Name: live imaging of chemokine receptors in zebrafish neutrophils during wound responses
Uploaded: 2020-12-04T13:30:00
Duration: 6 min 48 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Live Imaging of Chemokine Receptors in Zebrafish Neutrophils During Wound Responses at JoVE.com

Wir danken Christine Holt und Bill Harris für die Hilfe bei der konfokalen Mikroskopie. Wir danken Darren Gilmour für die fluoreszierenden Timer-Backbone-Konstrukte und Anna Huttenlocher für den Tol2-Lyz-Backbone-Vektor. Wir danken Steve Renshaw für die Tg(mpx:GFP)i114 Linie. Diese Arbeit wurde vom MRC (MR/L019523/1), dem Wellcome Trust [204845/Z/16/Z] unterstützt; Isaac Newton Trust [12.21(a)i] und ein Isaac Newton Trust Grant 19.23(n). C.C. wurde von einem MRC DTP-Stipendium und teilweise vom Wellcome Trust [204845/Z/16/Z] unterstützt; Isaac Newton Trust [12.21(a)i] gewähren. H.W. wurde von einem MRC DTP Studentship unterstützt. H.P. wurde durch ein Wellcome Trust PhD Grant (105391/Z/14/Z) und teilweise durch einen Wellcome Trust [204845/Z/16/Z] unterstützt; Isaac Newton Trust [12.21(a)i] Grant und das MRC (MR/L019523/1).

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Die Autoren erklären keinen Interessenkonflikt

