Name: live imaging of chemokine receptors in zebrafish neutrophils during wound responses
Uploaded: 2020-12-04T13:30:00
Duration: 6 min 48 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Live Imaging of Chemokine Receptors in Zebrafish Neutrophils During Wound Responses at JoVE.com

We bedanken Christine Holt en Bill Harris voor hun hulp bij confocale microscopie. We bedanken Darren Gilmour voor de fluorescerende timer backbone constructs en Anna Huttenlocher voor de Tol2-Lyz backbone vector. We bedanken Steve Renshaw voor de Tg(mpx:GFP)i114 lijn. Dit werk werd ondersteund door de MRC (MR/L019523/1), de Wellcome Trust [204845/Z/16/Z]; Isaac Newton Trust [12.21(a)i] en een Isaac Newton Trust grant 19.23(n). C.C. werd ondersteund door een MRC DTP-studentschap en gedeeltelijk door de Wellcome Trust [204845/Z/16/Z]; Isaac Newton Trust [12.21(a)i] subsidie. H.W. werd ondersteund door een MRC DTP Studentship. H.P. werd ondersteund door een Wellcome Trust PhD beurs (105391/Z/14/Z) en deels door een Wellcome Trust [204845/Z/16/Z]; Isaac Newton Trust [12.21(a)i] subsidie en de MRC (MR/L019523/1).

