Name: live imaging of chemokine receptors in zebrafish neutrophils during wound responses
Uploaded: 2020-12-04T13:30:00
Duration: 6 min 48 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Live Imaging of Chemokine Receptors in Zebrafish Neutrophils During Wound Responses at JoVE.com

Nous remercions Christine Holt et Bill Harris pour leur aide en microscopie confocale. Nous remercions Darren Gilmour pour les constructions de l’épine dorsale de la minuterie fluorescente et Anna Huttenlocher pour le vecteur de l’épine dorsale Tol2-Lyz. Nous remercions Steve Renshaw pour la ligne Tg(mpx:GFP)i114 . Ce travail a été soutenu par le MRC (MR/L019523/1), le Wellcome Trust [204845/Z/16/Z]; Isaac Newton Trust [12.21(a)i] et une subvention Isaac Newton Trust 19.23(n). C.C. a été soutenu par une bourse d’études mrc DTP et en partie par le Wellcome Trust [204845/Z/16/Z]; Isaac Newton Trust [12.21(a)i] subvention. H.W. a été soutenu par une bourse d’études mrc pao. H.P. a été soutenu par une bourse de doctorat Wellcome Trust (105391/Z/14/Z) et en partie par un Wellcome Trust [204845/Z/16/Z]; Isaac Newton Trust [12.21(a)i] et la MRC (MR/L019523/1).

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Les auteurs ne déclarent aucun conflit d’intérêts

La méthode décrite permet l’imagerie en direct de la dynamique des récepteurs en réponse à des ligands endogènes in situ lors d’une réponse inflammatoire à des lésions tissulaires. L’utilisation de rapporteurs de neutrophiles Cxcr1/Cxcr2 pourrait être étendue à d’autres contextes physiologiques, tels que les infections, les modèles tumoraux ou d’autres types de lésions tissulaires 14,25,26,27. En outre, les lignes de sauvetage transgéniques, dans lesquelles le récepteur endogène est supprimé et sauvé par un récepteur mutant exogène, pourraient fournir des outils utiles pour disséquer l’importance de schémas de migration de neutrophiles spécifiques dans les réponses immunitaires. Par exemple, les mutants du récepteur Cxcr1 qui ont une désensibilisation altérée provoquent un regroupement plus important des neutrophiles aux sites inflammatoires14. Ce gain de phénotype fonctionnel pourrait être utilisé pour comprendre le rôle de la congrégation des neutrophiles dans différents processus physiologiques, par exemple la réparation des plaies, les maladies infectieuses ou l’évolution tumorale, et compléter les expériences de destruction / élimination des récepteurs. La méthodologie fournit également une base pour élargir l’éventail des déclarants disponibles. Le choix du rapporteur fluorescent est important à considérer et dépend de la question biologique. Nous avons constaté que le renouvellement constitutif de ces récepteurs de chimiokine dans les neutrophiles était élevé, par rapport aux cellules épithéliales, et que les rapporteurs à maturation rapide (par exemple, sfGFP) étaient tenus de signaler les niveaux membranaires à l’état d’équilibre et de résoudre les différences lors de la stimulation des neutrophiles 8,14. Ainsi, les rapports membranaires de sfGFP/tagRFP ne sont pas applicables pour mesurer l’internalisation induite par les ligands dans ce type de cellule, mais le modèle de tagRFP permet de suivre le destin intracellulaire du récepteur, ce qui pourrait être utile dans certaines études. Nous avons également constaté que le signal intracellulaire plus concentré de tagRFP est utile pour le dépistage des larves individuelles. Une autre approche pour mesurer les niveaux de récepteurs au niveau de la membrane plasmique consisterait à co-exprimer un marqueur de membrane fluorescente dans les neutrophiles soit dans le même transgène9, soit dans un transgèneindépendant 14. Dans le premier scénario, le transgène fournirait un moyen supplémentaire de criblage des poissons et les niveaux d’expression seraient comparables entre le marqueur et le récepteur. Cette dernière approche serait plus modulaire, en ce sens qu’une ligne de poisson-zèbre avec un rapporteur de récepteur pourrait être combinée avec différentes lignes de rapporteur. Dans les deux cas, il convient de noter que la quantification membranaire des niveaux de récepteurs est difficile chez les neutrophiles groupés (voir ci-dessous). Enfin, nous notons qu’une extension possible de ce protocole serait de suivre l’imagerie en direct par immunohistochimie pour des analyses de localisation plus détaillées.
