Name: live imaging of chemokine receptors in zebrafish neutrophils during wound responses
Uploaded: 2020-12-04T13:30:00
Duration: 6 min 48 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Live Imaging of Chemokine Receptors in Zebrafish Neutrophils During Wound Responses at JoVE.com

Agradecemos a Christine Holt e Bill Harris por ajuda com microscopia confocal. Agradecemos a Darren Gilmour pelas construções de espinha dorsal fluorescente e Anna Huttenlocher pelo vetor tol2-lyz backbone. Agradecemos a Steve Renshaw pela linha Tg(mpx:GFP)i114 . Este trabalho foi apoiado pelo MRC (MR/L019523/1), pelo Wellcome Trust [204845/Z/16/Z]; Isaac Newton Trust [12.21(a)i] e um Isaac Newton Trust concedem 19.23(n). C.C. foi apoiado por uma estudante mrc DTP e em parte pelo Wellcome Trust [204845/Z/16/Z]; Isaac Newton Trust [12.21(a)i] concessão. H.W. foi apoiado por uma MrC DTP Studentship. A H.P. foi apoiada por uma bolsa de doutorado da Wellcome Trust (105391/Z/14/Z) e em parte por um Wellcome Trust [204845/Z/16/Z]; Isaac Newton Trust [12.21(a)i] grant e o MRC (MR/L019523/1).

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Os autores declaram não haver conflito de interesses

O método descrito permite imagens vivas da dinâmica do receptor em resposta a ligantes endógenos in situ durante uma resposta inflamatória a danos teciduais. O uso de repórteres de neutrófilo Cxcr1/Cxcr2 poderia ser expandido para outras configurações fisiológicas, como infecção, modelos tumorais ou outros tipos de danos teciduais 14,25,26,27. Além disso, linhas de resgate transgênicas, nas quais o receptor endógeno é suprimido e resgatado por um receptor mutante exógeno, poderiam fornecer ferramentas úteis para dissecar a importância de padrões específicos de migração de neutrófilos em respostas imunes. Por exemplo, mutantes receptores Cxcr1 que prejudicaram a dessensibilização causam agrupamento de neutrófilos mais proeminentes em locais inflamatórios14. Esse ganho de fenotipo de função poderia ser usado para entender o papel da congregação de neutrófilos em diferentes processos fisiológicos, por exemplo, reparação de feridas, doença infecciosa ou evolução tumoral, e complementar experimentos receptores knockdown/knockout. A metodologia também fornece uma base para expandir o leque de repórteres disponíveis. A escolha do repórter fluorescente é importante de se considerar e depende da questão biológica. Descobrimos que a rotatividade constitutiva desses receptores de quimioterapia em neutrófilos foi alta, em comparação com as células epiteliais, e que repórteres com maturação rápida (por exemplo, sfGFP) foram obrigados a relatar níveis de membrana em estado estável e resolver diferenças sobre a estimulação de neutrófilos 8,14. Assim, as relações de membrana de sfGFP/tagRFP não são aplicáveis para medir a internalização induzida por ligante neste tipo de célula, mas o padrão de tagRFP permite o rastreamento dos destinos intracelulares do receptor, o que poderia ser útil em alguns estudos. Também descobrimos que o sinal intracelular mais concentrado do tagRFP é útil para a triagem de larvas individuais. Uma abordagem alternativa para medir os níveis de receptor na membrana plasmática seria co-expressar um marcador de membrana fluorescente em neutrófilos no mesmo transgene9 ou em um transgeneindependente 14. No cenário anterior, o transgene forneceria um meio adicional para a triagem dos níveis de peixe e expressão seria comparável entre o marcador e o receptor. Esta última abordagem seria mais modular, na qual uma linha de zebrafish com um repórter receptor poderia ser combinada com diferentes linhas de repórteres. Em ambos os casos, vale a pena notar que a quantificação da membrana dos níveis do receptor é desafiadora em neutrófilos agrupados (veja abaixo). Por fim, observa-se que uma possível extensão deste protocolo seria acompanhar a imagem ao vivo pela imunohistoquímica para análises de localização mais detalhadas.