<ol>
	<li>Rot, A., von Andrian, U. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemokines+in+innate+and+adaptive+host+defense:+basic+chemokinese+grammar+for+immune+cells.">Chemokines in innate and adaptive host defense: basic chemokinese grammar for immune cells.</a> Annual Review of Immunology. 22, 891-928 (2004).</li><li>Cotton, M., Claing, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=G+protein-coupled+receptors+stimulation+and+the+control+of+cell+migration.">G protein-coupled receptors stimulation and the control of cell migration.</a> Cellular Signalling. 21 (7), 1045-1053 (2009).</li><li>Liu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bidirectional+regulation+of+neutrophil+migration+by+mitogen-activated+protein+kinases.">Bidirectional regulation of neutrophil migration by mitogen-activated protein kinases.</a> Nature Immunology. 13 (5), 457-464 (2012).</li><li>Wen, X., Jin, T., Xu, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+G+Protein-coupled+Receptor-mediated+Chemotaxis+and+its+Signaling+Events+in+Neutrophil-like+HL60+Cells.">Imaging G Protein-coupled Receptor-mediated Chemotaxis and its Signaling Events in Neutrophil-like HL60 Cells.</a> Journal of Visualized Experiments. (115), e54511 (2016).</li><li>Arnon, T. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GRK2-dependent+S1PR1+desensitization+is+required+for+lymphocytes+to+overcome+their+attraction+to+blood.">GRK2-dependent S1PR1 desensitization is required for lymphocytes to overcome their attraction to blood.</a> Science. 333 (6051), 1898-1903 (2011).</li><li>Jung, H., Mithal, D. S., Park, J. E., Miller, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Localized+CCR2+Activation+in+the+Bone+Marrow+Niche+Mobilizes+Monocytes+by+Desensitizing+CXCR4.">Localized CCR2 Activation in the Bone Marrow Niche Mobilizes Monocytes by Desensitizing CXCR4.</a> PloS One. 10 (6), 0128387 (2015).</li><li>Kwan, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Tol2kit:+a+multisite+gateway-based+construction+kit+for+Tol2+transposon+transgenesis+constructs.">The Tol2kit: a multisite gateway-based construction kit for Tol2 transposon transgenesis constructs.</a> Developmental Dynamics: An Official Publication of the American Association of Anatomists. 236 (11), 3088-3099 (2007).</li><li>Don&#224;, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directional+tissue+migration+through+a+self-generated+chemokine+gradient.">Directional tissue migration through a self-generated chemokine gradient.</a> Nature. 503 (7475), 285-289 (2013).</li><li>Venkiteswaran, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+and+dynamics+of+an+endogenous,+self-generated+signaling+gradient+across+a+migrating+tissue.">Generation and dynamics of an endogenous, self-generated signaling gradient across a migrating tissue.</a> Cell. 155 (3), 674-687 (2013).</li><li>Minina, S., Reichman-Fried, M., Raz, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+receptor+internalization,+signaling+level,+and+precise+arrival+at+the+target+in+guided+cell+migration.">Control of receptor internalization, signaling level, and precise arrival at the target in guided cell migration.</a> Current Biology. 17 (13), 1164-1172 (2007).</li><li>Yoo, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+microtubules+in+neutrophil+polarity+and+migration+in+live+zebrafish.">The role of microtubules in neutrophil polarity and migration in live zebrafish.</a> Journal of Cell Science. 125, 5702-5710 (2012).</li><li>Yoo, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+regulation+of+protrusion+and+polarity+by+PI3K+during+neutrophil+motility+in+live+zebrafish.">Differential regulation of protrusion and polarity by PI3K during neutrophil motility in live zebrafish.</a> Developmental Cell. 18 (2), 226-236 (2010).</li><li>Buchan, K. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+transgenic+zebrafish+line+for+in+vivo+visualisation+of+neutrophil+myeloperoxidase.">A transgenic zebrafish line for in vivo visualisation of neutrophil myeloperoxidase.</a> PLoS One. 14 (4), 0215592 (2019).</li><li>Coombs, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemokine+receptor+trafficking+coordinates+neutrophil+clustering+and+dispersal+at+wounds+in+zebrafish.">Chemokine receptor trafficking coordinates neutrophil clustering and dispersal at wounds in zebrafish.</a> Nature Communications. 10 (1), 5166 (2019).</li><li>Hall, C., Flores, M. V., Storm, T., Crosier, K., Crosier, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+zebrafish+lysozyme+C+promoter+drives+myeloid-specific+expression+in+transgenic+fish.">The zebrafish lysozyme C promoter drives myeloid-specific expression in transgenic fish.</a> BMC Developmental Biology. 7, 42 (2007).</li><li>Renshaw, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+transgenic+zebrafish+model+of+neutrophilic+inflammation.">A transgenic zebrafish model of neutrophilic inflammation.</a> Blood. 108 (13), 3976-3978 (2006).</li><li>Khmelinskii, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tandem+fluorescent+protein+timers+for+in+vivo+analysis+of+protein+dynamics.">Tandem fluorescent protein timers for in vivo analysis of protein dynamics.</a> Nature Biotechnology. 30 (7), 708-714 (2012).</li><li>Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The zebrafish book. A guide for the laboratory use of zebrafish (Brachydanio rerio). , (2007).</li><li>Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microinjection+of+Zebrafish+Embryos+to+Analyze+Gene+Function.">Microinjection of Zebrafish Embryos to Analyze Gene Function.</a> Journal of Visualized Experiments. (25), 1115 (2009).</li><li>Detrich, H. W., Zon, L. I., Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Zebrafish: Genetics, Genomics and Informatics. , (2004).</li><li>Le Guyader, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Origins+and+unconventional+behavior+of+neutrophils+in+developing+zebrafish.">Origins and unconventional behavior of neutrophils in developing zebrafish.</a> Blood. 111 (1), 132-141 (2008).</li><li>Chan, T. F., Vese, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Active+contours+without+edges.">Active contours without edges.</a> IEEE Transactions on Image Processing. 10 (2), 266-277 (2001).</li><li>Haralick, R. M., Shanmugam, K., Dinstein, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Textural+features+for+image+Classification.">Textural features for image Classification.</a> IEEE Transactions on Systems, Man, and Cybernetics. SMC-3 (6), 610-621 (1973).</li><li>Deng, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Localized+bacterial+infection+induces+systemic+activation+of+neutrophils+through+Cxcr2+signaling+in+zebrafish.">Localized bacterial infection induces systemic activation of neutrophils through Cxcr2 signaling in zebrafish.</a> Journal of Leukocyte Biology. 93 (5), 761-769 (2013).</li><li>Torraca, V., Mostowy, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+infection:+From+pathogenesis+to+cell+biology.">Zebrafish infection: From pathogenesis to cell biology.</a> Trends in Cell Biology. 28 (2), 143-156 (2018).</li><li>Feng, Y., Santoriello, C., Mione, M., Hurlstone, A., Martin, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+imaging+of+innate+immune+cell+sensing+of+transformed+cells+in+zebrafish+larvae:+parallels+between+tumor+initiation+and+wound+inflammation.">Live imaging of innate immune cell sensing of transformed cells in zebrafish larvae: parallels between tumor initiation and wound inflammation.</a> PLoS Biology. 8 (12), 1000562 (2010).</li><li>Poplimont, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+swarming+in+damaged+tissue+is+orchestrated+by+connexins+and+cooperative+calcium+alarm+signals.">Neutrophil swarming in damaged tissue is orchestrated by connexins and cooperative calcium alarm signals.</a> Current Biology. 30 (14), 2761-2776.e7 (2020).</li><li>Cornet, C., Di Donato, V., Terriente, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combining+Zebrafish+and+CRISPR/Cas9:+Toward+a+more+efficient+drug+discovery+pipeline.">Combining Zebrafish and CRISPR/Cas9: Toward a more efficient drug discovery pipeline.</a> Frontiers in Pharmacology. 9, 703 (2018).</li><li>Kienle, K., L&#228;mmermann, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+swarming:+an+essential+process+of+the+neutrophil+tissue+response.">Neutrophil swarming: an essential process of the neutrophil tissue response.</a> Immunological Reviews. 273 (1), 76-93 (2016).</li><li>Lisse, T. S., Brochu, E. A., Rieger, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Capturing+tissue+repair+in+zebrafish+larvae+with+time-lapse+brightfield+stereomicroscopy.">Capturing tissue repair in zebrafish larvae with time-lapse brightfield stereomicroscopy.</a> Journal of Visualized Experiments. (95), e52654 (2015).</li></ol>