Le système de transgénèse Tol2 est bien établi7 et le promoteur du lysozyme C a été largement utilisé pour l’expression des neutrophiles11,15. L’approche de la transgénèse est donc relativement simple et le niveau d’expression atteint avec ce promoteur est suffisamment élevé pour fournir un contraste suffisant pour l’analyse de la dynamique des récepteurs. Une limitation possible est que le niveau d’expression ne récapitule pas les niveaux d’expression des récepteurs endogènes. De nouvelles technologies CRISPR pourraient être déployées pour établir des lignes d’inction pour les récepteurs présentant un intérêt particulier28. Ces technologies sont encore lourdes et ne garantissent peut-être pas les niveaux d’expression requis pour l’imagerie subcellulaire, mais leur développement réussi serait une percée importante pour la compréhension de la dynamique de signalisation endogène. Les validations fonctionnelles sont importantes pour interpréter les données avec des constructions de récepteurs transgéniques. Par exemple, les tests de reconnaissance de ligand peuvent être utilisés pour établir que la protéine de fusion fluorescente est fonctionnelle et le sauvetage des phénotypes knockout pourrait être utilisé pour établir que les niveaux d’expression des neutrophiles transgéniques sont compatibles avec la fonctionnalité14. Enfin, un moyen plus direct de valider la fusion des récepteurs serait d’utiliser un test fonctionnel in vitro avec un récepteur marqué aux côtés des versions non marquées14.
L’approche de quantification aborde des difficultés spécifiques dans la segmentation précise de la membrane chez les neutrophiles in vivo. Dans les cellules de nature épithéliale, la quantification des niveaux de récepteurs peut être effectuée automatiquement en normalisant les niveaux de récepteurs membranaires en un marqueur de contrôle, qui peut être exprimé en tandem ou séparément9. En effet, nous avons appliqué une telle approche, lors de l’utilisation du test de reconnaissance de ligand dans des embryons gastrulés14. Cependant, les neutrophiles subissent des changements complexes et rapides dans la forme cellulaire in vivo, ce qui rend la segmentation membranaire difficile à la fois en 2D et en 3D14. Ceci est encore plus difficile lorsque les neutrophiles se regroupent, ce qui se produit dans de nombreux contextes physiologiques29. La mesure de contraste surmonte cette limitation car elle ne nécessite pas de segmentation membranaire mais reflète plutôt l’état global de la distribution des récepteurs dans la cellule (membraneuse / lisse vs vésiculeuse / pointilleuse). Il est important de noter que la mesure du contraste peut être affectée par le contraste global de l’image, de sorte que la normalisation des valeurs cellulaires individuelles à une référence interne est nécessaire pour tenir compte de la variabilité du signal dans différents embryons / échantillons. Par exemple, nous avons utilisé la valeur moyenne de contraste cellulaire des neutrophiles non réactifs dans le CHT (c.-à-d. les neutrophiles qui restent stationnaires et ne migrent pas dans la nageoire ventrale)14. Une possibilité supplémentaire serait de normaliser avec les valeurs de contraste d’un marqueur de contrôle dans la même cellule. Cela fournirait une solution lorsqu’une référence interne de cellules non répondantes n’est pas disponible et pourrait probablement résoudre des différences quantitatives plus fines dans la dynamique des récepteurs entre différentes conditions.