O sistema de transgênese Tol2 é bem estabelecido7 e o promotor de lysozyme C tem sido amplamente utilizado para a expressão de neutrófilo11,15. A abordagem transgênese é, portanto, relativamente simples e o nível de expressão alcançado com este promotor é alto o suficiente para fornecer contraste suficiente para a análise da dinâmica dos receptores. Uma possível limitação é que o nível de expressão não recapitula os níveis de expressão do receptor endógeno. Novas tecnologias CRISPR poderiam ser implantadas para estabelecer linhas de impacto para receptores de interesse particular28. Essas tecnologias ainda são complicadas e podem não garantir os níveis de expressão necessários para imagens subcelulares, mas seu desenvolvimento bem-sucedido seria um importante avanço para a compreensão da dinâmica de sinalização endógena. As validações funcionais são importantes para a interpretação de dados com construtos de receptores transgênicos. Por exemplo, ensaios de reconhecimento de ligantes podem ser usados para estabelecer que a proteína de fusão fluorescente é funcional e o resgate de fenótipos eliminatórios poderia ser usado para estabelecer que os níveis de expressão transgênica de neutrófilos são compatíveis com a funcionalidade14. Finalmente, uma maneira mais direta de validar a fusão receptora seria utilizar um ensaio funcional in vitro com receptor rotulado ao lado das versões não rotuladas14.
A abordagem de quantificação aborda dificuldades específicas na segmentação precisa da membrana em neutrófilos in vivo. Em células de natureza epitelial, a quantificação dos níveis dos receptores pode ser executada automaticamente pela normalização dos níveis do receptor de membrana para um marcador de controle, que pode ser expresso em conjunto ou separadamente9. De fato, aplicamos tal abordagem, ao usar o ensaio de reconhecimento de ligantes em embriões gasetruidores14. No entanto, os neutrófilos sofrem mudanças complexas e rápidas na forma celular in vivo, dificultando a segmentação da membrana tanto em 2D quanto em 3D14. Isso é ainda mais desafiador quando os neutrófilos se aglomeram, o que ocorre em muitas configurações fisiológicas29. A métrica de contraste supera essa limitação, pois não requer segmentação de membrana, mas reflete o estado geral de distribuição de receptores na célula (membranous/suave vs vesicular/dotty). É importante notar que a métrica de contraste pode ser afetada pelo contraste geral da imagem, de modo que a normalização dos valores celulares individuais a uma referência interna é necessária para explicar a variabilidade do sinal em diferentes embriões/amostras. Por exemplo, utilizamos o valor médio de contraste celular de neutrófilos não responsivos no CHT (ou seja, neutrófilos que permanecem estacionários e não migram para a barbatana ventral)14. Uma possibilidade adicional seria normalizar com valores de contraste de um marcador de controle na mesma célula. Isso forneceria uma solução quando uma referência interna de células não-respondendo não estiver disponível e provavelmente resolveria diferenças quantitativas mais finas na dinâmica do receptor entre diferentes condições.
A localização da imagem é outra variável a considerar. A razão para escolher a ferida da barbatana ventral aqui, ao contrário da ferida da barbatana traseira mais usada modelo16,30, é porque o local do ferimento está próximo ao local de residência neutrófila/origem migratória. Isso acelera a linha do tempo do ensaio, pois leva relativamente pouco tempo para os neutrófilos chegarem. Além disso, oferece a oportunidade de capturar o comportamento celular tanto na origem migratória (CHT) quanto no local de destino do interesse (ferida). Isso é relevante aqui, pois a resolução espacial e temporal necessária para imagens subcelulares é difícil de combinar com um grande campo de visão ou varredura multi-posição. Assim, o ensaio da ferida da barbatana ventral permite o acompanhamento da evolução da resposta migratória da origem migratória e a captura simultânea de flutuações de receptores inespecíficos em células que não respondem. Como mencionado acima, este último é útil para fins de quantificação, pois fornece uma referência interna para dinâmicas inespecíficas. Em outros sistemas, pode não ser possível ter tal referência interna, nesse caso os valores de contraste de um marcador de membrana co-expresso forneceriam um controle alternativo.