De auteurs verklaren geen belangenverstrengeling

De beschreven methode maakt live beeldvorming mogelijk van receptordynamiek in reactie op endogene liganden in situ tijdens een ontstekingsreactie op weefselschade. Het gebruik van Cxcr1/Cxcr2 neutrofielenreporters kan worden uitgebreid naar andere fysiologische instellingen, zoals infectie, tumormodellen of andere soorten weefselschade 14,25,26,27. Bovendien kunnen transgene reddingslijnen, waarbij de endogene receptor wordt onderdrukt en gered door een exogene mutante receptor, nuttige hulpmiddelen bieden om het belang van specifieke neutrofiele migratiepatronen in immuunresponsen te ontleden. Cxcr1-receptormutanten die de desensibilisatie hebben aangetast, veroorzaken bijvoorbeeld meer prominente neutrofielenclustering op ontstekingsplaatsen14. Deze toename van functiefenotype kan worden gebruikt om de rol van neutrofiele congregatie in verschillende fysiologische processen te begrijpen, bijvoorbeeld wondherstel, infectieziekte of tumorevolutie, en receptor knockdown / knock-out experimenten aan te vullen. De methodologie biedt ook een basis om het bereik van beschikbare verslaggevers uit te breiden. De keuze van de fluorescerende verslaggever is belangrijk om te overwegen en hangt af van de biologische vraag. We vonden dat de constitutieve omzet van deze chemokinereceptoren in neutrofielen hoog was, in vergelijking met epitheelcellen, en dat verslaggevers met snelle rijping (bijv. sfGFP) membraanniveaus bij steady state moesten rapporteren en verschillen moesten oplossen bij neutrofiele stimulatie 8,14. Membraanverhoudingen van sfGFP / tagRFP zijn dus niet van toepassing voor het meten van ligand-geïnduceerde internalisatie in dit celtype, maar het patroon van tagRFP maakt het mogelijk om de intracellulaire lotgevallen van de receptor te volgen, wat nuttig zou kunnen zijn in sommige studies. We ontdekten ook dat het meer geconcentreerde intracellulaire signaal van tagRFP nuttig is voor het screenen van individuele larven. Een alternatieve benadering voor het meten van receptorniveaus bij het plasmamembraan zou zijn om een fluorescerende membraanmarker in neutrofielen co-express te brengen in hetzelfde transgen9 of in een onafhankelijk transgen14. In het eerste scenario zou het transgen een extra middel bieden voor het screenen van de vissen en zouden de expressieniveaus vergelijkbaar zijn tussen de marker en de receptor. De laatste aanpak zou meer modulair zijn, in die zin dat een zebravislijn met een receptorverslaggever kan worden gecombineerd met verschillende reporterlijnen. In beide gevallen is het vermeldenswaard dat membraankwantificering van de receptorniveaus een uitdaging is bij geclusterde neutrofielen (zie hieronder). Ten slotte merken we op dat een mogelijke uitbreiding van dit protocol zou zijn om de live beeldvorming door immunohistochemie op te volgen voor meer gedetailleerde lokalisatieanalyses.
Het Tol2-transgenesesysteem is goed ingeburgerd7 en de lysozym C-promotor is uitgebreid gebruikt voor neutrofiele expressie11,15. De transgenesebenadering is daarom relatief eenvoudig en het expressieniveau dat met deze promotor wordt bereikt, is hoog genoeg om voldoende contrast te bieden voor analyse van receptordynamiek. Een mogelijke beperking is dat het expressieniveau de endogene receptorexpressieniveaus niet samenvat. Nieuwe CRISPR-technologieën kunnen worden ingezet om knock-in-lijnen vast te stellen voor receptoren van bijzonder belang28. Deze technologieën zijn nog steeds omslachtig en garanderen mogelijk niet de vereiste expressieniveaus voor subcellulaire beeldvorming, maar hun succesvolle ontwikkeling zou een belangrijke doorbraak zijn voor het begrijpen van endogene signaleringsdynamiek. Functionele validaties zijn belangrijk voor het interpreteren van gegevens met transgene receptorconstructen. Ligandherkenningstests kunnen bijvoorbeeld worden gebruikt om vast te stellen dat het fluorescerende fusie-eiwit functioneel is en redding van knock-outfenotypen kan worden gebruikt om vast te stellen dat de transgene neutrofiele expressieniveaus compatibel zijn met functionaliteit14. Ten slotte zou een meer directe manier om de receptorfusie te valideren zijn om een in vitro functionele test te gebruiken met gelabelde receptor naast niet-gelabelde versies14.
De kwantificeringsbenadering richt zich op specifieke problemen bij nauwkeurige membraansegmentatie bij neutrofielen in vivo. In cellen van epitheliale aard kan kwantificering van receptorniveaus automatisch worden uitgevoerd door membraanreceptorniveaus te normaliseren tot een controlemarker, die in tandem of afzonderlijk kan worden uitgedrukt9. Inderdaad, we hebben een dergelijke benadering toegepast bij het gebruik van de ligand-herkenningstest in gastrulatende embryo's14. Neutrofielen ondergaan echter complexe, snelle veranderingen in celvorm in vivo, waardoor de membraansegmentatie zowel in 2D als 3D14 moeilijk wordt. Dit is nog uitdagender wanneer neutrofielen clusteren, wat in veel fysiologische omgevingen voorkomt29. De contrastmetriek overwint deze beperking omdat het geen membraansegmentatie vereist, maar in plaats daarvan de algehele toestand van receptorverdeling in de cel weerspiegelt (vliezig / glad versus vesiculair / dotty). Het is belangrijk op te merken dat de contrastmetriek kan worden beïnvloed door het algehele contrast van het beeld, dus normalisatie van individuele celwaarden naar een interne referentie is vereist om rekening te houden met de variabiliteit van het signaal in verschillende embryo's / monsters. We gebruikten bijvoorbeeld de gemiddelde celcontrastwaarde van niet-responsieve neutrofielen in de CHT (d.w.z. neutrofielen die stationair blijven en niet migreren naar de ventrale vin)14. Een extra mogelijkheid zou zijn om te normaliseren met contrastwaarden van een controlemarker in dezelfde cel. Dit zou een oplossing bieden wanneer een interne referentie van niet-reagerende cellen niet beschikbaar is en kan waarschijnlijk fijnere kwantitatieve verschillen in receptordynamiek tussen verschillende omstandigheden oplossen.
De locatie van beeldvorming is een andere variabele om te overwegen. De reden om hier de ventrale vinwond te kiezen, in tegenstelling tot het meer algemeen gebruikte staartvin wondmodel16,30, is omdat de plaats van verwonding in de buurt ligt van de plaats van neutrofiele woonplaats / migratie-oorsprong. Dit versnelt de tijdlijn van de test, omdat het relatief weinig tijd kost voordat neutrofielen arriveren. Bovendien biedt het de mogelijkheid om celgedrag vast te leggen, zowel bij de migratieoorsprong (CHT) als bij de doellocatie van belang (wond). Dit is hier relevant, omdat de ruimtelijke en temporele resolutie die nodig is voor subcellulaire beeldvorming moeilijk te combineren is met een groot gezichtsveld of multi-positie scannen. De ventrale vin wondtest maakt het dus mogelijk om de evolutie van de migratierespons van de migratieoorsprong te volgen en gelijktijdige vangst van niet-specifieke receptorfluctuaties in cellen die niet reageren. Zoals hierboven vermeld, is dit laatste nuttig voor kwantificeringsdoeleinden omdat het een interne referentie biedt voor niet-specifieke dynamiek. In andere systemen is het mogelijk dat een dergelijke interne referentie niet mogelijk is, in welk geval de contrastwaarden van een co-uitgedrukte membraanmarker een alternatieve regeling zouden bieden.
Samenvattend verwachten we dat de methodologie toepasbaar is op andere systemen en voor verschillende doeleinden kan worden ingezet. Dezelfde verslaggevers kunnen bijvoorbeeld worden gebruikt in andere inflammatoire omgevingen, zoals infectie-instellingen of andere ziektemodellen. Het repertoire van zebravisreceptor reporterlijnen kan worden uitgebreid naar andere signaalreceptoren, om signaleringsmechanismen te begrijpen of liganddynamica in vivo te rapporteren. De aanpak kan worden gecombineerd met knockdown/knockout technieken om de mechanistische basis van de waargenomen dynamiek te ondervragen. Verstoring van ligandexpressie kan bijvoorbeeld wijzen op de ligandafhankelijkheid voor waargenomen receptordynamiek. In de toekomst voorzien we dat het systeem verder verfijnd kan worden om knock-in insertie van verslaggevers op te nemen. Uiteindelijk zouden bevindingen met behulp van deze methodologie nieuwe inzichten opleveren die waardevol zijn buiten de zebravisgemeenschap, gezien het behoud van deze signaalreceptoren bij zoogdieren en de relatieve uitdaging om deze studies in grotere organismen uit te voeren.

