Name: live imaging of chemokine receptors in zebrafish neutrophils during wound responses
Uploaded: 2020-12-04T13:30:00
Duration: 6 min 48 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Live Imaging of Chemokine Receptors in Zebrafish Neutrophils During Wound Responses at JoVE.com

Ringraziamo Christine Holt e Bill Harris per l'aiuto con la microscopia confocale. Ringraziamo Darren Gilmour per i costrutti della spina dorsale del timer fluorescente e Anna Huttenlocher per il vettore backbone Tol2-Lyz. Ringraziamo Steve Renshaw per la linea Tg(mpx:GFP)i114 . Questo lavoro è stato supportato dal MRC (MR/L019523/1), dal Wellcome Trust [204845/Z/16/Z]; Isaac Newton Trust [12.21(a)i] e una sovvenzione Isaac Newton Trust 19.23(n). C.C. è stato supportato da un MRC DTP studentship e in parte dal Wellcome Trust [204845/Z/16/Z]; Isaac Newton Trust [12.21(a)i] sovvenzione. H.W. è stato supportato da un MRC DTP Studentship. H.P. è stato supportato da una sovvenzione di dottorato Wellcome Trust (105391 / Z / 14 / Z) e in parte da un Wellcome Trust [204845 / Z / 16 / Z]; Isaac Newton Trust [12.21(a)i] sovvenzione e MRC (MR/L019523/1).

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Gli autori non dichiarano alcun conflitto di interessi

Il metodo descritto consente l'imaging dal vivo della dinamica dei recettori in risposta a ligandi endogeni in situ durante una risposta infiammatoria al danno tissutale. L'uso di reporter neutrofili Cxcr1/Cxcr2 potrebbe essere esteso ad altri contesti fisiologici, come infezioni, modelli tumorali o altri tipi di danno tissutale 14,25,26,27. Inoltre, le linee di salvataggio transgeniche, in cui il recettore endogeno viene soppresso e salvato da un recettore mutante esogeno, potrebbero fornire strumenti utili per analizzare l'importanza di specifici modelli di migrazione dei neutrofili nelle risposte immunitarie. Ad esempio, i mutanti del recettore Cxcr1 che hanno una desensibilizzazione compromessa causano un raggruppamento di neutrofili più prominente nei siti infiammatori14. Questo fenotipo di guadagno di funzione potrebbe essere utilizzato per comprendere il ruolo della congregazione dei neutrofili in diversi processi fisiologici, ad esempio la riparazione delle ferite, le malattie infettive o l'evoluzione del tumore e integrare gli esperimenti di knockdown / knockout del recettore. La metodologia fornisce anche una base per ampliare la gamma di reporter disponibili. La scelta del reporter fluorescente è importante da considerare e dipende dalla questione biologica. Abbiamo scoperto che il turnover costitutivo di questi recettori delle chemochine nei neutrofili era elevato, rispetto alle cellule epiteliali, e che i reporter con maturazione rapida (ad esempio, sfGFP) erano tenuti a riportare i livelli di membrana allo stato stazionario e risolvere le differenze sulla stimolazione dei neutrofili 8,14. Pertanto, i rapporti di membrana di sfGFP / tagRFP non sono applicabili per misurare l'internalizzazione indotta dal ligando in questo tipo di cellula, ma il modello di tagRFP consente il monitoraggio dei destini intracellulari del recettore, che potrebbe essere utile in alcuni studi. Abbiamo anche scoperto che il segnale intracellulare più concentrato di tagRFP è utile per lo screening delle singole larve. Un approccio alternativo per misurare i livelli dei recettori sulla membrana plasmatica sarebbe quello di co-esprimere un marcatore di membrana fluorescente nei neutrofili nello stesso transgene9 o in un transgeneindipendente 14. Nel primo scenario il transgene fornirebbe un ulteriore mezzo per lo screening del pesce e i livelli di espressione sarebbero comparabili tra il marcatore e il recettore. Quest'ultimo approccio sarebbe più modulare, in quanto una linea zebrafish con un reporter recettore potrebbe essere combinata con diverse linee reporter. In entrambi i casi, vale la pena notare che la quantificazione di membrana dei livelli del recettore è difficile nei neutrofili raggruppati (vedi sotto). Infine, notiamo che una possibile estensione di questo protocollo sarebbe quella di seguire l'imaging dal vivo mediante immunoistochimica per analisi di localizzazione più dettagliate.