Die beschriebene Methode ermöglicht eine Live-Bildgebung der Rezeptordynamik als Reaktion auf endogene Liganden in situ während einer Entzündungsreaktion auf Gewebeschäden. Die Verwendung von Cxcr1/Cxcr2-Neutrophilenreportern könnte auf andere physiologische Umgebungen wie Infektionen, Tumormodelle oder andere Arten von Gewebeschädenausgeweitet werden 14,25,26,27. Darüber hinaus könnten transgene Rettungslinien, bei denen der endogene Rezeptor von einem exogenen mutierten Rezeptor unterdrückt und gerettet wird, nützliche Werkzeuge liefern, um die Bedeutung spezifischer neutrophiler Migrationsmuster bei Immunantworten zu analysieren. Zum Beispiel verursachen Cxcr1-Rezeptor-Mutanten, die eine gestörte Desensibilisierung haben, eine prominentere Neutrophilen-Clusterbildung an Entzündungsstellen14. Dieser Funktionsgewinn-Phänotyp könnte verwendet werden, um die Rolle der Neutrophilenansammlung in verschiedenen physiologischen Prozessen zu verstehen, z. B. Wundreparatur, Infektionskrankheiten oder Tumorevolution, und Rezeptor-Knockdown- / Knockout-Experimente zu ergänzen. Die Methodik bietet auch eine Grundlage, um das Spektrum der verfügbaren Reporter zu erweitern. Die Wahl des fluoreszierenden Reporters ist wichtig zu berücksichtigen und hängt von der biologischen Frage ab. Wir fanden heraus, dass der konstitutive Umsatz dieser Chemokinrezeptoren in Neutrophilen im Vergleich zu Epithelzellen hoch warund dass Reporter mit schneller Reifung (z. B. sfGFP) verpflichtet waren, Membranspiegel im stationären Zustand zu melden und Unterschiede bei Neutrophilenstimulation aufzulösen 8,14. Daher sind Membranverhältnisse von sfGFP / tagRFP nicht anwendbar, um die ligandeninduzierte Internalisierung in diesem Zelltyp zu messen, aber das Muster von tagRFP ermöglicht die Verfolgung der intrazellulären Schicksale des Rezeptors, was in einigen Studien nützlich sein könnte. Wir fanden auch heraus, dass das konzentriertere intrazelluläre Signal von tagRFP für das Screening einzelner Larven nützlich ist. Ein alternativer Ansatz zur Messung der Rezeptorspiegel an der Plasmamembran wäre die Co-Expression eines fluoreszierenden Membranmarkers in Neutrophilen entweder im selben Transgen9 oder in einem unabhängigen Transgen14. Im ersten Szenario würde das Transgen ein zusätzliches Mittel für das Screening der Fische darstellen und die Expressionsniveaus wären zwischen dem Marker und dem Rezeptor vergleichbar. Der letztere Ansatz wäre modularer, da eine Zebrafischlinie mit einem Rezeptorreporter mit verschiedenen Reporterlinien kombiniert werden könnte. In beiden Fällen ist es erwähnenswert, dass die Membranquantifizierung der Rezeptorspiegel bei geclusterten Neutrophilen eine Herausforderung darstellt (siehe unten). Schließlich stellen wir fest, dass eine mögliche Erweiterung dieses Protokolls darin bestehen würde, die Live-Bildgebung durch Immunhistochemie für detailliertere Lokalisierungsanalysen zu verfolgen.
Das Tol2-Transgenesesystem ist gut etabliert7 und der Lysozym-C-Promotor wurde ausgiebig für die neutrophile Expression11,15 verwendet. Der Transgeneseansatz ist daher relativ einfach und das mit diesem Promotor erreichte Expressionsniveau ist hoch genug, um einen ausreichenden Kontrast für die Analyse der Rezeptordynamik zu bieten. Eine mögliche Einschränkung besteht darin, dass das Expressionsniveau nicht die endogenen Rezeptorexpressionsniveaus rekapituliert. Neue CRISPR-Technologien könnten eingesetzt werden, um Knock-in-Leitungen für Rezeptoren von besonderem Interessezu etablieren 28. Diese Technologien sind immer noch umständlich und garantieren möglicherweise nicht die erforderlichen Expressionsniveaus für die subzelluläre Bildgebung, aber ihre erfolgreiche Entwicklung wäre ein wichtiger Durchbruch für das Verständnis der endogenen Signaldynamik. Funktionelle Validierungen sind wichtig, um Daten mit transgenen Rezeptorkonstrukten zu interpretieren. Zum Beispiel können Ligandenerkennungsassays verwendet werden, um festzustellen, dass das fluoreszierende Fusionsprotein funktionell ist, und die Rettung von Knockout-Phänotypen könnte verwendet werden, um festzustellen, ob die transgenen neutrophilen Expressionsniveaus mit der Funktionalitätkompatibel sind 14. Schließlich wäre eine direktere Möglichkeit, die Rezeptorfusion zu validieren, die Verwendung eines in vitro funktionellen Assays mit markiertem Rezeptor neben nicht markierten Versionen14.