Leukocytenmigratie is van het grootste belang voor immuunresponsen. Immuuncellen zijn prototypische migrerende cellen, die opmerkelijk goed in staat zijn om weefsels en bloedvaten te doorkruisen en een reeks chemische geleidingssignalen te detecteren om richtingsgewijs naar microben of andere gastheercellen van belang te migreren. Correcte begeleiding is afhankelijk van de herkenning van chemoattractanten, waaronder chemokines de meest prominente categorie1 vertegenwoordigen. Chemokines worden herkend door zeer specifieke zeven-transmembraan G-eiwit gekoppelde receptoren. Na chemokinebinding veranderen chemokinereceptoren de conformatie, wat leidt tot de activering van geassocieerde trimerische G-eiwitten en hun dissociatie in functionele signaalsubeenheden die cytoskeletale veranderingen en gerichte migratie bevorderen1. Ten tweede worden chemokinereceptoren gefosforyleerd en deze modificatie leidt tot desensibilisatie voor lokstof, die kan worden gevolgd door snelle hersensibilisatie / recycling of intracellulaire afbraak en downregulatie van het celoppervlak2. Deze receptordynamiek beïnvloedt de duur en dosis signalering die door de cellen wordt ontvangen, maar hoe ze het migratiegedrag van leukocyten beïnvloeden, is in vivo moeilijk op te helderen.
Het volgen van receptordynamiek in levende leukocyten in traditionele zoogdiersystemen staat voor verschillende uitdagingen. Voor levend onderzoek moeten receptorfusies met fluorescerende eiwitten in de cellen tot expressie worden gebracht. Dit is een uitdaging in primaire leukocyten, met name bij neutrofielen, en studies tot nu toe hebben surrogaat neutrofiele cellijnen gebruikt om chemokinereceptoren tot expressie te brengen 3,4. Het genereren van transgene muismodellen, waarbij leukocyten een fluorescerende receptor of mutante receptoren tot expressie brengen met informatieve smokkeldefecten 5,6, brengt een aanzienlijke investering van tijd en middelen met zich mee. Zelfs in deze gevallen kunnen de beeldvormingsresolutie en het contrast voor beeldvormingsreceptordynamiek in het levende dier beperkt zijn en studies hebben immunohistochemie gebruikt op secties5 van vast weefsel. Gezien deze technische uitdagingen is ons begrip van hoe de dynamiek van chemoattractante receptoren het celgedrag in een levende weefselomgeving beïnvloedt momenteel beperkt.
Hier bieden we een methodologie om receptorhandel in zebravis neutrofielen te monitoren. Zebravissen zijn genetisch handelbaar, net als muizen, maar transgenese is relatief eenvoudiger door het gebruik van efficiënte transposonsystemen en directe zygote-manipulatie7. De transparante larve is idealiter vatbaar voor beeldvorming. De chemokinereceptordynamiek is gevisualiseerd in primordiale geslachtscellen en het laterale lijn primordium door expressie van overeenkomstige fusies met fluorescerende reporters 8,9,10. Zebravislarven zijn uitgerust met volwassen neutrofielen die sterk geconserveerde genetische en cellulaire eigenschappen hebben ten opzichte van neutrofielen van zoogdieren. Subcellulaire signaaldynamica zoals cytoskeletale dynamica en polariteitsregulatoren zijn in deze cellen gevisualiseerd door het genereren van overeenkomstige transgene lijnen 11,12,13. Onlangs hebben we de chemokinereceptordynamiek bij neutrofielen gevisualiseerd en functioneel geanalyseerd in de loop van ontstekingsreacties op weefselschade14. Hier beschrijven we het genereren van transgene reporterlijnen voor chemokine-signalering bij neutrofielen, voorbereiding van embryo's voor live beeldvorming, een wondtest voor het bestuderen van neutrofielensignalering en het protocol voor het verkrijgen en analyseren van beelden. We bieden ook een zijprotocol om chemokinereceptorresponsen op kandidaat-liganden te testen, wat nuttig is bij het vaststellen van ligandherkenningspatronen in niet-gekarakteriseerde receptoren. Deze technieken kunnen worden gebruikt in combinatie met verdere genetische manipulaties, zoals remming van endogene chemokine-expressie of generatie van mutante receptoren met veranderde ligand-geïnduceerde handel, om te onderzoeken hoe specifieke signaaldynamiek het gedrag van leukocyten in vivo beïnvloedt. De transgene lijnen die fluorescerend gelabelde chemokinereceptoren tot expressie brengen, kunnen ook worden gebruikt als verslaggevers voor endogene chemokinegradiënten, die anders moeilijk te detecteren zijn door directe antilichaamkleuring. De beschreven methodologie biedt ruimte om het genereren van reporters uit te breiden naar andere immunosignalerende receptoren.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>1-phenyl-2-thiourea</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P7629-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50mL CellStar Centrifuge Tube</td>
			<td>Grenier Bio-One Limited</td>
			<td>210270</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clark capillary glass</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>30-0020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cleanline Thin Bleach</td>
			<td>Scientific Laboratory Supplies</td>
			<td>CLE0301</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting scope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>SMZ645</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dri Block heater</td>
			<td>Techne</td>
			<td>FDB02AD</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiji</td>
			<td>National Institutes of Health, Bethesda, MD</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps, Jewelers Dumont No. 5</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F6521</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass bottom microwell dishes</td>
			<td>MatTek</td>
			<td>P35G-1.5-14-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass pasteur pipette</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>11795098</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Invitrogen Ambion mMESSAGE mMACHINE SP6 Transcription Kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>10391175</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica SP8 confocal microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low melting point agarose</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>16520-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic stand</td>
			<td>Narishige</td>
			<td>GJ-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MATLAB</td>
			<td>The MathWorks, Inc., Natick, MA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methylene blue</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M9140-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgSO4</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M-2643</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microinjection system</td>
			<td>Parker</td>
			<td>Picospritzer III</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microloader pipette tips</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5242956003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micromanipulator</td>
			<td>Narishige</td>
			<td>M-152</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette Puller</td>
			<td>Sutter Instrument Company</td>
			<td>Flaming/Brown P-97</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope slide</td>
			<td>Thermo-Scientific</td>
			<td>J1800AMNZ</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PerkinElmer Spinning Disk UltraVIEW ERS, Olympus IX81 spinnng disk confocal microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish (120mm)</td>
			<td>Grenier Bio-One Limited</td>
			<td>632180</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenol red</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P0290-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly(A) Tailing Kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM1350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prism</td>
			<td>GraphPad Software</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Small paintbrush</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectral Applied Research LMM5 laser module</td>
			<td></td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical Scalpel Blade No. 23</td>
			<td>Swann-Morton</td>
			<td>233-5528</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tricaine MS222</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E10521-50G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Volocity software</td>
			<td></td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yokogawa CSU10 spinning disc confocal scanner</td>
			<td>Yokogawa</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