Il sistema di transgenesi Tol2 è ben consolidato7 e il promotore del lisozima C è stato ampiamente utilizzato per l'espressione dei neutrofili11,15. L'approccio della transgenesi è, quindi, relativamente semplice e il livello di espressione raggiunto con questo promotore è abbastanza alto da fornire un contrasto sufficiente per l'analisi della dinamica del recettore. Una possibile limitazione è che il livello di espressione non ricapitola i livelli di espressione del recettore endogeno. Nuove tecnologie CRISPR potrebbero essere implementate per stabilire linee knock-in per i recettori di particolare interesse28. Queste tecnologie sono ancora ingombranti e potrebbero non garantire i livelli di espressione richiesti per l'imaging subcellulare, ma il loro sviluppo di successo sarebbe un importante passo avanti per la comprensione delle dinamiche di segnalazione endogena. Le convalide funzionali sono importanti per interpretare i dati con costrutti recettoriali transgenici. Ad esempio, i saggi di riconoscimento dei ligandi possono essere utilizzati per stabilire che la proteina di fusione fluorescente è funzionale e il salvataggio dei fenotipi knockout potrebbe essere utilizzato per stabilire che i livelli di espressione transgenica dei neutrofili sono compatibili con la funzionalità14. Infine, un modo più diretto per convalidare la fusione del recettore sarebbe quello di utilizzare un test funzionale in vitro con recettore marcato insieme a versioni non marcate14.
L'approccio di quantificazione affronta difficoltà specifiche nella segmentazione accurata della membrana nei neutrofili in vivo. Nelle cellule di natura epiteliale, la quantificazione dei livelli dei recettori può essere eseguita automaticamente normalizzando i livelli del recettore di membrana in un marcatore di controllo, che può essere espresso in tandem o separatamente9. In effetti, abbiamo applicato un tale approccio, quando abbiamo utilizzato il test di riconoscimento del ligando in embrioni gastrulanti14. Tuttavia, i neutrofili subiscono cambiamenti complessi e rapidi nella forma delle cellule in vivo, rendendo difficile la segmentazione della membrana sia in 2D che in 3D14. Questo è ancora più difficile quando i neutrofili si raggruppano, che si verifica in molti contesti fisiologici29. La metrica di contrasto supera questa limitazione in quanto non richiede la segmentazione della membrana, ma riflette invece lo stato complessivo della distribuzione del recettore nella cellula (membranoso / liscio vs vescicolare / punteggiato). È importante notare che la metrica di contrasto può essere influenzata dal contrasto complessivo dell'immagine, quindi è necessaria la normalizzazione dei valori delle singole cellule a un riferimento interno per tenere conto della variabilità del segnale in diversi embrioni / campioni. Ad esempio, abbiamo usato il valore medio di contrasto cellulare dei neutrofili non responsivi nel CHT (cioè neutrofili che rimangono fermi e non migrano nella pinna ventrale)14. Un'ulteriore possibilità sarebbe quella di normalizzare con i valori di contrasto di un marcatore di controllo nella stessa cella. Ciò fornirebbe una soluzione quando non è disponibile un riferimento interno di cellule non rispondenti e potrebbe probabilmente risolvere differenze quantitative più sottili nella dinamica dei recettori tra condizioni diverse.