Der Quantifizierungsansatz adressiert spezifische Schwierigkeiten bei der genauen Membransegmentierung in Neutrophilen in vivo. In Zellen epithelialer Natur kann die Quantifizierung der Rezeptorspiegel automatisch durchgeführt werden, indem die Membranrezeptorspiegel auf einen Kontrollmarker normalisiert werden, der im Tandem oder separat ausgedrückt werden kann9. In der Tat haben wir einen solchen Ansatz angewandt, als wir den Ligandenerkennungsassay bei gastrulierenden Embryonen14 verwendeten. Neutrophile durchlaufen jedoch in vivo komplexe, schnelle Veränderungen der Zellform, was die Membransegmentierung sowohl in 2D als auch in 3Derschwert 14. Dies ist noch schwieriger, wenn sich Neutrophile häufen, was in vielen physiologischen Umgebungen vorkommt29. Die Kontrastmetrik überwindet diese Einschränkung, da sie keine Membransegmentierung erfordert, sondern den Gesamtzustand der Rezeptorverteilung in der Zelle widerspiegelt (membranös / glatt vs. vesikulär / punktförmig). Es ist wichtig zu beachten, dass die Kontrastmetrik durch den Gesamtkontrast des Bildes beeinflusst werden kann, so dass eine Normalisierung einzelner Zellwerte auf eine interne Referenz erforderlich ist, um die Variabilität des Signals in verschiedenen Embryonen / Proben zu berücksichtigen. Zum Beispiel verwendeten wir den mittleren Zellkontrastwert von nicht reagierenden Neutrophilen in der CHT (d.h. Neutrophilen, die stationär bleiben und nicht in die Bauchflosse wandern)14. Eine zusätzliche Möglichkeit wäre, mit Kontrastwerten eines Kontrollmarkers in derselben Zelle zu normalisieren. Dies würde eine Lösung bieten, wenn keine interne Referenz von nicht reagierenden Zellen verfügbar ist, und könnte wahrscheinlich feinere quantitative Unterschiede in der Rezeptordynamik zwischen verschiedenen Bedingungen auflösen.
Der Speicherort der Bildgebung ist eine weitere zu berücksichtigende Variable. Der Grund für die Wahl der Bauchflossenwunde hier, im Gegensatz zu der häufiger verwendeten Heckflossenwunde Modell16,30, ist, dass der Ort der Verwundung in der Nähe des Ortes des neutrophilen Wohnsitzes / Migrationsursprungs liegt. Dies beschleunigt die Zeitleiste des Assays, da es relativ wenig Zeit braucht, bis Neutrophile ankommen. Darüber hinaus bietet es die Möglichkeit, das Zellverhalten sowohl am Migrationsursprung (CHT) als auch am Zielort von Interesse (Wunde) zu erfassen. Dies ist hier relevant, da die räumliche und zeitliche Auflösung, die für die subzelluläre Bildgebung erforderlich ist, schwer mit einem großen Sichtfeld oder Multipositions-Scanning zu kombinieren ist. So erlaubt der ventrale Flossenwundassay die Verfolgung der Entwicklung der Migrationsreaktion vom Migrationsursprung und die gleichzeitige Erfassung unspezifischer Rezeptorschwankungen in Zellen, die nicht reagieren. Wie bereits erwähnt, ist letzteres für Quantifizierungszwecke nützlich, da es eine interne Referenz für unspezifische Dynamiken bietet. In anderen Systemen ist es möglicherweise nicht möglich, eine solche interne Referenz zu haben, in diesem Fall würden die Kontrastwerte eines co-exprimierten Membranmarkers eine alternative Kontrolle bieten.
Zusammenfassend gehen wir davon aus, dass die Methodik auf andere Systeme anwendbar ist und für eine Vielzahl von Zwecken eingesetzt werden kann. Zum Beispiel könnten die gleichen Reporter in anderen entzündlichen Umgebungen wie Infektionseinstellungen oder anderen Krankheitsmodellen eingesetzt werden. Das Repertoire der Zebrafischrezeptor-Reporterlinien könnte auf andere Signalrezeptoren erweitert werden, um Signalmechanismen zu verstehen oder die Ligandendynamik in vivo zu melden. Der Ansatz kann mit Knockdown/Knockout-Techniken kombiniert werden, um die mechanistischen Grundlagen der beobachteten Dynamik zu hinterfragen. Zum Beispiel kann eine Störung der Ligandenexpression die Ligandenabhängigkeit für die beobachtete Rezeptordynamik anzeigen. In Zukunft stellen wir uns vor, dass das System weiter verfeinert werden könnte, um die Knock-in-Einfügung von Reportern zu integrieren. Letztendlich würden Ergebnisse, die diese Methodik verwenden, neue Erkenntnisse liefern, die über die Zebrafischgemeinschaft hinaus wertvoll sind, angesichts der Erhaltung dieser Signalrezeptoren bei Säugetieren und der relativen Herausforderung, diese Studien in größeren Organismen durchzuführen.