live imaging of chemokine receptors in zebrafish neutrophils during wound responses

Leukocytengeleiding door chemische gradiënten is essentieel voor immuunresponsen. Neutrofielen zijn de eerste cellen die worden gerekruteerd op plaatsen van weefselbeschadiging waar ze cruciale antimicrobiële functies uitvoeren. Hun handel naar deze loci wordt georkestreerd door verschillende inflammatoire chemoattractanten, waaronder chemokines. Op moleculair niveau wordt chemoattractant signalering gereguleerd door de intracellulaire handel van de overeenkomstige receptoren. Het blijft echter onduidelijk hoe subcellulaire veranderingen in chemokinereceptoren de migratiedynamiek van leukocyten op cel- en weefselniveau beïnvloeden. Hier beschrijven we een methodologie voor live beeldvorming en kwantitatieve analyse van chemokinereceptordynamica bij neutrofielen tijdens ontstekingsreacties op weefselschade. Deze hulpmiddelen hebben aangetoond dat differentiële chemokinereceptorhandel in zebravisneutrofielen neutrofielenclustering en verspreiding op plaatsen van weefselbeschadiging coördineert. Dit heeft implicaties voor ons begrip van hoe ontstekingsreacties zichzelf oplossen. De beschreven hulpmiddelen kunnen worden gebruikt om neutrofiele migratiepatronen in verschillende fysiologische en pathologische omgevingen te begrijpen en de methodologie kan worden uitgebreid naar andere signaalreceptoren.