Em resumo, prevemos que a metodologia é aplicável a outros sistemas e pode ser implantada para uma variedade de propósitos. Por exemplo, os mesmos repórteres poderiam ser utilizados em outros ambientes inflamatórios, como configurações de infecção ou outros modelos de doenças. O repertório de linhas de repórteres receptores de zebrafish poderia ser expandido para outros receptores de sinalização, para entender mecanismos de sinalização ou relatar a dinâmica de ligantes in vivo. A abordagem pode ser combinada com técnicas de knockdown/nocaute para interrogar a base mecanicista da dinâmica observada. Por exemplo, a perturbação da expressão de ligantes pode indicar a dependência de ligantes para a dinâmica do receptor observado. No futuro, prevemos que o sistema poderia ser refinado para incorporar a inserção de repórteres. Em última análise, os achados que utilizam essa metodologia forneceriam novas percepções valiosas para além da comunidade de zebrafish, dada a conservação desses receptores de sinalização em mamíferos e o desafio relativo de realizar esses estudos em organismos maiores.

A migração de leucócitos é de suma importância para as respostas imunológicas. As células imunes são células migratórias prototípicas, que são notavelmente capazes de atravessar tecidos e vasos sanguíneos e sentir uma série de sinais de orientação química para migrar direcionalmente em direção a micróbios ou outras células hospedeiras de importância. A orientação correta baseia-se no reconhecimento de quimioattractants, entre os quais as quimiocinas representam a categoria1 mais proeminente. As quimiocinas são reconhecidas por receptores acoplados altamente específicos de sete transmembranos G. Após a ligação de quimiocina, os receptores de quimioterapia mudam a conformação levando à ativação de proteínas G trimeric associadas e sua dissociação em subunidades de sinalização funcional que promovem alterações citoesqueléticas e migração direcionada1. Em segundo lugar, os receptores de quimioterapia são fosforilados, e essa modificação leva à dessensibilização ao atrativo, que pode ser seguida por rápida resensibilidade/reciclagem ou degradação intracelular e baixa regulação da superfície celular2. Essas dinâmicas receptoras influenciam a duração e a dose de sinalização recebida pelas células, mas como elas afetam o comportamento de migração de leucócitos tem sido difícil de elucidar in vivo.
O rastreamento da dinâmica dos receptores em leucócitos vivos em sistemas tradicionais de mamíferos enfrenta vários desafios. Para estudos vivos, fusões receptoras com proteínas fluorescentes devem ser expressas nas células. Isso é desafiador em leucócitos primários, particularmente em neutrófilos, e estudos até agora têm usado linhas de células neutrófilas substitutas para expressar receptoresde quimioterapia 3,4. A geração de modelos de camundongos transgênicos, nos quais os leucócitos expressam um receptor fluorescente ou receptores mutantes com defeitos informativos de tráfico 5,6, implica um investimento considerável de tempo e recursos. Mesmo nesses casos, a resolução de imagens e o contraste para a dinâmica do receptor de imagem no animal vivo podem ser limitados e estudos têm usado imunohistoquímica nas seções de tecido fixo5. Dado esses desafios técnicos, nossa compreensão de como a dinâmica dos receptores quimioattractant afeta o comportamento celular em um ambiente de tecido vivo é atualmente limitada.