Die Leukozytenmigration ist von größter Bedeutung für die Immunantwort. Immunzellen sind prototypische wandernde Zellen, die bemerkenswert in der Lage sind, Gewebe und Blutgefäße zu durchqueren und eine Reihe von chemischen Führungshinweisen zu erfassen, um in Richtung Mikroben oder andere wichtige Wirtszellen zu wandern. Die korrekte Führung beruht auf der Erkennung von Chemolockstoffen, unter denen Chemokine die prominenteste Kategorie1 darstellen. Chemokine werden von hochspezifischen sieben-transmembranigen G-Protein-gekoppelten Rezeptoren erkannt. Bei der Chemokinbindung ändern Chemokinrezeptoren die Konformation, was zur Aktivierung assoziierter trimeraler G-Proteine und deren Dissoziation in funktionelle Signaluntereinheiten führt, die zytoskelettale Veränderungen und gerichtete Migration fördern1. Sekundär werden Chemokinrezeptoren phosphoryliert, und diese Modifikation führt zu einer Desensibilisierung des Lockstoffs, der eine schnelle Resensibilisierung / Recycling oder intrazellulärer Abbau und Herunterregulierung von der Zelloberfläche folgenkann 2. Diese Rezeptordynamik beeinflusst die Dauer und Dosis der Signalübertragung, die von den Zellen empfangen wird, aber wie sie das Migrationsverhalten der Leukozyten beeinflussen, war in vivo schwer zu erklären.
Die Verfolgung der Rezeptordynamik in lebenden Leukozyten in traditionellen Säugetiersystemen steht vor mehreren Herausforderungen. Für Lebendstudien müssen Rezeptorfusionen mit fluoreszierenden Proteinen in den Zellen exprimiert werden. Dies ist in primären Leukozyten, insbesondere bei Neutrophilen, eine Herausforderung, und Studien haben bisher Surrogat-Neutrophilen-Zelllinien verwendet, um Chemokinrezeptorenzu exprimieren 3,4. Die Generierung transgener Mausmodelle, in denen Leukozyten einen fluoreszierenden Rezeptor oder mutierte Rezeptoren mit informativen Trafficking-Defekten5,6 exprimieren, ist mit einem erheblichen Zeit- und Ressourcenaufwand verbunden. Selbst in diesen Fällen können die Bildgebungsauflösung und der Kontrast für die bildgebende Rezeptordynamik im lebenden Tier begrenzt sein, und Studien haben Immunhistochemie an fixierten Gewebeabschnitten5 verwendet. Angesichts dieser technischen Herausforderungen ist unser Verständnis darüber, wie die Dynamik von Chemoattraktorrezeptoren das Zellverhalten in einem lebenden Gewebe beeinflusst, derzeit begrenzt.
Hier stellen wir eine Methodik zur Überwachung des Rezeptorhandels in Zebrafisch-Neutrophilen vor. Zebrafische sind genetisch behandelbar, wie Mäuse, aber die Transgenese ist durch den Einsatz effizienter Transposonsysteme und direkter Zygotenmanipulation relativ einfach7. Die transparente Larve ist ideal bildgebend. Die Dynamik des Chemokinrezeptors wurde in primordialen Keimzellen und der Laterallinie Primordium durch Expression entsprechender Fusionen mit fluoreszierenden Reporternvisualisiert 8,9,10. Zebrafischlarven sind mit reifen Neutrophilen ausgestattet, die hochgradig konservierte genetische und zelluläre Eigenschaften in Bezug auf Neutrophile von Säugetieren aufweisen. Subzelluläre Signaldynamiken wie zytoskelettale Dynamik und Polaritätsregulatoren wurden in diesen Zellen durch die Erzeugung entsprechender transgener Linien11,12,13 visualisiert. Kürzlich haben wir die Chemokinrezeptordynamik in Neutrophilen im Verlauf von Entzündungsreaktionen auf Gewebeschäden visualisiert und funktionell analysiert14. Hier beschreiben wir die Erzeugung transgener Reporterlinien für die Chemokinsignalisierung in Neutrophilen, die Vorbereitung von Embryonen für die Live-Bildgebung, einen Wundassay zur Untersuchung der Neutrophilensignalisierung und das Protokoll für die Aufnahme und Analyse von Bildern. Wir bieten auch ein Nebenprotokoll zum Testen von Chemokinrezeptorreaktionen auf Kandidatenliganden, was nützlich ist, wenn versucht wird, Ligandenerkennungsmuster in nicht charakterisierten Rezeptoren zu etablieren. Diese Techniken können in Kombination mit weiteren genetischen Manipulationen, wie der Hemmung der endogenen Chemokinexpression oder der Erzeugung mutierter Rezeptoren mit verändertem Liganden-induziertem Trafficking, verwendet werden, um zu untersuchen, wie sich spezifische Signaldynamiken auf das Verhalten von Leukozyten in vivo auswirken. Die transgenen Linien, die fluoreszierend markierte Chemokinrezeptoren exprimieren, können auch als Reporter für endogene Chemokingradienten verwendet werden, die sonst durch direkte Antikörperfärbung schwer nachzuweisen sind. Die beschriebene Methodik bietet Spielraum für die Ausweitung der Erzeugung von Reportern auf andere Immunsignalrezeptoren.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>1-phenyl-2-thiourea</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P7629-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50mL CellStar Centrifuge Tube</td>
			<td>Grenier Bio-One Limited</td>
			<td>210270</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clark capillary glass</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>30-0020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cleanline Thin Bleach</td>
			<td>Scientific Laboratory Supplies</td>
			<td>CLE0301</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting scope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>SMZ645</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dri Block heater</td>
			<td>Techne</td>
			<td>FDB02AD</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiji</td>
			<td>National Institutes of Health, Bethesda, MD</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps, Jewelers Dumont No. 5</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F6521</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass bottom microwell dishes</td>
			<td>MatTek</td>
			<td>P35G-1.5-14-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass pasteur pipette</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>11795098</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Invitrogen Ambion mMESSAGE mMACHINE SP6 Transcription Kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>10391175</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica SP8 confocal microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low melting point agarose</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>16520-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic stand</td>
			<td>Narishige</td>
			<td>GJ-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MATLAB</td>
			<td>The MathWorks, Inc., Natick, MA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methylene blue</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M9140-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgSO4</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M-2643</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microinjection system</td>
			<td>Parker</td>
			<td>Picospritzer III</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microloader pipette tips</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5242956003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micromanipulator</td>
			<td>Narishige</td>
			<td>M-152</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette Puller</td>
			<td>Sutter Instrument Company</td>
			<td>Flaming/Brown P-97</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope slide</td>
			<td>Thermo-Scientific</td>
			<td>J1800AMNZ</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PerkinElmer Spinning Disk UltraVIEW ERS, Olympus IX81 spinnng disk confocal microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish (120mm)</td>
			<td>Grenier Bio-One Limited</td>
			<td>632180</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenol red</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P0290-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly(A) Tailing Kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM1350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prism</td>
			<td>GraphPad Software</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Small paintbrush</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectral Applied Research LMM5 laser module</td>
			<td></td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical Scalpel Blade No. 23</td>
			<td>Swann-Morton</td>
			<td>233-5528</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tricaine MS222</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E10521-50G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Volocity software</td>
			<td></td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yokogawa CSU10 spinning disc confocal scanner</td>
			<td>Yokogawa</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