Ventrale vinwonden worden gevolgd door snelle neutrofielenmobilisatie van de CHT in de ventrale vin en clustering aan de wondrand, binnen 30-60 minuten (figuur 1). We visualiseerden de verdeling van twee chemokinereceptoren, Cxcr1 en Cxcr2, die worden uitgedrukt door zebravisneutrofielen24 en Cxcl8a en Cxcl8b14 herkennen, met behulp van confocale microscopie van draaiende schijven. We genereerden twee overeenkomstige transgene lijnen, Tg(lyz:Cxcr1-FT) en Tg(lyz:Cxcr2-FT), waarin neutrofielen een fluorescerende timer (FT) constructie van de receptor tot expressie brengen, d.w.z. een fusie met een tandem van sfGFP en tagRFP (figuur 2 en referentie14). Het gebruik van de twee fluoroforen was bedoeld om monitoring van een breed scala aan receptoren mogelijk te maken en schattingen te geven van de eiwitomzettijd bij het plasmamembraan, omdat nieuw gesynthetiseerde receptoren in groen fluoresceren en geleidelijk rood worden naarmate zeouder worden,14. Deze receptoren bleken echter een snelle constitutieve omzet te hebben bij het neutrofiele plasmamembraan en dat de verblijftijd korter was dan de rijpingstijd van tagRFP, waarbij sfGFP membraanlokalisatie toonde en tagRFP vesiculaire lokalisatie bij steady state (aanvullende video 1 en ref14). Daarom hebben we ons gericht op de distributie van sfGFP om ligand-geïnduceerde internalisatie op plaatsen van weefselschade te controleren. Het patroon van receptorverdeling werd gekwantificeerd met behulp van de contrastmetriek, die verschillen in intensiteit tussen naburige pixels rapporteert. De redenering is dat wanneer de receptorverdeling vliezig en glad is, de contrastwaarde laag is. Wanneer de receptorverdeling vesiculair en punctaat is, is de contrastwaarde hoog (figuur 3).
Een alternatieve methode is het kwantificeren van de verhouding van receptorniveaus (sfGFP-intensiteit) over de niveaus van een controlemembraanmarker, bijvoorbeeld membraan CFP (mCFP) (figuur 3). Beide methoden kunnen receptorinternalisatie detecteren, zoals aangegeven door een meer vesiculaire receptorverdelingspatroon wereldwijd in de cel (hogere contrastwaarde) of lagere receptorniveaus op het membraan (lagere sfGFP / mCFP-verhouding). De contrastmetriek kon echter ook receptorinternalisatie detecteren in neutrofielenclusters aan de wond, waarbij membraansegmentatie minder nauwkeurig en niet toepasbaar was (figuur 3). Met behulp van deze statistiek konden we zichtbare verschillen kwantificeren tussen Cxcr1 en Cxcr2-handel in neutrofielen bij wonden (figuur 4 en aanvullende video 2). Cxcr1-FT geïnternaliseerd in cellen in de wond, terwijl Cxcr2-FT vliezig bleef bij neutrofielen in de wond (figuur 4A-C, aanvullende video 2 en aanvullende video 3). Onderdrukking van Cxcl8a en Cxcl8b, door morfolinobehandeling, beïnvloedde differentieel Cxcr1-FT internalisatie bij wonden (figuur 4C,D). Om verder te valideren dat Cxcr1-FT reageert op Cxcl8a, voerden we chemokineresponstests uit in vroege embryo's. We vonden dat Cxcr1-FT duidelijk geïnternaliseerd was in embryo's waarin Cxcl8a mede tot expressie kwam (figuur 5). Al met al geven deze resultaten aan dat de beschreven methoden kunnen worden ingezet om chemokine-geïnduceerde receptorinternalisatie bij neutrofielen te meten en de identiteit vast te stellen van het ligand dat deze effecten bemiddelt.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61679/61679fig01.jpg"> Figuur 1: Neutrofiele migratie naar ventrale vinwonden. (A) (Links) Cartoon van 3 dpf larve toont de locatie van het caudale hematopoietische weefsel (CHT), de venuscirculatie (VC, blauw), de ventrale vin (VF) en de wondplaats. (Rechts) Cartoon met het gebied van de wond (W) met neutrofielen die worden gemobiliseerd uit de CHT en clustering bij de wond. De caudale ader plexus (CVP) van het CHT-weefsel is blauw getekend. (B) Helder veldbeeld (links) en confocale projectie (rechts) met de ventrale vinwond en de verdeling van neutrofielen in Tg(mpx:GFP)-larven 2 uur na de verwonding. Stippellijnen tonen VF- en CHT-contouren. Schaalbalk = 25 μm. Cartoon en fluorescerend beeld gewijzigd van ref.14 (http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61679/61679fig01large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61679/61679fig02.jpg"> Figuur 2: Live beeldvorming van de handel in chemokinereceptoren bij neutrofielen. (A) Constructen gebruikt voor neutrofiel-specifieke transgene expressie van Cxcr1-FT (Fluorescent Timer) en Cxcr2-FT. Confocale projecties van neutrofielen in het hoofd van een 3 dpf transgene larve (Tg(lyz:Cxcr1-FT), boven; Tg(lyz:Cxcr2-FT), onder) met tRFP (magenta) en sfGFP (groen) kanalen. Schaalbalk = 20 μm. (B) Anatomisch schema van 3 dpf larve zoals in figuur 1A. Onder de larve zijn schema's die het gebied van de wond (W) weergeven met neutrofielen die worden gemobiliseerd van de CHT (boven) of die chemotaxis uitvoeren bij het binnengaan van de ventrale vin (onder). Onderbroken vierkant geeft het gebied aan dat is afgebeeld in snapshots aan de rechterkant. (C) Neutrofielen in Tg(lyz:Cxcr1-FT) larven (sfGFP wordt getoond) bij mobilisatie van de CHT (bovenste panelen) of chemotaxis naar de wond (onderste panelen). Pijlen tonen dezelfde cellen in de loop van de tijd. Tijdpunten op de rechterafbeelding zijn minuten verstreken na afbeelding aan de linkerkant. Schaalbalk = 10 μm. (D) Schematische weergave van experimentele benadering voor live beeldvorming van chemokinereceptorhandel. Panelen A-C gewijzigd van ref.14 (http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61679/61679fig02large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61679/61679fig03.jpg"> Figuur 3: Kwantificeringsvoorbeelden van receptordynamica. Enkele (blauwe) of geclusterde neutrofielen (groen) bij wonden of niet-gemobiliseerde neutrofielen in de CHT (rood, oranje) werden gesegmenteerd en geanalyseerd met verschillende methoden om de resultaten te vergelijken. Dezelfde getoonde voorbeeldcellen werden