=20 celler (sår) fra 3 larver. Data blev samlet fra uafhængige larver erhvervet i 1-5 billeddannelsessessioner. Kruskal-Wallis test med Dunns multiple sammenligningstest for Tg(lyz:Cxcr1-FT), to-halet uparret Mann-Whitney test for Tg(lyz:Cxcr2-FT). (D) Konfokal projektion af neutrofiler i transgene larver af Tg(lyz:Cxcr1-FT) behandlet med cxcl8a morpholino (MO) (venstre) og cxcl8b MO (højre), der reagerer på finnesår (sfGFP-kanal vist med grønt). Snapshot taget på tidspunkter af ækvivalent neutrofilakkumulering (85 min eftersåring i venstre billede og 45 min efter såring i højre billede). Skalabjælke = 10 μm. Figur ændret fra ref.14 (http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61679/61679fig04large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af denne figur.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61679/61679fig05.jpg"> Figur 5: Kemokinresponsassay i tidlige embryoner. Laserscanning konfokale skiver af gastrulerende embryoner, der viser ekspression og fordeling af Cxcr1-FT. 100 pg Cxcr1-FT mRNA blev injiceret i et celletrin æg med eller uden 150 pg Cxcl8a mRNA. Grønne og røde receptorer vises i separate kanaler. Kontrolmembran CFP-markør (mCFP) vises i cyankanalen. Skalabjælke = 20 μm. Figur ændret fra ref.14 (http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61679/61679fig05large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af denne figur.</a>
Supplerende film 1: Transgene neutrofiler i hovedet på en Tg(lyz:Cxcr1-FT) (venstre) og Tg(lyz:Cxcr2-FT) (højre) larve ved 3 dpf. sfGFP (grøn), tagRFP (magenta). Billedintervallet er 30 sek., og billedhastigheden er 5 fps. Skalabjælke = 20 μm. Videoen stammer fra ref.14 (http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/). <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61679/Supplementary_Movie1.avi" target="_blank">Klik her for at downloade denne video.</a>
Supplerende film 2: Neutrofiler i Tg(lyz:Cxcr1-FT) (venstre) og Tg(lyz:Cxcr2-FT) (højre) transgene larver, der reagerer på finnesår. Filmen starter inden for 10 min efter såring og varer 60 min. sfGFP (grøn), tagRFP (magenta). Billedintervallet er 30 sek., og billedhastigheden er 10 fps. CHT = kaudalt hæmatopoietisk væv. VF = ventral fin. Skalastang = 25 μm. Videoen stammer fra ref.14 (http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/). <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61679/Supplementary_Movie2.avi" target="_blank">Klik her for at downloade denne video.</a>
Supplerende film 3. Yderligere eksempler på neutrofiler fra en såret Tg (lyz: Cxcr1- FT) transgen larve (forskellig larve end den, der er vist i video 2), erhvervet ved højere opløsning, der viser receptorinternalisering (sfGFP-kanal vist med grønt) ved mobilisering i CHT eller ved indrejse og kemotaxis i den ventrale fin. Billedintervallet er 30 sek., og billedhastigheden er 2 fps. Skalabjælke = 10 μm. Videoen stammer fra ref.14 (http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/). <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61679/Supplementary_Movie3.avi" target="_blank">Klik her for at downloade denne video.</a>
Supplerende fil 1: <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61679/Supplementary%20file%201.m" target="_blank">Klik her for at downloade denne fil.</a>
Supplerende fil 2: <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61679/Supplementary%20file%202.m" target="_blank">Klik her for at downloade denne fil.</a>
Supplerende fil 3: <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61679/Supplementary%20file%203.m" target="_blank">Klik her for at downloade denne fil.</a>
Supplerende fil 4: <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61679/Supplementary%20file%204.m" target="_blank">Klik her for at downloade denne fil.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Live Imaging of Chemokine Receptors in Zebrafish Neutrophils During Wound Responses at JoVE.com

Live Imaging of Chemokine Receptors in Zebrafish Neutrophils During Wound Responses