live imaging of chemokine receptors in zebrafish neutrophils during wound responses

Leukozytenführung durch chemische Gradienten ist essentiell für Immunantworten. Neutrophile sind die ersten Zellen, die an Stellen von Gewebeschäden rekrutiert werden, wo sie entscheidende antimikrobielle Funktionen ausführen. Ihr Handel zu diesen Loci wird durch mehrere entzündliche Chemoattraktantien, einschließlich Chemokine, orchestriert. Auf molekularer Ebene wird die Chemoattraktus-Signalgebung durch den intrazellulären Transport der entsprechenden Rezeptoren reguliert. Es bleibt jedoch unklar, wie subzelluläre Veränderungen in Chemokinrezeptoren die Migrationsdynamik von Leukozyten auf Zell- und Gewebeebene beeinflussen. Hier beschreiben wir eine Methodik für die Live-Bildgebung und quantitative Analyse der Chemokinrezeptordynamik in Neutrophilen während Entzündungsreaktionen auf Gewebeschäden. Diese Werkzeuge haben gezeigt, dass der differentielle Chemokinrezeptor-Verkehr in Zebrafisch-Neutrophilen die Neutrophilen-Clusterbildung und -Ausbreitung an Orten der Gewebeschädigung koordiniert. Dies hat Auswirkungen auf unser Verständnis, wie Entzündungsreaktionen selbstgelöst werden. Die beschriebenen Werkzeuge könnten verwendet werden, um neutrophile Migrationsmuster in einer Vielzahl von physiologischen und pathologischen Umgebungen zu verstehen, und die Methodik könnte auf andere Signalrezeptoren ausgeweitet werden.