geanalyseerd met twee methoden om wat er in de afbeelding te zien is te relateren aan het bereik van de geëxtraheerde waarden. (A) Het oppervlak van de geselecteerde voorbeeldcellen is gesegmenteerd op basis van de contourdefinitie in het sfGFP-kanaal. (B) Contrast werd berekend op basis van de voorbeeldcellen in A. (C) Het membraan van de geselecteerde, voorbeeldcellen werd gesegmenteerd op basis van contourdefinitie in het CFP-kanaal. Ratiometrische analyse van sfGFP/CFP volgde. (D) De verhouding sfGFP/CFP werd berekend op de voorbeeldcellen in C. Foutbalken vertegenwoordigen S.E.M. van individuele cellen, in gevallen van n>1 werden de waarden hier niet gebruikt voor statistische analyse, maar slechts om metingen te illustreren die met de verschillende kwantificeringsmethoden zijn verkregen. Schaalbalk = 10 μm. Figuur gewijzigd van ref.14 (http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61679/61679fig03large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61679/61679fig04v2.jpg"> Figuur 4: Differentiële dynamica van Cxcr1 en Cxcr2 als reactie op verwonding. (A) Confocale projectie van neutrofielen in Tg(lyz:Cxcr1-FT) of Tg(lyz:Cxcr2-FT) larven bij de wond 80 min na de verwonding (sfGFP-kanaal getoond). Schaalbalk = 10 μm.  (B) Vergrote Cxcr1-FT neutrofiel (links) en Cxcr2-FT (rechts) bij de wond. Groene receptor wordt weergegeven in grijs. Schaalbalk = 5 μm. (C) Genormaliseerd contrast (contrast per individuele neutrofiel genormaliseerd tot het gemiddelde contrast van niet-gemobiliseerde cellen in de CHT). cxcl8a verwijst naar injectie van een splice-blocking samen met een translatie-blokkerende morpholino voor cxcl8a. cxcl8b verwijst naar injectie met een splice-blocking morpholino voor cxcl8b. Voor Tg(lyz:Cxcr1-FT): n=24 cellen (CHT), n=47 cellen (wond) van 8 larven. Voor Tg(lyz:Cxcr1-FT) met morfolines: n=28 cellen (Cxcl8a-MO) van 5 larven, n=16 cellen (Cxcl8b-MO) van 5 larven. Voor Tg(lyz:Cxcr2-FT): n=10 cellen (CHT) en n=20 cellen (wond) van 3 larven. Gegevens werden samengevoegd van onafhankelijke larven verkregen in 1-5 beeldvormingssessies. Kruskal-Wallis test met Dunn's meerdere vergelijkingstest voor Tg (lyz: Cxcr1-FT), tweezijdige ongepaarde Mann-Whitney-test voor Tg (lyz: Cxcr2-FT). (D) Confocale projectie van neutrofielen in Tg(lyz:Cxcr1-FT) transgene larven behandeld met cxcl8a morpholino (MO) (links) en cxcl8b MO (rechts) die reageren op vinwonden (sfGFP-kanaal weergegeven in groen). Snapshot genomen op tijdstippen van equivalente neutrofielenaccumulatie (85 min na verwonding in linkerbeeld en 45 min na verwonding in rechterbeeld). Schaalbalk = 10 μm. Figuur gewijzigd van ref.14 (http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61679/61679fig04large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61679/61679fig05.jpg"> Figuur 5: Chemokine respons assay in vroege embryo's. Laserscanning van confocale plakjes gastruleren embryo's die expressie en distributie van Cxcr1-FT vertonen. 100 pg Cxcr1-FT mRNA werd geïnjecteerd in eieren in één celstadium met of zonder 150 pg Cxcl8a mRNA. Groene en rode receptoren worden in afzonderlijke kanalen weergegeven. Controlemembraan CFP marker (mCFP) wordt weergegeven in het cyaan kanaal. Schaalbalk = 20 μm. Figuur gewijzigd van ref.14 (http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61679/61679fig05large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
Aanvullende film 1: Transgene neutrofielen in het hoofd van een Tg(lyz:Cxcr1-FT) (links) en Tg(lyz:Cxcr2-FT) (rechts) larve bij 3 dpf. sfGFP (groen), tagRFP (magenta). Frame-interval is 30 sec en framesnelheid is 5 fps. Schaalbalk = 20 μm. Video is afkomstig van ref.14 (http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/). <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61679/Supplementary_Movie1.avi" target="_blank">Klik hier om deze video te downloaden.</a>
Aanvullende film 2: Neutrofielen bij Tg(lyz:Cxcr1-FT) (links) en Tg(lyz:Cxcr2-FT) (rechts) transgene larven die reageren op vinwonden. De film begint binnen 10 minuten na het verwonden en duurt 60 min. sfGFP (groen), tagRFP (magenta). Frame-interval is 30 sec en framesnelheid is 10 fps. CHT = caudaal hematopoietisch weefsel. VF = ventrale vin. Schaalbalk = 25 μm. Video is afkomstig van ref.14 (http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/). <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61679/Supplementary_Movie2.avi" target="_blank">Klik hier om deze video te downloaden.</a>
Aanvullende film 3. Aanvullende voorbeelden van neutrofielen van een gewonde Tg(lyz:Cxcr1- FT) transgene larve (andere larve dan die getoond in Video 2), verkregen met een hogere resolutie, met receptorinternalisatie (sfGFP-kanaal weergegeven in groen) bij mobilisatie in de CHT of bij binnenkomst en chemotaxis in de ventrale vin. Frame-interval is 30 sec en framesnelheid is 2 fps. Schaalbalk = 10 μm. Video is afkomstig van ref.14 (http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/). <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61679/Supplementary_Movie3.avi" target="_blank">Klik hier om deze video te downloaden.</a>
Aanvullend bestand 1: <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61679/Supplementary%20file%201.m" target="_blank">Klik hier om dit bestand te downloaden.</a>
Aanvullend bestand 2: <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61679/Supplementary%20file%202.m" target="_blank">Klik hier om dit bestand te downloaden.</a>
Aanvullend bestand 3: <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61679/Supplementary%20file%203.m" target="_blank">Klik hier om dit bestand te downloaden.</a>
Aanvullend bestand 4: <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61679/Supplementary%20file%204.m" target="_blank">Klik hier om dit bestand te downloaden.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Live Imaging of Chemokine Receptors in Zebrafish Neutrophils During Wound Responses at JoVE.com