La posizione dell'imaging è un'altra variabile da considerare. La ragione per scegliere la ferita della pinna ventrale qui, al contrario del più comunemente usato modello di ferita della pinna caudalemodello 16,30, è perché il sito di ferimento si trova vicino al sito di residenza dei neutrofili / origine migratoria. Ciò accelera la tempistica del test, poiché ci vuole relativamente poco tempo per l'arrivo dei neutrofili. Inoltre, offre l'opportunità di catturare il comportamento cellulare sia all'origine della migrazione (CHT) che nella posizione di interesse target (ferita). Questo è rilevante qui, perché la risoluzione spaziale e temporale richiesta per l'imaging subcellulare è difficile da combinare con un ampio campo visivo o una scansione multi-posizione. Pertanto, il test della ferita della pinna ventrale consente di tracciare l'evoluzione della risposta migratoria dall'origine della migrazione e la cattura simultanea di fluttuazioni non specifiche del recettore nelle cellule che non rispondono. Come accennato in precedenza, quest'ultimo è utile ai fini della quantificazione in quanto fornisce un riferimento interno per dinamiche non specifiche. In altri sistemi, potrebbe non essere possibile avere un tale riferimento interno, nel qual caso i valori di contrasto di un marcatore a membrana coespresso fornirebbero un controllo alternativo.
In sintesi, prevediamo che la metodologia è applicabile ad altri sistemi e può essere implementata per una varietà di scopi. Ad esempio, gli stessi reporter potrebbero essere utilizzati in altri contesti infiammatori, come le impostazioni di infezione o altri modelli di malattia. Il repertorio delle linee reporter del recettore zebrafish potrebbe essere esteso ad altri recettori di segnalazione, per comprendere i meccanismi di segnalazione o segnalare le dinamiche del ligando in vivo. L'approccio può essere combinato con tecniche di knockdown/knockout per interrogare le basi meccanicistiche delle dinamiche osservate. Ad esempio, la perturbazione dell'espressione del ligando può indicare la dipendenza dal ligando per le dinamiche dei recettori osservate. In futuro, prevediamo che il sistema potrebbe essere ulteriormente perfezionato per incorporare l'inserimento knock-in dei giornalisti. In definitiva, i risultati che utilizzano questa metodologia fornirebbero nuove intuizioni preziose al di là della comunità dei pesci zebra, data la conservazione di questi recettori di segnalazione nei mammiferi e la relativa sfida di condurre questi studi in organismi più grandi.

La migrazione dei leucociti è di fondamentale importanza per le risposte immunitarie. Le cellule immunitarie sono cellule migratorie prototipiche, che sono notevolmente in grado di attraversare tessuti e vasi sanguigni e di percepire una serie di segnali di guida chimica per migrare direzionalmente verso microbi o altre cellule ospiti importanti. Una guida corretta si basa sul riconoscimento dei chemioattrattivi, tra cui le chemochine rappresentano la categoria1 più importante. Le chemochine sono riconosciute da recettori accoppiati a sette proteine G transmembrana altamente specifici. Al momento del legame con le chemochine, i recettori delle chemochine cambiano conformazione portando all'attivazione delle proteine G trimeriche associate e alla loro dissociazione in subunità di segnalazione funzionale che promuovono i cambiamenti citoscheletrici e la migrazione diretta1. Secondariamente, i recettori delle chemochine sono fosforilati e questa modifica porta alla desensibilizzazione all'attrattivo, che può essere seguita da una rapida risensibilizzazione / riciclaggio o degradazione intracellulare e down-regolazione dalla superficie cellulare2. Queste dinamiche dei recettori influenzano la durata e la dose di segnalazione ricevuta dalle cellule, ma il modo in cui influenzano il comportamento di migrazione dei leucociti è stato difficile da chiarire in vivo.