Auf die ventrale Flossenverwundung folgt eine schnelle Neutrophilenmobilisierung von der CHT in die Bauchflosse und eine Häufung am Wundrand innerhalb von 30-60 Minuten (Abbildung 1). Wir haben die Verteilung von zwei Chemokinrezeptoren, Cxcr1 und Cxcr2, visualisiert, die von Zebrafisch-Neutrophilen24 exprimiert werden und Cxcl8a und Cxcl8b14 mittels konfokaler Mikroskopie erkennen. Wir erzeugten zwei entsprechende transgene Linien, Tg(lyz:Cxcr1-FT) und Tg(lyz:Cxcr2-FT), in denen Neutrophile ein fluoreszierendes Timer-Konstrukt (FT) des Rezeptors exprimieren, d.h. eine Fusion mit einem Tandem aus sfGFP und tagRFP (Abbildung 2 und Referenz14). Die Verwendung der beiden Fluorophore sollte die Überwachung eines breiten Spektrums von Rezeptorschicksalen ermöglichen und Schätzungen der Proteinumsatzzeit an der Plasmamembran liefern, da neu synthetisierte Rezeptoren im Alter von 8,14 Jahren grün fluoreszieren und allmählich rot werden. Es wurde jedoch festgestellt, dass diese Rezeptoren einen schnellen konstitutiven Umsatz an der neutrophilen Plasmamembran aufweisen und dass die Verweilzeit kürzer war als die Reifezeit von tagRFP, wobei sfGFP eine Membranlokalisation und tagRFP eine vesikuläre Lokalisation im stationären Zustand zeigte (Ergänzendes Video 1 und Referenz14). Daher konzentrierten wir uns auf die Verteilung von sfGFP, um die ligandeninduzierte Internalisierung an Stellen von Gewebeschäden zu überwachen. Das Muster der Rezeptorverteilung wurde mit der Kontrastmetrik quantifiziert, die Intensitätsunterschiede zwischen benachbarten Pixeln meldet. Die Begründung ist, dass, wenn die Rezeptorverteilung membranös und glatt ist, der Kontrastwert niedrig ist. Wenn die Rezeptorverteilung vesikulär und punktförmiger ist, ist der Kontrastwert hoch (Abbildung 3).
Eine alternative Methode besteht darin, das Verhältnis von Rezeptorspiegeln (sfGFP-Intensität) zu den Spiegeln eines Kontrollmembranmarkers, z. B. Membran-CFP (mCFP), zu quantifizieren (Abbildung 3). Beide Methoden konnten die Rezeptorinternalisierung nachweisen, wie es durch ein stärkeres vesikuläres Rezeptorverteilungsmuster weltweit in der Zelle (höherer Kontrastwert) oder niedrigere Rezeptorspiegel an der Membran (niedrigeres sfGFP/mCFP-Verhältnis) angezeigt wird. Die Kontrastmetrik konnte jedoch auch die Rezeptorinternalisierung in Neutrophilenclustern an der Wunde nachweisen, in denen die Membransegmentierung weniger genau und nicht anwendbar war (Abbildung 3). Mit dieser Metrik konnten wir sichtbare Unterschiede zwischen dem Cxcr1- und Cxcr2-Handel mit Neutrophilen an Wunden quantifizieren (Abbildung 4 und ergänzendes Video 2). Cxcr1-FT internalisiert in Zellen an der Wunde, während Cxcr2-FT in Neutrophilen an der Wunde membranös blieb (Abbildung 4A-C, Supplementary Video 2 und Supplementary Video 3). Unterdrückung von Cxcl8a und Cxcl8b durch Morpholino-Behandlung, differentiell beeinflusste Cxcr1-FT-Internalisierung an Wunden (Abbildung 4C,D). Um weiter zu validieren, dass Cxcr1-FT auf Cxcl8a anspricht, führten wir Chemokin-Antwort-Assays in frühen Embryonen durch. Wir fanden heraus, dass Cxcr1-FT deutlich in Embryonen internalisiert wurde, in denen Cxcl8a co-exprimiert wurde (Abbildung 5). Insgesamt deuten diese Ergebnisse darauf hin, dass die beschriebenen Methoden eingesetzt werden können, um die Chemokin-induzierte Rezeptorinternalisierung in Neutrophilen zu messen und die Identität des Liganden, der diese Effekte vermittelt, festzustellen.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61679/61679fig01.jpg"> Abbildung 1: Neutrophile Migration zu ventralen Flossenwunden. (A) (Links) Karikatur der 3 dpf-Larve, die die Lage des kaudalen hämatopoetischen Gewebes (CHT), der Venuszirkulation (VC, blau), der Bauchflosse (VF) und der Wundstelle zeigt. (Rechts) Karikatur, die den Bereich der Wunde (W) mit Neutrophilen darstellt, die von der CHT mobilisiert werden und sich an der Wunde gruppieren. Der Plexus caudalis cauda (CVP) des CHT-Gewebes ist blau gezeichnet. (B) Hellfeldbild (links) und konfokale Projektion (rechts), die die ventrale Flossenwunde und die Verteilung der Neutrophilen in Tg(mpx:GFP)-Larven bei 2 h nach der Wunde zeigt. Gestrichelte Linien zeigen VF- und CHT-Umrisse. Maßstabsleiste = 25 μm. Cartoon und fluoreszierendes Bild modifiziert von Ref.14 (http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61679/61679fig01large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61679/61679fig02.jpg"> Abbildung 2: Live-Bildgebung des Handels von Chemokinrezeptoren in Neutrophilen. (A) Konstrukte, die für die neutrophilenspezifische transgene Expression von Cxcr1-FT (Fluorescent Timer) und Cxcr2-FT verwendet werden. Konfokale Projektionen von Neutrophilen im Kopf einer 3 dpf transgenen Larve (Tg(lyz:Cxcr1-FT), oben; Tg(lyz:Cxcr2-FT), unten) mit tRFP (Magenta) und sfGFP (grün) Kanälen. Maßstabsleiste = 20 μm. (B) Anatomisches Schema von 3 dpf Larve wie in Abbildung 1A. Unterhalb der Larve befinden sich Schemata, die den Bereich der Wunde (W) mit Neutrophilen darstellen, die von der CHT (oben) mobilisiert werden oder beim Eintritt in die Bauchflosse (unten) Chemotaxis durchführen. Gestricheltes Quadrat zeigt den Bereich an, der in Schnappschüssen auf der rechten Seite abgebildet ist. (C) Neutrophile in Tg(lyz:Cxcr1-FT)-Larven (sfGFP ist gezeigt) bei Mobilisierung von der CHT (obere Panels) oder Chemotaxis in Richtung der Wunde (untere Panels). Pfeile zeigen die gleichen Zellen im Laufe der Zeit. Zeitpunkte auf dem rechten Bild sind Minuten, die nach dem Bild auf der linken Seite verstrichen sind. Maßstabsstab = 10 μm. (D) Schematische Darstellung des experimentellen Ansatzes für die Live-Bildgebung des Chemokinrezeptor-Transports. Panels A-C modifiziert von Ref.14 (http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61679/61679fig02large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61679/61679fig03.jpg"> Abbildung 3: Quantifizierungsbeispiele der Rezeptordynamik. Einzelne (blaue) oder geclusterte Neutrophile (grün) an Wunden oder nicht mobilisierte Neutrophile in der CHT (rot, orange) wurden segmentiert und mit verschiedenen Methoden