Live Imaging of Chemokine Receptors in Zebrafish Neutrophils During Wound Responses

Hier beschrijven we protocollen voor het uitvoeren van live beeldvorming en kwantitatieve analyse van chemoattractante receptordynamiek bij zebravisneufielen

Live imaging van chemokinereceptoren bij zebravisneutrofielen tijdens wondreacties

Leukocyte guidance by chemical gradients is essential for immune responses. Neutrophils are the first cells to be recruited to sites of tissue damage ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

In vivo Imaging of Transgenic Leishmania Parasites in a Live Host

In vivo Imaging of Transgenic Leishmania Parasites in a Live Host

In vivo imaging van transgene Leishmania parasieten in een Live Host

Distinct species of Leishmania, a protozoan parasite of the family Trypanosomatidae, typically cause different human disease manifestations. The most ...

Retroviral Transduction of T-cell Receptors in Mouse T-cells

Retrovirale Transductie van T-cel-receptoren in Mouse T-cellen

T-cell receptors (TCRs) play a central role in the immune system. TCRs on T-cell surfaces can specifically recognize peptide antigens presented by antigen ...

Non-invasive Imaging of Disseminated Candidiasis in Zebrafish Larvae

Niet-invasieve beeldvorming van gedissemineerde candidiasis in de zebravis Larven

Disseminated candidiasis caused by the pathogen Candida albicans is a clinically important problem in hospitalized individuals and is associated with a 30 ...

Visualization of Bacterial Toxin Induced Responses Using Live Cell Fluorescence Microscopy

Visualisatie van bacteriële toxine geïnduceerde responsen met Live Cell Fluorescentie Microscopie

Bacterial toxins bind to cholesterol in membranes, forming pores that allow for leakage of cellular contents and influx of materials from the external ...

Real-time Imaging of Heterotypic Platelet-neutrophil Interactions on the Activated Endothelium During Vascular Inflammation and Thrombus Formation in Live Mice

Real-time beeldvorming van heterotypische Bloedplaatjes-neutrofiele Interacties op het geactiveerd endotheel tijdens vasculaire ontsteking en trombose in Live Muizen

Interaction of activated platelets and leukocytes (mainly neutrophils) on the activated endothelium mediates thrombosis and vascular inflammation.1,2 ...

Characterization of Inflammatory Responses During Intranasal Colonization with Streptococcus pneumoniae

Characterization of Inflammatory Responses During Intranasal Colonization with Streptococcus pneumoniae

Karakterisering van inflammatoire reacties tijdens intranasale kolonisatie met Streptococcus pneumoniae

Nasopharyngeal colonization by Streptococcus pneumoniae is a prerequisite to invasion to the lungs or bloodstream1. This organism is capable of colonizing ...

Imaging Neutrophils and Monocytes in Mesenteric Veins by Intravital Microscopy on Anaesthetized Mice in Real Time

Beeldvorming van neutrofielen en monocyten in Mesenteriale Veins door Intravitale Microscopie op verdoofd muizen in Real Time

Efficient immune response is dependent on rapid mobilization of blood leukocytes to the site of infection or injury. Investigating leukocyte migration in ...

Measuring Physiological Responses of Drosophila Sensory Neurons to Lipid Pheromones Using Live Calcium Imaging

Measuring Physiological Responses of Drosophila Sensory Neurons to Lipid Pheromones Using Live Calcium Imaging

Meten van fysiologische reacties<em&gt; Drosophila</em&gt; Sensorische neuronen te Lipid Feromonen met Live Calcium Imaging

Unlike mammals, insects such as Drosophila have multiple taste organs. The chemosensory neurons on the legs, proboscis, wings and ovipositor of Drosophila ...

Live Imaging of Antifungal Activity by Human Primary Neutrophils and Monocytes in Response to A. fumigatus

Live Imaging of Antifungal Activity by Human Primary Neutrophils and Monocytes in Response to A. fumigatus

Live-Imaging van antischimmelactiviteit door Human Primary neutrofielen en monocyten in reactie op<em&gt; A. fumigatus</em

Aspergillus fumigatus is an opportunistic fungal pathogen causing invasive infections in immunocompromised hosts with a high case-fatality rate. Research ...