Il monitoraggio delle dinamiche dei recettori nei leucociti vivi nei sistemi tradizionali dei mammiferi deve affrontare diverse sfide. Per gli studi dal vivo, le fusioni di recettori con proteine fluorescenti devono essere espresse nelle cellule. Questo è difficile nei leucociti primari, in particolare nei neutrofili, e gli studi finora hanno utilizzato linee cellulari neutrofile surrogate per esprimere i recettori delle chemochine 3,4. La generazione di modelli murini transgenici, in cui i leucociti esprimono un recettore fluorescente o recettori mutanti con difetti di traffico informativo 5,6, comporta un notevole investimento di tempo e risorse. Anche in questi casi, la risoluzione e il contrasto di imaging per le dinamiche dei recettori di imaging nell'animale vivo possono essere limitati e gli studi hanno utilizzato l'immunoistochimica su sezioni di tessuto fisse5. Date queste sfide tecniche, la nostra comprensione di come le dinamiche dei recettori chemioattrattivi influenzano il comportamento cellulare in un ambiente di tessuto vivo è attualmente limitata.
Qui forniamo una metodologia per monitorare il traffico di recettori nei neutrofili zebrafish. I pesci zebra sono geneticamente trattabili, come i topi, ma la transgenesi è relativamente più semplice attraverso l'uso di sistemi di trasposoni efficienti e la manipolazione diretta dello zigote7. La larva trasparente è idealmente suscettibile di imaging. Le dinamiche del recettore delle chemochine sono state visualizzate nelle cellule germinali primordiali e nella linea laterale primordium mediante espressione di fusioni corrispondenti con reporter fluorescenti 8,9,10. Le larve di zebrafish sono dotate di neutrofili maturi che hanno proprietà genetiche e cellulari altamente conservate rispetto ai neutrofili dei mammiferi. Le dinamiche di segnalazione subcellulare come la dinamica citoscheletrica e i regolatori di polarità sono stati visualizzati in queste cellule mediante la generazione di corrispondenti linee transgeniche 11,12,13. Recentemente, abbiamo visualizzato e analizzato funzionalmente le dinamiche del recettore delle chemochine nei neutrofili durante il corso delle risposte infiammatorie al danno tissutale14. Qui, descriviamo la generazione di linee reporter transgeniche per la segnalazione di chemochine nei neutrofili, la preparazione di embrioni per l'imaging dal vivo, un test delle ferite per lo studio della segnalazione dei neutrofili e il protocollo per l'acquisizione e l'analisi delle immagini. Forniamo anche un protocollo laterale per testare le risposte dei recettori delle chemochine ai ligandi candidati, che è utile quando si cerca di stabilire modelli di riconoscimento dei ligandi in recettori non caratterizzati. Queste tecniche possono essere utilizzate in combinazione con ulteriori manipolazioni genetiche, come l'inibizione dell'espressione di chemochine endogene o la generazione di recettori mutanti con traffico alterato indotto dal ligando, per interrogarsi su come specifiche dinamiche di segnalazione influenzano il comportamento dei leucociti in vivo. Le linee transgeniche che esprimono recettori delle chemochine marcati fluorescentemente possono anche essere utilizzate come reporter per gradienti di chemochine endogene, che sono altrimenti difficili da rilevare mediante colorazione diretta degli anticorpi. La metodologia descritta fornisce la possibilità di espandere la generazione di reporter ad altri recettori di immuno-segnalazione.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>1-phenyl-2-thiourea</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P7629-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50mL CellStar Centrifuge Tube</td>
			<td>Grenier Bio-One Limited</td>
			<td>210270</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clark capillary glass</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>30-0020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cleanline Thin Bleach</td>
			<td>Scientific Laboratory Supplies</td>
			<td>CLE0301</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting scope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>SMZ645</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dri Block heater</td>
			<td>Techne</td>
			<td>FDB02AD</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiji</td>
			<td>National Institutes of Health, Bethesda, MD</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps, Jewelers Dumont No. 5</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F6521</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass bottom microwell dishes</td>
			<td>MatTek</td>
			<td>P35G-1.5-14-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass pasteur pipette</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>11795098</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Invitrogen Ambion mMESSAGE mMACHINE SP6 Transcription Kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>10391175</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica SP8 confocal microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low melting point agarose</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>16520-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic stand</td>
			<td>Narishige</td>
			<td>GJ-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MATLAB</td>