analysiert, um die Ergebnisse zu vergleichen. Die gleichen gezeigten Beispielzellen wurden mit zwei Methoden analysiert, um das, was im Bild zu sehen ist, mit dem extrahierten Wertebereich in Beziehung zu setzen. (A) Die Oberfläche der ausgewählten Beispielzellen wurde basierend auf der Konturdefinition im sfGFP-Kanal segmentiert. (B) Der Kontrast wurde aus den in A gezeigten Beispielzellen berechnet. (C) Die Membran der ausgewählten Beispielzellen wurde auf der Grundlage der Konturdefinition im CFP-Kanal segmentiert. Es folgte eine ratiometrische Analyse von sfGFP/CFP. (D) Das Verhältnis von sfGFP/CFP wurde an den in C gezeigten Beispielzellen berechnet. Fehlerbalken stellen S.E.M. aus einzelnen Zellen dar, im Fall von n>1 wurden die Werte hier nicht für statistische Analysen verwendet, sondern lediglich als Beispiel für Messungen, die mit den verschiedenen Quantifizierungsmethoden erhalten wurden. Maßstabsleiste = 10 μm. Abbildung geändert von Ref.14 (http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61679/61679fig03large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61679/61679fig04v2.jpg"> Abbildung 4: Differentialdynamik von Cxcr1 und Cxcr2 als Reaktion auf Verwundung. (A) Konfokale Projektion von Neutrophilen in Tg(lyz:Cxcr1-FT)- oder Tg(lyz:Cxcr2-FT)-Larven an der Wunde bei 80 min nach der Wunde (sfGFP-Kanal gezeigt). Maßstabsleiste = 10 μm.  (B) Vergrößertes Cxcr1-FT-Neutrophil (links) und Cxcr2-FT (rechts) an der Wunde. Grüner Rezeptor ist in Grau dargestellt. Skalenbalken = 5 μm. (C) Normalisierter Kontrast (Kontrast pro individuellem Neutrophilen, normalisiert auf den mittleren Kontrast von nicht mobilisierten Zellen in der CHT). CXCl8A bezieht sich auf die Injektion eines Spleißblockers zusammen mit einem translationsblockierenden Morpholino für CXCL8A. CXCl8B bezieht sich auf die Injektion mit einem Spleiß-blockierenden Morpholino für CXCl8B. Für Tg(lyz:Cxcr1-FT): n=24 Zellen (CHT), n=47 Zellen (Wunde) von 8 Larven. Für Tg(lyz:Cxcr1-FT) mit Morpholinos: n=28 Zellen (Cxcl8a-MO) aus 5 Larven, n=16 Zellen (Cxcl8b-MO) aus 5 Larven. Für Tg(lyz:Cxcr2-FT): n=10 Zellen (CHT) und n=20 Zellen (Wunde) aus 3 Larven. Die Daten wurden von unabhängigen Larven gepoolt, die in 1-5 Bildgebungssitzungen aufgenommen wurden. Kruskal-Wallis-Test mit Dunns multiplem Vergleichstest für Tg(lyz:Cxcr1-FT), zweiseitiger ungepaarter Mann-Whitney-Test für Tg(lyz:Cxcr2-FT). (D) Konfokale Projektion von Neutrophilen in Tg(lyz:Cxcr1-FT) transgenen Larven, die mit cxcl8a morpholino (MO) (links) und cxcl8b MO (rechts) behandelt wurden, die auf Flossenwunden ansprechen (sfGFP-Kanal grün dargestellt). Schnappschuss aufgenommen zu Zeitpunkten äquivalenter Neutrophilenakkumulation (85 min nach der Verwundung im linken Bild und 45 min nach der Verwundung im rechten Bild). Maßstabsleiste = 10 μm. Abbildung geändert von Ref.14 (http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61679/61679fig04large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61679/61679fig05.jpg"> Abbildung 5: Chemokin-Response-Assay in frühen Embryonen. Laserscanning konfokaler Scheiben von gastrulatierenden Embryonen, die Expression und Verteilung von Cxcr1-FT zeigen. 100 pg Cxcr1-FT mRNA wurden in ein Zellstadium Eizellen mit oder ohne 150 pg Cxcl8a mRNA injiziert. Grüne und rote Rezeptoren werden in separaten Kanälen gezeigt. Der Kontrollmembran-CFP-Marker (mCFP) ist im Cyan-Kanal dargestellt. Maßstabsleiste = 20 μm. Abbildung geändert von Ref.14 (http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61679/61679fig05large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.</a>
Zusatzfilm 1: Transgene Neutrophile im Kopf einer Tg(lyz:Cxcr1-FT) (links) und Tg(lyz:Cxcr2-FT) (rechts) Larve bei 3 dpf. sfGFP (grün), tagRFP (magenta). Das Bildintervall beträgt 30 Sekunden und die Bildrate 5 fps. Maßstabsleiste = 20 μm. Das Video stammt aus Ref.14 (http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/). <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61679/Supplementary_Movie1.avi" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um dieses Video herunterzuladen.</a>
Zusatzfilm 2: Neutrophile in Tg(lyz:Cxcr1-FT) (links) und Tg(lyz:Cxcr2-FT) (rechts) transgenen Larven, die auf Flossenwunden reagieren. Der Film beginnt innerhalb von 10 Minuten nach der Wunde und dauert 60 Minuten. sfGFP (grün), tagRFP (magenta). Das Bildintervall beträgt 30 Sekunden und die Bildrate 10 fps. CHT = kaudales hämatopoetisches Gewebe. VF = Bauchflosse. Maßstabsleiste = 25 μm. Das Video stammt aus Ref.14 (http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/). <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61679/Supplementary_Movie2.avi" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um dieses Video herunterzuladen.</a>
Zusatzfilm 3. Zusätzliche Beispiele von Neutrophilen aus einer verwundeten transgenen Tg(lyz:Cxcr1- FT)-Larve (andere Larve als in Video 2), die mit höherer Auflösung aufgenommen wurden und eine Rezeptorinternalisierung (sfGFP-Kanal grün dargestellt) bei Mobilisierung in der CHT oder beim Eintritt und Chemotaxis in der Bauchflosse zeigen. Das Bildintervall beträgt 30 Sekunden und die Bildrate 2 fps. Maßstabsleiste = 10 μm. Das Video stammt aus Ref.14 (http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/). <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61679/Supplementary_Movie3.avi" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um dieses Video herunterzuladen.</a>
Ergänzungsdatei 1: <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61679/Supplementary%20file%201.m" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.</a>
Ergänzungsdatei 2: <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61679/Supplementary%20file%202.m" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.</a>
Ergänzungsdatei 3: <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61679/Supplementary%20file%203.m" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.</a>
Ergänzungsdatei 4: <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61679/Supplementary%20file%204.m" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.</a>