Aqui fornecemos uma metodologia para monitorar o tráfico de receptores em neutrófilos de zebrafish. Os zebrafish são geneticamente tratáveis, como ratos, mas a transgênese é relativamente mais simples através do uso de sistemas transposon eficientes e manipulação direta de zigoto7. A larva transparente é idealmente agradável à imagem. A dinâmica do receptor de quimiocina foi visualizada em células germinativas primordiais e a linha lateral primordium por expressão de fusões correspondentes com repórteres fluorescentes 8,9,10. As larvas de zebrafish são equipadas com neutrófilos maduros que têm propriedades genéticas e celulares altamente conservadas em relação aos neutrófilos mamíferos. Dinâmicas de sinalização subcelular, como a dinâmica citoesqueléllica e os reguladores de polaridade foram visualizadas nessas células pela geração das linhas transgênicas correspondentes 11,12,13. Recentemente, visualizamos e analisamos funcionalmente a dinâmica do receptor de quimioterapia em neutrófilos durante o curso de respostas inflamatórias a danos teciduais14. Aqui, descrevemos a geração de linhas de repórteres transgênicos para sinalização de quimiocina em neutrófilos, preparação de embriões para imagens vivas, um ensaio de ferida para estudar sinalização de neutrófilo e o protocolo para aquisição e análise de imagens. Também fornecemos um protocolo lateral para testar as respostas do receptor de quimiocina aos ligantes candidatos, o que é útil ao tentar estabelecer padrões de reconhecimento de ligantes em receptores não característicos. Essas técnicas podem ser usadas em combinação com outras manipulações genéticas, como a inibição da expressão endógena da quimiocina ou geração de receptores mutantes com tráfico induzido por ligantes alterados, para questionar como a dinâmica de sinalização específica afeta o comportamento leucócito in vivo. As linhas transgênicas que expressam receptores de quimioterapia fluorescentes também podem ser usadas como repórteres para gradientes endógenos de quimioterapia, que são difíceis de detectar por manchas diretas de anticorpos. A metodologia descrita fornece espaço para a expansão da geração de repórteres para outros receptores de imuno-sinalização.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>1-phenyl-2-thiourea</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P7629-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50mL CellStar Centrifuge Tube</td>
			<td>Grenier Bio-One Limited</td>
			<td>210270</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clark capillary glass</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>30-0020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cleanline Thin Bleach</td>
			<td>Scientific Laboratory Supplies</td>
			<td>CLE0301</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting scope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>SMZ645</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dri Block heater</td>
			<td>Techne</td>
			<td>FDB02AD</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiji</td>
			<td>National Institutes of Health, Bethesda, MD</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps, Jewelers Dumont No. 5</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F6521</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass bottom microwell dishes</td>
			<td>MatTek</td>
			<td>P35G-1.5-14-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass pasteur pipette</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>11795098</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Invitrogen Ambion mMESSAGE mMACHINE SP6 Transcription Kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>10391175</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica SP8 confocal microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low melting point agarose</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>16520-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic stand</td>
			<td>Narishige</td>
			<td>GJ-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MATLAB</td>
			<td>The MathWorks, Inc., Natick, MA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methylene blue</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M9140-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgSO4</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M-2643</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microinjection system</td>
			<td>Parker</td>
			<td>Picospritzer III</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microloader pipette tips</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5242956003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micromanipulator</td>
			<td>Narishige</td>
			<td>M-152</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette Puller</td>
			<td>Sutter Instrument Company</td>
			<td>Flaming/Brown P-97</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope slide</td>
			<td>Thermo-Scientific</td>
			<td>J1800AMNZ</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PerkinElmer Spinning Disk UltraVIEW ERS, Olympus IX81 spinnng disk confocal microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish (120mm)</td>
			<td>Grenier Bio-One Limited</td>
			<td>632180</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenol red</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P0290-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly(A) Tailing Kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM1350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prism</td>
			<td>GraphPad Software</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Small paintbrush</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectral Applied Research LMM5 laser module</td>
			<td></td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical Scalpel Blade No. 23</td>
			<td>Swann-Morton</td>
			<td>233-5528</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tricaine MS222</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E10521-50G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Volocity software</td>
			<td></td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yokogawa CSU10 spinning disc confocal scanner</td>
			<td>Yokogawa</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

live imaging of chemokine receptors in zebrafish neutrophils during wound responses

A orientação de leucócitos por gradientes químicos é essencial para respostas imunes. Os neutrófilos são as primeiras células a serem recrutadas para locais de danos teciduais onde executam funções antimicrobianas cruciais. Seu tráfico para esses loci é orquestrado por vários quimioattractants inflamatórios, incluindo quimiocinas. No nível molecular, a sinalização de quimioattractant é regulada pelo tráfico intracelular dos receptores correspondentes. No entanto, ainda não está claro como as mudanças subcelulares nos receptores de quimiocina afetam a dinâmica de migração de leucócitos no nível celular e tecidual. Aqui descrevemos uma metodologia para imagens ao vivo e análise quantitativa da dinâmica do receptor de quimioterapia em neutrófilos durante respostas inflamatórias a danos teciduais. Essas ferramentas revelaram que o tráfico diferencial de receptores de quimioterapia em neutrófilos de zebrafish coordena o agrupamento e dispersão de neutrófilos em locais de danos teciduais. Isso tem implicações para nossa compreensão de como as respostas inflamatórias são auto-resolvidas. As ferramentas descritas poderiam ser usadas para entender padrões de migração de neutrófilos em uma variedade de ambientes fisiológicos e patológicos e a metodologia poderia ser expandida para outros receptores de sinalização.