L’emplacement de l’imagerie est une autre variable à considérer. La raison du choix de la plaie de la nageoire ventrale ici, par opposition au modèle16,30 de la plaie de la nageoire caudale plus couramment utilisé, est que le site de la blessure est à proximité du site de résidence des neutrophiles / origine migratoire. Cela accélère la chronologie du test, car il faut relativement peu de temps pour que les neutrophiles arrivent. En outre, il offre la possibilité de capturer le comportement des cellules à la fois à l’origine de la migration (CHT) et à l’emplacement cible d’intérêt (plaie). Ceci est pertinent ici, car la résolution spatiale et temporelle requise pour l’imagerie subcellulaire est difficile à combiner avec un grand champ de vision ou un balayage multi-positions. Ainsi, le test de la plaie de la nageoire ventrale permet de suivre l’évolution de la réponse migratoire à partir de l’origine de la migration et de capturer simultanément les fluctuations non spécifiques des récepteurs dans les cellules qui ne répondent pas. Comme mentionné ci-dessus, ce dernier est utile à des fins de quantification car il fournit une référence interne pour les dynamiques non spécifiques. Dans d’autres systèmes, il peut ne pas être possible d’avoir une telle référence interne, auquel cas les valeurs de contraste d’un marqueur membranaire co-exprimé fourniraient un autre contrôle.
En résumé, nous prévoyons que la méthodologie est applicable à d’autres systèmes et peut être déployée à diverses fins. Par exemple, les mêmes rapporteurs pourraient être utilisés dans d’autres contextes inflammatoires, tels que les contextes d’infection ou d’autres modèles de maladie. Le répertoire des lignes rapporteures des récepteurs du poisson-zèbre pourrait être étendu à d’autres récepteurs de signalisation, afin de comprendre les mécanismes de signalisation ou de rapporter la dynamique des ligands in vivo. L’approche peut être combinée avec des techniques knockdown/knockout pour interroger la base mécaniste de la dynamique observée. Par exemple, la perturbation de l’expression du ligand peut indiquer la dépendance du ligand pour la dynamique des récepteurs observée. À l’avenir, nous envisageons que le système pourrait être encore affiné pour intégrer l’insertion directe de journalistes. En fin de compte, les résultats utilisant cette méthodologie fourniraient de nouvelles informations précieuses au-delà de la communauté des poissons-zèbres, compte tenu de la conservation de ces récepteurs de signalisation chez les mammifères et du défi relatif de mener ces études dans des organismes plus grands.

La migration des leucocytes est d’une importance capitale pour les réponses immunitaires. Les cellules immunitaires sont des cellules migratrices prototypiques, qui sont remarquablement capables de traverser les tissus et les vaisseaux sanguins et de détecter une gamme de signaux de guidage chimique pour migrer de manière directionnelle vers les microbes ou d’autres cellules hôtes importantes. Des directives correctes reposent sur la reconnaissance des chimioattractifs, parmi lesquels les chimiokines représentent la catégorie1 la plus importante. Les chimiokines sont reconnues par des récepteurs couplés à la protéine G à sept transmembranes très spécifiques. Lors de la liaison à la chimiokine, les récepteurs de la chimiokine changent de conformation conduisant à l’activation des protéines G trimériques associées et à leur dissociation en sous-unités de signalisation fonctionnelles qui favorisent les changements cytosquelettiques et la migration dirigée1. Secondairement, les récepteurs de la chimiokine sont phosphorylés, et cette modification conduit à une désensibilisation à l’attractif, qui peut être suivie d’une re-sensibilisation / recyclage rapide ou d’une dégradation intracellulaire et d’une régulation négative de la surface cellulaire2. Ces dynamiques de récepteurs influencent la durée et la dose de signalisation reçues par les cellules, mais la façon dont elles affectent le comportement de migration des leucocytes a été difficile à élucider in vivo.
Le suivi de la dynamique des récepteurs dans les leucocytes vivants dans les systèmes traditionnels des mammifères fait face à plusieurs défis. Pour les études vivantes, les fusions de récepteurs avec des protéines fluorescentes doivent être exprimées dans les cellules. Ceci est difficile dans les leucocytes primaires, en particulier dans les neutrophiles, et des études ont jusqu’à présent utilisé des lignées cellulaires de neutrophiles de substitution pour exprimer les récepteursde chimiokine 3,4. La génération de modèles murins transgéniques, dans lesquels les leucocytes expriment un récepteur fluorescent ou des récepteurs mutants présentant des défauts de trafic informatifs 5,6, implique un investissement considérable en temps et en ressources. Même dans ces cas, la résolution d’imagerie et le contraste pour la dynamique des récepteurs d’imagerie chez l’animal vivant peuvent être limités et des études ont utilisé l’immunohistochimie sur des sections de tissus fixes5. Compte tenu de ces défis techniques, notre compréhension de la façon dont la dynamique des récepteurs chimioattractifs affecte le comportement cellulaire dans un environnement tissulaire vivant est actuellement limitée.