Her beskriver vi protokoller til udførelse af levende billeddannelse og kvantitativ analyse af kemotiltrækningsreceptordynamik i zebrafisk neutrofiler

Levende billeddannelse af kemokinreceptorer i zebrafisk neutrofiler under sårresponser

Leukocyte guidance by chemical gradients is essential for immune responses. Neutrophils are the first cells to be recruited to sites of tissue damage ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

In vivo Imaging of Transgenic Leishmania Parasites in a Live Host

In vivo Imaging of Transgenic Leishmania Parasites in a Live Host

Distinct species of Leishmania, a protozoan parasite of the family Trypanosomatidae, typically cause different human disease manifestations. The most ...

Retroviral Transduction of T-cell Receptors in Mouse T-cells

T-cell receptors (TCRs) play a central role in the immune system. TCRs on T-cell surfaces can specifically recognize peptide antigens presented by antigen ...

Non-invasive Imaging of Disseminated Candidiasis in Zebrafish Larvae

Non-invasiv Imaging af dissemineret candidiasis hos zebrafisk Larver

Disseminated candidiasis caused by the pathogen Candida albicans is a clinically important problem in hospitalized individuals and is associated with a 30 ...

Visualization of Bacterial Toxin Induced Responses Using Live Cell Fluorescence Microscopy

Visualisering af bakterielt toksin Inducerede Responses Brug af Live Cell Fluorescence Microscopy

Bacterial toxins bind to cholesterol in membranes, forming pores that allow for leakage of cellular contents and influx of materials from the external ...

Real-time Imaging of Heterotypic Platelet-neutrophil Interactions on the Activated Endothelium During Vascular Inflammation and Thrombus Formation in Live Mice

Real-time Billeddannelse af heterotypisk blodplade-neutrophile interaktioner på aktiveret endotel Under vaskulær inflammation og thrombedannelse i levende mus

Interaction of activated platelets and leukocytes (mainly neutrophils) on the activated endothelium mediates thrombosis and vascular inflammation.1,2 ...

Characterization of Inflammatory Responses During Intranasal Colonization with Streptococcus pneumoniae

Characterization of Inflammatory Responses During Intranasal Colonization with Streptococcus pneumoniae

Karakterisering af inflammatoriske reaktioner under intranasal kolonisering med Streptococcus pneumoniae

Nasopharyngeal colonization by Streptococcus pneumoniae is a prerequisite to invasion to the lungs or bloodstream1. This organism is capable of colonizing ...

Imaging Neutrophils and Monocytes in Mesenteric Veins by Intravital Microscopy on Anaesthetized Mice in Real Time

Imaging neutrofiler og monocytter i Mesenterial Veins af Intravital Mikroskopi på bedøvede mus i Real Time

Efficient immune response is dependent on rapid mobilization of blood leukocytes to the site of infection or injury. Investigating leukocyte migration in ...

Measuring Physiological Responses of Drosophila Sensory Neurons to Lipid Pheromones Using Live Calcium Imaging

Measuring Physiological Responses of Drosophila Sensory Neurons to Lipid Pheromones Using Live Calcium Imaging

Måling fysiologiske reaktioner af<em&gt; Drosophila</em&gt; Sensoriske neuroner til Lipid Feromoner Brug Live-Calcium Imaging

Unlike mammals, insects such as Drosophila have multiple taste organs. The chemosensory neurons on the legs, proboscis, wings and ovipositor of Drosophila ...

Live Imaging of Antifungal Activity by Human Primary Neutrophils and Monocytes in Response to A. fumigatus

Live Imaging of Antifungal Activity by Human Primary Neutrophils and Monocytes in Response to A. fumigatus

Live-Imaging af antifungal aktivitet af humane primære neutrofiler og monocytter i Reaktion på<em&gt; A. fumigatus</em

Aspergillus fumigatus is an opportunistic fungal pathogen causing invasive infections in immunocompromised hosts with a high case-fatality rate. Research ...