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Live Imaging of Chemokine Receptors in Zebrafish Neutrophils During Wound Responses

Hier beschreiben wir Protokolle zur Durchführung von Live-Bildgebung und quantitativer Analyse der Chemoattraktanrezeptordynamik in Zebrafisch-Neutrophilen

Live-Bildgebung von Chemokinrezeptoren in Zebrafisch-Neutrophilen während Wundreaktionen

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

In vivo Imaging of Transgenic Leishmania Parasites in a Live Host

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In-vivo-Imaging von transgenen Leishmania Parasiten in einer Live-Host

Distinct species of Leishmania, a protozoan parasite of the family Trypanosomatidae, typically cause different human disease manifestations. The most ...

Forschung

Immunologie und Infektion

Retroviral Transduction of T-cell Receptors in Mouse T-cells

Retrovirale Transduktion von T-Zell-Rezeptoren in Maus-T-Zellen

T-cell receptors (TCRs) play a central role in the immune system. TCRs on T-cell surfaces can specifically recognize peptide antigens presented by antigen ...

Non-invasive Imaging of Disseminated Candidiasis in Zebrafish Larvae

Nicht-invasive Bildgebung von disseminierter Candidiasis in Zebrafischlarven

Disseminated candidiasis caused by the pathogen Candida albicans is a clinically important problem in hospitalized individuals and is associated with a 30 ...

Visualization of Bacterial Toxin Induced Responses Using Live Cell Fluorescence Microscopy

Visualisierung der bakteriellen Toxin induzierten Reaktionen mit Live Cell Fluoreszenzmikroskopie

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Charakterisierung von Entzündungsreaktionen während der intranasalen Kolonisation mit Streptococcus pneumoniae

Nasopharyngeal colonization by Streptococcus pneumoniae is a prerequisite to invasion to the lungs or bloodstream1. This organism is capable of colonizing ...

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