Nous fournissons ici une méthodologie pour surveiller le trafic de récepteurs dans les neutrophiles du poisson-zèbre. Les poissons-zèbres sont génétiquement traitables, comme les souris, mais la transgénèse est relativement plus simple grâce à l’utilisation de systèmes de transposon efficaces et à la manipulation directe des zygotes7. La larve transparente se prête idéalement à l’imagerie. La dynamique des récepteurs de la chimiokine a été visualisée dans les cellules germinales primordiales et la ligne latérale primordium par l’expression de fusions correspondantes avec des rapporteurs fluorescents 8,9,10. Les larves de poisson zèbre sont équipées de neutrophiles matures qui ont des propriétés génétiques et cellulaires hautement conservées par rapport aux neutrophiles de mammifères. La dynamique de signalisation subcellulaire telle que la dynamique du cytosquelette et les régulateurs de polarité ont été visualisées dans ces cellules par la génération de lignées transgéniques correspondantes 11,12,13. Récemment, nous avons visualisé et analysé fonctionnellement la dynamique des récepteurs de la chimiokine chez les neutrophiles au cours des réponses inflammatoires aux lésions tissulaires14. Ici, nous décrivons la génération de lignes rapporteures transgéniques pour la signalisation des chimiokines dans les neutrophiles, la préparation d’embryons pour l’imagerie vivante, un test de plaie pour l’étude de la signalisation des neutrophiles et le protocole d’acquisition et d’analyse d’images. Nous fournissons également un protocole parallèle pour tester les réponses des récepteurs de chimiokine aux ligands candidats, ce qui est utile pour essayer d’établir des modèles de reconnaissance de ligand dans des récepteurs non caractérisés. Ces techniques peuvent être utilisées en combinaison avec d’autres manipulations génétiques, telles que l’inhibition de l’expression endogène de la chimiokine ou la génération de récepteurs mutants avec un trafic altéré induit par un ligand, pour interroger comment la dynamique de signalisation spécifique affecte le comportement des leucocytes in vivo. Les lignées transgéniques exprimant des récepteurs de chimiokine marqués par fluorescence peuvent également être utilisées comme rapporteurs pour les gradients endogènes de chimiokine, qui sont autrement difficiles à détecter par coloration directe des anticorps. La méthodologie décrite permet d’étendre la génération de rapporteurs à d’autres récepteurs d’immuno-signalisation.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>1-phenyl-2-thiourea</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P7629-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50mL CellStar Centrifuge Tube</td>
			<td>Grenier Bio-One Limited</td>
			<td>210270</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clark capillary glass</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>30-0020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cleanline Thin Bleach</td>
			<td>Scientific Laboratory Supplies</td>
			<td>CLE0301</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting scope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>SMZ645</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dri Block heater</td>
			<td>Techne</td>
			<td>FDB02AD</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiji</td>
			<td>National Institutes of Health, Bethesda, MD</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps, Jewelers Dumont No. 5</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F6521</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass bottom microwell dishes</td>
			<td>MatTek</td>
			<td>P35G-1.5-14-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass pasteur pipette</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>11795098</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Invitrogen Ambion mMESSAGE mMACHINE SP6 Transcription Kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>10391175</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica SP8 confocal microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low melting point agarose</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>16520-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic stand</td>
			<td>Narishige</td>
			<td>GJ-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MATLAB</td>
			<td>The MathWorks, Inc., Natick, MA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methylene blue</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M9140-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgSO4</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M-2643</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microinjection system</td>
			<td>Parker</td>
			<td>Picospritzer III</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microloader pipette tips</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5242956003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micromanipulator</td>
			<td>Narishige</td>
			<td>M-152</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette Puller</td>
			<td>Sutter Instrument Company</td>