			<td>The MathWorks, Inc., Natick, MA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methylene blue</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M9140-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgSO4</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M-2643</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microinjection system</td>
			<td>Parker</td>
			<td>Picospritzer III</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microloader pipette tips</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5242956003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micromanipulator</td>
			<td>Narishige</td>
			<td>M-152</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette Puller</td>
			<td>Sutter Instrument Company</td>
			<td>Flaming/Brown P-97</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope slide</td>
			<td>Thermo-Scientific</td>
			<td>J1800AMNZ</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PerkinElmer Spinning Disk UltraVIEW ERS, Olympus IX81 spinnng disk confocal microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish (120mm)</td>
			<td>Grenier Bio-One Limited</td>
			<td>632180</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenol red</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P0290-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly(A) Tailing Kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM1350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prism</td>
			<td>GraphPad Software</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Small paintbrush</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectral Applied Research LMM5 laser module</td>
			<td></td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical Scalpel Blade No. 23</td>
			<td>Swann-Morton</td>
			<td>233-5528</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tricaine MS222</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E10521-50G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Volocity software</td>
			<td></td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yokogawa CSU10 spinning disc confocal scanner</td>
			<td>Yokogawa</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

live imaging of chemokine receptors in zebrafish neutrophils during wound responses

La guida dei leucociti da parte di gradienti chimici è essenziale per le risposte immunitarie. I neutrofili sono le prime cellule ad essere reclutate in siti di danno tissutale dove eseguono funzioni antimicrobiche cruciali. Il loro traffico verso questi loci è orchestrato da diversi chemioattrattivi infiammatori, tra cui le chemochine. A livello molecolare, la segnalazione chemioattrattante è regolata dal traffico intracellulare dei recettori corrispondenti. Tuttavia, non è chiaro come i cambiamenti subcellulari nei recettori delle chemochine influenzino le dinamiche di migrazione dei leucociti a livello cellulare e tissutale. Qui descriviamo una metodologia per l'imaging dal vivo e l'analisi quantitativa delle dinamiche dei recettori delle chemochine nei neutrofili durante le risposte infiammatorie al danno tissutale. Questi strumenti hanno rivelato che il traffico differenziale del recettore delle chemochine nei neutrofili del pesce zebra coordina il raggruppamento e la dispersione dei neutrofili nei siti di danno tissutale. Ciò ha implicazioni per la nostra comprensione di come le risposte infiammatorie sono auto-risolte. Gli strumenti descritti potrebbero essere utilizzati per comprendere i modelli di migrazione dei neutrofili in una varietà di contesti fisiologici e patologici e la metodologia potrebbe essere estesa ad altri recettori di segnalazione.

La ferita della pinna ventrale è seguita da una rapida mobilizzazione dei neutrofili dal CHT nella pinna ventrale e dal raggruppamento al margine della ferita, entro 30-60 minuti (Figura 1). Abbiamo visualizzato la distribuzione di due recettori delle chemochine, Cxcr1 e Cxcr2, che sono espressi dai neutrofili zebrafish24 e riconoscono Cxcl8a e Cxcl8b14, usando la microscopia confocale a disco rotante. Abbiamo generato due linee transgeniche corrispondenti, Tg(lyz:Cxcr1-FT) e Tg(lyz:Cxcr2-FT), in cui i neutrofili esprimono un costrutto timer fluorescente (FT) del recettore, cioè una fusione con un tandem di sfGFP e tagRFP (Figura 2 e riferimento14). L'uso dei due fluorofori aveva lo scopo di consentire il monitoraggio di un'ampia gamma di destini recettoriali e fornire stime del tempo di turnover proteico sulla membrana plasmatica, poiché i recettori di nuova sintesi fluorescevano in verde e diventavano progressivamente rossi all'età di 8,14 anni. Tuttavia, questi recettori hanno un rapido turnover costitutivo sulla membrana plasmatica dei neutrofili e che il tempo di permanenza era più breve del tempo di maturazione di tagRFP, con sfGFP che mostrava localizzazione di membrana e tagRFP che mostrava localizzazione vescicolare allo stato stazionario (Video supplementare 1 e ref14). Pertanto, ci siamo concentrati sulla distribuzione di sfGFP per monitorare l'internalizzazione indotta dal ligando nei siti di danno tissutale. Il modello di distribuzione del recettore è stato quantificato utilizzando la metrica di contrasto, che riporta le differenze di intensità tra i pixel vicini. La logica è che quando la distribuzione del recettore è membranosa e liscia, il valore di contrasto è basso. Quando la distribuzione del recettore è vescicolare e più puntina, il valore di contrasto è alto (Figura 3).