A ferida da barbatana ventral é seguida pela rápida mobilização de neutrófilos do CHT para a barbatana ventral e agrupamento na margem da ferida, dentro de 30-60 min (Figura 1). Visualizamos a distribuição de dois receptores de quimiocina, Cxcr1 e Cxcr2, que são expressos por neutrófilos de zebrafish24 e reconhecem Cxcl8a e Cxcl8b14, usando microscopia confocal de disco giratório. Geramos duas linhas transgênicas correspondentes, Tg(lyz:Cxcr1-FT) e Tg(lyz:Cxcr2-FT), nas quais os neutrófilos expressam uma construção do temporizador fluorescente (FT) do receptor, ou seja, uma fusão com um tandem de sfGFP e tagRFP (Figura 2 e referência14). O uso dos dois fluoroforos destinava-se a permitir o monitoramento de uma ampla gama de destinos receptores e fornecer estimativas de tempo de rotatividade de proteínas na membrana plasmática, já que receptores recém-sintetizados fluoresceriam em verde e progressivamente se tornariam vermelhos à medida que envelheciam 8,14 anos. No entanto, esses receptores apresentaram rápida rotatividade constitutiva na membrana plasmática de neutrófilo e que o tempo de residência foi menor do que o tempo de maturação do tagRFP, com sfGFP mostrando localização de membrana e tagRFP mostrando localização vesicular em estado estável (Vídeo Suplementar 1 e ref14). Por isso, focamos na distribuição do SFGFP para monitorar a internalização induzida por ligantes em locais de danos teciduais. O padrão de distribuição do receptor foi quantificado utilizando-se a métrica de contraste, que relata diferenças de intensidade entre pixels vizinhos. A lógica é que quando a distribuição do receptor é membranous e suave, o valor de contraste é baixo. Quando a distribuição do receptor é vesicular e mais pontual, então o valor de contraste é alto (Figura 3).
Um método alternativo é quantificar a razão dos níveis de receptor (intensidade sfGFP) sobre os níveis de um marcador de membrana de controle, por exemplo, membrana CFP (mCFP) (Figura 3). Ambos os métodos poderiam detectar a internalização do receptor, como indicado por um padrão de distribuição de receptores mais vesiculares globalmente na célula (maior valor de contraste) ou níveis de receptores mais baixos na membrana (menor razão sfGFP/mCFP). No entanto, a métrica de contraste também poderia detectar internalização do receptor em aglomerados de neutrófilos na ferida, em que a segmentação da membrana era menos precisa e não aplicável (Figura 3). Utilizando esta métrica, conseguimos quantificar diferenças visíveis entre o tráfico de Cxcr1 e Cxcr2 em neutrófilos em feridas (Figura 4 e Vídeo Suplementar 2). Cxcr1-FT internalizado em células localizadas na ferida, enquanto Cxcr2-FT permaneceu membranous em neutrófilos na ferida (Figura 4A-C, Vídeo Suplementar 2 e Vídeo Suplementar 3). A supressão de Cxcl8a e Cxcl8b, através do tratamento de morfolino, afetou diferencialmente a internalização Cxcr1-FT nas feridas (Figura 4C,D). Para validar ainda mais que o Cxcr1-FT responde ao Cxcl8a, realizamos ensaios de resposta de quimioterapia em embriões precoces. Descobrimos que cxcr1-FT foi significativamente internalizado em embriões nos quais Cxcl8a foi co-expresso (Figura 5). Ao todo, esses resultados indicam que os métodos descritos podem ser implantados para medir a internalização do receptor induzido pela quimiocina em neutrófilos e estabelecer a identidade do ligante mediando esses efeitos.