			<td>Flaming/Brown P-97</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope slide</td>
			<td>Thermo-Scientific</td>
			<td>J1800AMNZ</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PerkinElmer Spinning Disk UltraVIEW ERS, Olympus IX81 spinnng disk confocal microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish (120mm)</td>
			<td>Grenier Bio-One Limited</td>
			<td>632180</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenol red</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P0290-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly(A) Tailing Kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM1350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prism</td>
			<td>GraphPad Software</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Small paintbrush</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectral Applied Research LMM5 laser module</td>
			<td></td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical Scalpel Blade No. 23</td>
			<td>Swann-Morton</td>
			<td>233-5528</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tricaine MS222</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E10521-50G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Volocity software</td>
			<td></td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yokogawa CSU10 spinning disc confocal scanner</td>
			<td>Yokogawa</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

live imaging of chemokine receptors in zebrafish neutrophils during wound responses

Le guidage des leucocytes par gradients chimiques est essentiel pour les réponses immunitaires. Les neutrophiles sont les premières cellules à être recrutées sur des sites de lésions tissulaires où elles exécutent des fonctions antimicrobiennes cruciales. Leur trafic vers ces loci est orchestré par plusieurs chimioattractants inflammatoires, dont des chimiokines. Au niveau moléculaire, la signalisation chimioattractante est régulée par le trafic intracellulaire des récepteurs correspondants. Cependant, on ne sait toujours pas comment les changements subcellulaires dans les récepteurs de la chimiokine affectent la dynamique de la migration des leucocytes au niveau des cellules et des tissus. Nous décrivons ici une méthodologie pour l’imagerie en direct et l’analyse quantitative de la dynamique des récepteurs de la chimiokine dans les neutrophiles au cours des réponses inflammatoires aux lésions tissulaires. Ces outils ont révélé que le trafic différentiel des récepteurs de chimiokine dans les neutrophiles du poisson-zèbre coordonne le regroupement et la dispersion des neutrophiles sur les sites de lésions tissulaires. Cela a des implications pour notre compréhension de la façon dont les réponses inflammatoires sont auto-résolues. Les outils décrits pourraient être utilisés pour comprendre les schémas de migration des neutrophiles dans une variété de contextes physiologiques et pathologiques et la méthodologie pourrait être étendue à d’autres récepteurs de signalisation.

La blessure de la nageoire ventrale est suivie d’une mobilisation rapide des neutrophiles du TCS dans la nageoire ventrale et d’un regroupement à la marge de la plaie, dans les 30 à 60 minutes (Figure 1). Nous avons visualisé la distribution de deux récepteurs de chimiokine, Cxcr1 et Cxcr2, qui sont exprimés par les neutrophiles de poisson zèbre24 et reconnaissent Cxcl8a et Cxcl8b14, en utilisant la microscopie confocale à disque rotatif. Nous avons généré deux lignées transgéniques correspondantes, Tg(lyz:Cxcr1-FT) et Tg(lyz:Cxcr2-FT), dans lesquelles les neutrophiles expriment une construction de minuterie fluorescente (FT) du récepteur, c’est-à-dire une fusion avec un tandem de sfGFP et de tagRFP (Figure 2 et référence14). L’utilisation des deux fluorophores visait à permettre la surveillance d’un large éventail de devenirs de récepteurs et à fournir des estimations du temps de renouvellement des protéines au niveau de la membrane plasmique, car les récepteurs nouvellement synthétisés se fluorescenceaient en vert et deviendraient progressivement rouges à mesure qu’ils vieillissaientà l’âge de 8,14 ans. Cependant, il a été constaté que ces récepteurs avaient un renouvellement constitutif rapide au niveau de la membrane plasmique neutrophile et que le temps de séjour était plus court que le temps de maturation du tagRFP, le sfGFP montrant la localisation de la membrane et le tagRFP montrant la localisation vésiculeuse à l’état d’équilibre (vidéo supplémentaire 1 et réf14). Par conséquent, nous nous sommes concentrés sur la distribution de sfGFP pour surveiller l’internalisation induite par les ligands sur les sites de lésions tissulaires. Le modèle de distribution des récepteurs a été quantifié à l’aide de la métrique de contraste, qui rapporte des différences d’intensité entre les pixels voisins. La raison en est que lorsque la distribution du récepteur est membraneuse et lisse, la valeur de contraste est faible. Lorsque la distribution du récepteur est vésiculeuse et plus ponctuée, la valeur de contraste est élevée (Figure 3).