Un metodo alternativo consiste nel quantificare il rapporto tra i livelli dei recettori (intensità sfGFP) rispetto ai livelli di un marcatore di membrana di controllo, ad esempio la CFP di membrana (mCFP) (Figura 3). Entrambi i metodi potrebbero rilevare l'internalizzazione del recettore, come indicato da un modello di distribuzione del recettore vescicolare più globale nella cellula (valore di contrasto più elevato) o livelli di recettori più bassi sulla membrana (rapporto sfGFP / mCFP inferiore). Tuttavia, la metrica di contrasto potrebbe anche rilevare l'internalizzazione del recettore nei cluster di neutrofili alla ferita, in cui la segmentazione della membrana era meno accurata e non applicabile (Figura 3). Utilizzando questa metrica, siamo stati in grado di quantificare le differenze visibili tra il traffico di neutrofili Cxcr1 e Cxcr2 nelle ferite (Figura 4 e Video supplementare 2). Cxcr1-FT interiorizzato in cellule situate nella ferita mentre Cxcr2-FT è rimasto membranoso nei neutrofili nella ferita (Figura 4A-C, Video supplementare 2 e Video supplementare 3). La soppressione di Cxcl8a e Cxcl8b, attraverso il trattamento con morfolino, ha influenzato in modo differenziale l'internalizzazione di Cxcr1-FT alle ferite (Figura 4C,D). Per convalidare ulteriormente che Cxcr1-FT risponde a Cxcl8a, abbiamo eseguito saggi di risposta alle chemochine negli embrioni precoci. Abbiamo scoperto che Cxcr1-FT è marcatamente interiorizzato in embrioni in cui Cxcl8a è stato co-espresso (Figura 5). Complessivamente questi risultati indicano che i metodi descritti possono essere utilizzati per misurare l'internalizzazione del recettore indotta da chemochine nei neutrofili e stabilire l'identità del ligando mediando questi effetti.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61679/61679fig01.jpg"> Figura 1: Migrazione dei neutrofili alle ferite delle pinne ventrali. (A) (A sinistra) Vignetta della larva di 3 dpf che mostra la posizione del tessuto ematopoietico caudale (CHT), la circolazione di Venere (VC, blu), la pinna ventrale (VF) e il sito della ferita. (Destra) Cartone animato raffigurante l'area della ferita (W) con i neutrofili che vengono mobilitati dal CHT e raggruppati sulla ferita. Il plesso della vena caudale (CVP) del tessuto CHT è disegnato in blu. (B) Immagine in campo luminoso (a sinistra) e proiezione confocale (a destra) che mostra la ferita della pinna ventrale e la distribuzione dei neutrofili nelle larve di Tg(mpx:GFP) a 2 ore dopo l'avvolgimento. Le linee tratteggiate mostrano i contorni VF e CHT. Barra della scala = 25 μm. Immagine cartoon e fluorescente modificata dal ref.14 (http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61679/61679fig01large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61679/61679fig02.jpg"> Figura 2: Imaging dal vivo del traffico del recettore delle chemochine nei neutrofili. (A) Costrutti utilizzati per l'espressione transgenica neutrofila-specifica di Cxcr1-FT (Fluorescent Timer) e Cxcr2-FT. Proiezioni confocali di neutrofili nella testa di una larva transgenica 3 dpf (Tg(lyz:Cxcr1-FT), top; Tg(lyz:Cxcr2-FT), in basso) che mostra i canali tRFP (magenta) e sfGFP (verde). Barra di scala = 20 μm. (B) Schema anatomico di 3 larve dpf come in Figura 1A. Sotto la larva ci sono schemi che raffigurano l'area della ferita (W) con i neutrofili che vengono mobilitati dal CHT (in alto) o eseguono la chemiotassi quando entrano nella pinna ventrale (in basso). Il quadrato tratteggiato indica l'area ripresa nelle istantanee a