Une autre méthode consiste à quantifier le rapport entre les niveaux de récepteurs (intensité sfGFP) et les niveaux d’un marqueur de membrane de contrôle, par exemple la CFP membranaire (mCFP) (Figure 3). Les deux méthodes pourraient détecter l’internalisation des récepteurs, comme l’indiquent un schéma de distribution plus vésiculeux des récepteurs à l’échelle mondiale dans la cellule (valeur de contraste plus élevée) ou des niveaux de récepteurs plus faibles au niveau de la membrane (rapport sfGFP/mCFP plus faible). Cependant, la mesure de contraste pouvait également détecter l’internalisation des récepteurs dans les grappes de neutrophiles au niveau de la plaie, dans lesquelles la segmentation membranaire était moins précise et non applicable (figure 3). À l’aide de cette mesure, nous avons pu quantifier les différences visibles entre le trafic de neutrophiles Cxcr1 et Cxcr2 au niveau des plaies (figure 4 et vidéo supplémentaire 2). Cxcr1-FT internalisé dans les cellules situées au niveau de la plaie tandis que Cxcr2-FT est resté membraneux dans les neutrophiles au niveau de la plaie (Figure 4A-C, Vidéo supplémentaire 2 et Vidéo supplémentaire 3). La suppression de Cxcl8a et Cxcl8b, par traitement morpholino, a affecté différemment l’internalisation de Cxcr1-FT au niveau des plaies (Figure 4C,D). Pour valider davantage que Cxcr1-FT répond à Cxcl8a, nous avons effectué des tests de réponse à la chimiokine chez les embryons précoces. Nous avons constaté que Cxcr1-FT était nettement internalisé chez les embryons chez lesquels Cxcl8a était co-exprimé (Figure 5). Dans l’ensemble, ces résultats indiquent que les méthodes décrites peuvent être déployées pour mesurer l’internalisation des récepteurs induite par la chimiokine chez les neutrophiles et établir l’identité du ligand médiant ces effets.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61679/61679fig01.jpg"> Figure 1 : Migration des neutrophiles vers les plaies de la nageoire ventrale. (A) (À gauche) Caricature de 3 larves de dpf montrant l’emplacement du tissu hématopoïétique caudal (CHT), la circulation vénusienne (VC, bleu), la nageoire ventrale (VF) et le site de la plaie. (À droite) Dessin animé représentant la zone de la plaie (W) avec des neutrophiles mobilisés du CHT et se regroupant sur la plaie. Le plexus de la veine caudale (CVP) du tissu CHT est dessiné en bleu. (B) Image en champ lumineux (à gauche) et projection confocale (à droite) montrant la plaie de la nageoire ventrale et la distribution des neutrophiles chez les larves de Tg(mpx:GFP) 2 h après la blessure. Les lignes pointillées montrent les contours VF et CHT. Barre d’échelle = 25 μm. Dessin animé et image fluorescente modifié à partir de la réf.14 (http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61679/61679fig01large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61679/61679fig02.jpg"> Figure 2 : Imagerie en direct du trafic des récepteurs de chimiokine dans les neutrophiles. (A) Constructions utilisées pour l’expression transgénique spécifique aux neutrophiles de Cxcr1-FT (Fluorescent Timer) et Cxcr2-FT. Projections confocales de neutrophiles dans la tête d’une larve transgénique de 3 dpf (Tg(lyz:Cxcr1-FT), en haut; Tg(lyz:Cxcr2-FT), en bas) montrant les canaux tRFP (magenta) et sfGFP (vert). Barre d’échelle = 20 μm. (B) Schéma anatomique de 3 larves de dpf comme dans la figure 1A. Sous la larve se trouvent des schémas représentant la zone de la plaie (W) avec des neutrophiles mobilisés à partir du CHT (en haut) ou effectuant une chimiotaxie à l’entrée de la nageoire ventrale (en bas). Le carré pointillé indique la zone imagée dans les instantanés à droite. (C) Neutrophiles chez les larves de Tg(lyz:Cxcr1-FT) (sfGFP est montré) lors de la mobilisation du CHT (panneaux supérieurs) ou de la chimiotaxie vers la plaie (panneaux inférieurs). Les flèches montrent les mêmes cellules au fil du temps. Les points de temps sur l’image de droite sont des minutes écoulées après l’image de gauche. Barre d’échelle = 10 μm. (D) Représentation schématique de l’approche expérimentale pour l’imagerie en direct du trafic des récepteurs de chimiokine. Panneaux A-C modifiés par rapport à la réf.14 (http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61679/61679fig02large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61679/61679fig03.jpg"> Figure 3 : Exemples de quantification de la dynamique des récepteurs. Des neutrophiles simples (bleus) ou groupés (verts) au niveau des plaies ou des neutrophiles non mobilisés dans le TCS (rouge, orange) ont été segmentés et analysés par différentes méthodes pour comparer les résultats. Les mêmes exemples de cellules ont été analysés avec deux méthodes pour relier ce qui est vu dans l’image avec la plage de valeurs extraites. (A) La surface des exemples de cellules sélectionnés a été segmentée en fonction de la définition du contour dans le canal sfGFP. (B) Le contraste a été calculé à partir des cellules d’exemple montrées dans A. (C) La membrane des cellules d’exemple sélectionnées a été segmentée en fonction de la définition de contour dans le canal CFP. L’analyse ratiométrique de la SFFP/PCP a suivi. (D) Le rapport sfGFP/CFP a été calculé sur les exemples de cellules présentés dans C. Les barres d’erreur représentent S.E.M. à partir de cellules individuelles, dans les cas de n>1, les valeurs ici n’ont pas été utilisées pour l’analyse statistique mais simplement pour illustrer les mesures obtenues avec les différentes méthodes de quantification. Barre d’échelle = 10 μm. Figure modifiée par rapport à la réf.14 (http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61679/61679fig03large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61679/61679fig04v2.jpg"> Figure 4 : Dynamique différentielle de Cxcr1 et Cxcr2 en réponse à la blessure. (A) Projection confocale de neutrophiles chez les larves de Tg(lyz:Cxcr1-FT) ou de Tg(lyz:Cxcr2-FT) au niveau de la plaie à 80 min après la blessure (canal sfGFP montré). Barre d’échelle = 10 μm.  (B) Neutrophile Cxcr1-FT agrandi (à gauche) et Cxcr2-FT (à droite) au niveau de la plaie. Le récepteur vert est représenté en gris. Barre d’échelle = 5 μm. (C) Contraste normalisé (contraste par neutrophile individuel normalisé au contraste moyen des cellules non mobilisées dans le CHT). cxcl8a fait référence à l’injection d’un bloqueur d’épissure avec un morpholino bloquant la traduction pour cxcl8a. cxcl8b fait référence à l’injection avec un morpholino bloquant l’épissure pour cxcl8b. Pour Tg(lyz:Cxcr1-FT) : n=24 cellules (CHT), n=47 cellules (plaie) de 8 larves. Pour Tg(lyz:Cxcr1-FT) avec morpholinos : n=28 cellules (Cxcl8a-MO) de 5 larves, n=16 cellules (Cxcl8b-MO) de 5 larves. Pour Tg(lyz:Cxcr2-FT) : n=10 cellules (CHT) et n=20 cellules (plaie) de 3 larves. Les données ont été regroupées à partir de larves indépendantes acquises au cours de 1 à 5 séances d’imagerie. Test kruskal-Wallis avec le test de comparaisons multiples de Dunn pour Tg(lyz:Cxcr1-FT), test mann-Whitney non apparié à deux queues pour Tg(lyz:Cxcr2-FT). (D) Projection confocale de neutrophiles chez des larves transgéniques Tg(lyz:Cxcr1-FT) traitées avec cxcl8a morpholino (MO) (à gauche) et cxcl8b MO (à droite) répondant à des plaies à nageoires (canal sfGFP en vert). Instantané pris à des moments d’accumulation équivalente de neutrophiles (85 min post-blessure dans l’image de gauche et 45 min de post-blessure dans l’image de droite). Barre d’échelle = 10 μm. Figure modifiée par rapport à la réf.14 (http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61679/61679fig04large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61679/61679fig05.jpg"> Figure 