destra. (C) Neutrofili nelle larve di Tg(lyz:Cxcr1-FT) (sfGFP è mostrato) dopo mobilizzazione dal CHT (pannelli superiori) o chemiotassi verso la ferita (pannelli inferiori). Le frecce mostrano le stesse celle nel tempo. I punti temporali sull'immagine a destra sono minuti trascorsi dopo l'immagine a sinistra. Barra di scala = 10 μm. (D) Rappresentazione schematica dell'approccio sperimentale per l'imaging dal vivo del traffico del recettore delle chemochine. Pannelli A-C modificati dal rif.14 (http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61679/61679fig02large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61679/61679fig03.jpg"> Figura 3: Esempi di quantificazione della dinamica dei recettori. I neutrofili singoli (blu) o raggruppati (verde) alle ferite o i neutrofili non mobilizzati nel CHT (rosso, arancione) sono stati segmentati e analizzati con metodi diversi per confrontare i risultati. Le stesse celle di esempio mostrate sono state analizzate con due metodi per mettere in relazione ciò che si vede nell'immagine con l'intervallo di valori estratti. (A) La superficie delle celle di esempio selezionate è stata segmentata in base alla definizione del contorno nel canale sfGFP. (B) Il contrasto è stato calcolato dalle celle di esempio mostrate in A. (C) La membrana delle cellule di esempio selezionate è stata segmentata in base alla definizione del contorno nel canale CFP. È seguita l'analisi raziometrica di sfGFP/CFP. (D) Il rapporto sfGFP/CFP è stato calcolato sulle celle di esempio mostrate in C. Le barre di errore rappresentano S.E.M. da singole celle, nei casi di n>1, i valori qui non sono stati utilizzati per analisi statistiche ma semplicemente per esemplificare le misurazioni ottenute con i diversi metodi di quantificazione. Barra della scala = 10 μm. Figura modificata dal rif.14 (http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61679/61679fig03large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61679/61679fig04v2.jpg"> Figura 4: Dinamica differenziale di Cxcr1 e Cxcr2 in risposta al ferimento. (A) Proiezione confocale di neutrofili in larve Tg(lyz:Cxcr1-FT) o Tg(lyz:Cxcr2-FT) alla ferita a 80 minuti dopo l'avvolgimento (canale sfGFP mostrato). Barra della scala = 10 μm.  (B) Neutrofilo Cxcr1-FT ingrandito (a sinistra) e Cxcr2-FT (a destra) alla ferita. Il recettore verde è mostrato in grigio. Barra di scala = 5 μm. (C) Contrasto normalizzato (contrasto per singolo neutrofilo normalizzato al contrasto medio delle cellule non mobilizzate nel CHT). cxcl8a si riferisce all'iniezione di un blocco di giunzione insieme a un morfolino che blocca la traduzione per cxcl8a. cxcl8b si riferisce all'iniezione con un morfolino che blocca la giunzione per cxcl8b. Per Tg(lyz:Cxcr1-FT): n=24 cellule (CHT), n=47 cellule (ferita) da 8 larve. Per Tg(lyz:Cxcr1-FT) con morfolinos: n=28 cellule (Cxcl8a-MO) da 5 larve, n=16 cellule (Cxcl8b-MO) da 5 larve. Per Tg(lyz:Cxcr2-FT): n=10 cellule (CHT) e n=20 cellule (ferita) da 3 larve. I dati sono stati raggruppati da larve indipendenti acquisite in 1-5 sessioni di imaging. Test di Kruskal-Wallis con il test di confronto multiplo di Dunn per Tg (lyz: Cxcr1-FT), test di Mann-Whitney spaiato a due code per Tg (lyz: Cxcr2-FT). (D) Proiezione confocale di neutrofili in larve transgeniche Tg(lyz:Cxcr1-FT) trattate con cxcl8a morpholino (MO) (a sinistra) e cxcl8b MO (a destra) che rispondono alle ferite delle pinne (canale sfGFP mostrato in verde). Istantanea scattata in punti temporali di accumulo equivalente di neutrofili (85 minuti post-ferimento nell'immagine sinistra e 45 minuti post-ferimento nell'immagine destra). Barra della scala = 10 μm. Figura modificata dal rif.14 (http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61679/61679fig04large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61679/61679fig05.jpg"> Figura 5: Test di risposta alle chemochine negli embrioni precoci. Fette confocali a scansione laser di embrioni gastrulanti che mostrano espressione e distribuzione di Cxcr1-FT. 100 pg di mRNA Cxcr1-FT sono stati iniettati in uova a stadio cellulare con o senza mRNA Cxcl8a 150 pg. I recettori verdi e rossi sono mostrati in canali separati. Il marcatore CFP a membrana di controllo (mCFP) viene mostrato nel canale ciano. Barra della scala = 20 μm. Figura modificata dal rif.14 (http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61679/61679fig05large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
Film supplementare 1: Neutrofili transgenici nella testa di una larva Tg(lyz:Cxcr1-FT) (sinistra) e Tg(lyz:Cxcr2-FT) (destra) a 3 dpf. sfGFP(verde), tagRFP (magenta). L'intervallo di fotogrammi è di 30 secondi e la frequenza dei fotogrammi è di 5 fps. Barra della scala = 20 μm. Il video proviene dal ref.14 (http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/). <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61679/Supplementary_Movie1.avi" target="_blank">Clicca qui per scaricare questo video.</a>
Film supplementare 2: Neutrofili in Tg(lyz:Cxcr1-FT) (sinistra) e Tg(lyz:Cxcr2-FT) (destra) larve transgeniche che rispondono alle ferite delle pinne. Il film inizia entro 10 minuti dopo il ferimento e dura 60 minuti sfGFP (verde), tagRFP (magenta). L'intervallo di fotogrammi è di 30 secondi e la frequenza dei fotogrammi è di 10 fps. CHT = tessuto ematopoietico caudale. VF = pinna ventrale. Barra della scala = 25 μm. Il video proviene dal ref.14 (http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/). <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61679/Supplementary_Movie2.avi" target="_blank">Clicca qui per scaricare questo video.</a>
Film supplementare 3. Ulteriori esempi di neutrofili da una larva transgenica Tg (lyz: Cxcr1- FT) ferita (larva diversa da quella mostrata nel Video 2), acquisita a una risoluzione più elevata, che mostra l'internalizzazione del recettore (canale sfGFP mostrato in verde) alla mobilizzazione nel CHT o all'ingresso e chemiotassi nella pinna ventrale. L'intervallo di fotogrammi è di 30 secondi e la frequenza dei fotogrammi è di 2 fps. Barra della scala = 10 μm. Il video proviene dal ref.14 (http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/). <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61679/Supplementary_Movie3.avi" target="_blank">Clicca qui per scaricare questo video.</a>
File supplementare 1<a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61679/Supplementary%20file%201.m" target="_blank">: Fare clic qui per scaricare questo file.</a>
File supplementare 2: <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61679/Supplementary%20file%202.m" target="_blank">Fare clic qui per scaricare questo file.</a>
File supplementare 3<a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61679/Supplementary%20file%203.m" target="_blank">: Fare clic qui per scaricare questo file.</a>
File supplementare 4: <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61679/Supplementary%20file%204.m" target="_blank">Fare clic qui per scaricare questo file.</a>

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