5 : Test de réponse à la chimiokine chez les embryons précoces. Des tranches confocales à balayage laser d’embryons gazogènes montrant l’expression et la distribution de Cxcr1-FT. 100 pg d’ARNm Cxcr1-FT ont été injectés dans des ovules au stade cellulaire avec ou sans ARNm Cxcl8a de 150 pg. Les récepteurs verts et rouges sont montrés dans des canaux séparés. Le marqueur CFP de la membrane de contrôle (mCFP) est représenté dans le canal cyan. Barre d’échelle = 20 μm. Figure modifiée par rapport à la réf.14 (http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61679/61679fig05large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
Film supplémentaire 1: Neutrophiles transgéniques dans la tête d’une larve Tg(lyz:Cxcr1-FT) (à gauche) et Tg(lyz:Cxcr2-FT) (à droite) à 3 dpf. sfGFP(vert), tagRFP (magenta). L’intervalle d’images est de 30 secondes et la fréquence d’images est de 5 ips. Barre d’échelle = 20 μm. La vidéo provient de la réf.14 (http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/). <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61679/Supplementary_Movie1.avi" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour télécharger cette vidéo.</a>
Film supplémentaire 2: Neutrophiles chez les larves transgéniques Tg(lyz:Cxcr1-FT) (à gauche) et Tg(lyz:Cxcr2-FT) (à droite) répondant aux plaies des nageoires. Le film commence dans les 10 minutes suivant la blessure et dure 60 min. sfGFP (vert), tagRFP (magenta). L’intervalle d’images est de 30 secondes et la fréquence d’images est de 10 ips. CHT = tissu hématopoïétique caudal. VF = nageoire ventrale. Barre d’échelle = 25 μm. La vidéo provient de la réf.14 (http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/). <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61679/Supplementary_Movie2.avi" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour télécharger cette vidéo.</a>
Film supplémentaire 3. Exemples supplémentaires de neutrophiles provenant d’une larve transgénique Tg(lyz:Cxcr1-FT) blessée (larve différente de celle montrée dans la vidéo 2), acquise à une résolution plus élevée, montrant l’internalisation du récepteur (canal sfGFP en vert) lors de la mobilisation dans le CHT ou à l’entrée et la chimiotaxie dans la nageoire ventrale. L’intervalle d’images est de 30 secondes et la fréquence d’images est de 2 ips. Barre d’échelle = 10 μm. La vidéo provient de la réf.14 (http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/). <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61679/Supplementary_Movie3.avi" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour télécharger cette vidéo.</a>
Dossier supplémentaire 1 : <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61679/Supplementary%20file%201.m" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.</a>
Dossier supplémentaire 2 : <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61679/Supplementary%20file%202.m" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.</a>
Dossier supplémentaire 3 : <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61679/Supplementary%20file%203.m" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.</a>
Dossier supplémentaire 4 : <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61679/Supplementary%20file%204.m" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.</a>

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Live Imaging of Chemokine Receptors in Zebrafish Neutrophils During Wound Responses

Nous décrivons ici les protocoles permettant d’effectuer une imagerie en direct et une analyse quantitative de la dynamique des récepteurs chimioattractifs chez les neutrophiles du poisson-zèbre

Imagerie en direct des récepteurs de chimiokine dans les neutrophiles du poisson-zèbre pendant les réponses des plaies

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