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61679/61679fig01.jpg"> Figura 1: Migração de neutrófilo para feridas de barbatana ventral. (A) (Esquerda) Desenho de 3 larvas dpf mostrando a localização do tecido hematopoiético caudal (CHT), a circulação de vênus (VC, azul), a barbatana ventral (VF) e o local da ferida. (À direita) Desenho animado retratando a área da ferida (W) com neutrófilos sendo mobilizados do CHT e agrupando-se na ferida. O plexo da veia caudal (CVP) do tecido CHT é desenhado em azul. (B) Imagem de campo brilhante (esquerda) e projeção confocal (direita) mostrando a ferida da barbatana ventral e a distribuição de neutrófilos em larvas Tg (mpx:GFP) a 2 h após o ferimento. As linhas tracejadas mostram contornos VF e CHT. Barra de escala = 25 μm. Desenho animado e imagem fluorescente modificada a partir do ref.14 (http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61679/61679fig01large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61679/61679fig02.jpg"> Figura 2: Imagem ao vivo do tráfico de receptores de quimioterapia em neutrófilos. (A) Construções utilizadas para expressão transgênica específica de neutrófilo de Cxcr1-FT (Temporizador Fluorescente) e Cxcr2-FT. Projeções confocal de neutrófilos na cabeça de uma larva transgênica de 3 dpf (Tg(lyz:Cxcr1-FT), topo; Tg(lyz:Cxcr2-FT), inferior) mostrando canais tRFP (magenta) e sfGFP (verde). Barra de escala = 20 μm. (B) Esquema anatômico de 3 dpf larva como na Figura 1A. Abaixo da larva estão esquemas que retratam a área da ferida (W) com neutrófilos sendo mobilizados a partir do CHT (topo) ou realizando quimitaxis ao entrar na barbatana ventral (inferior). O quadrado tracejado indica área imagem em instantâneos à direita. (C) Nêutrons em larvas Tg(lyz:Cxcr1-FT) (sfGFP) após a mobilização do CHT (painéis superiores) ou quimiotaxis em direção à ferida (painéis inferiores). As flechas mostram as mesmas células ao longo do tempo. Os pontos de tempo na imagem direita são minutos decorridos após a imagem à esquerda. Barra de escala = 10 μm. (D) Representação esquemática da abordagem experimental para imagem ao vivo do tráfico de receptores de quimioterapia. Painéis A-C modificados a partir do ref.14 (http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61679/61679fig02large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61679/61679fig03.jpg"> Figura 3: Exemplos de quantificação da dinâmica dos receptores. Neutrófilos únicos (azuis) ou agrupados (verdes) em feridas ou neutrófilos não mobilizados na CHT (vermelho, laranja) foram segmentados e analisados por diferentes métodos para comparar resultados. As mesmas células de exemplo mostradas foram analisadas com dois métodos para relacionar o que é visto na imagem com a gama de valores extraídos. (A) A superfície das células selecionadas, exemplo, foi segmentada com base na definição de contorno no canal sfGFP. (B) O contraste foi computado a partir das células de exemplo mostradas em A. (C) A membrana das células selecionadas, exemplo, foram segmentadas com base na definição de contorno no canal CFP. Análise ratiométrica do sfGFP/CFP seguido. (D) A razão de sfGFP/CFP foi calculada nas células de exemplo mostradas em C. As barras de erro representam S.E.M. de células individuais, em casos de n>1, valores aqui não foram utilizados para análise estatística, mas apenas para exemplificar medições obtidas com os diferentes métodos de quantificação. Barra de escala = 10 μm. Figura modificada a partir do ref.14 (http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61679/61679fig03large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61679/61679fig04v2.jpg"> Figura 4: Dinâmica diferencial de Cxcr1 e Cxcr2 em resposta ao ferimento. (A) Projeção confocal de neutrófilos em larvas Tg(lyz:Cxcr1-FT) ou Tg (lyz:Cxcr2-FT) na ferida a 80 min pós-ferida (canal sfGFP mostrado). Barra de escala = 10 μm.  (B) Neutrófilo Cxcr1-FT ampliado (esquerda) e Cxcr2-FT (direita) na ferida. Receptor verde é mostrado em cinza. Barra de escala = 5 μm. (C) Contraste normalizado (contraste por neutrófilo individual normalizado ao contraste médio de células não mobilizadas no CHT). cxcl8a refere-se à injeção de um bloqueio de emendas juntamente com um morfolino bloqueador de tradução para cxcl8a. cxcl8b refere-se à injeção com um morfolino bloqueador de emendas para cxcl8b. Para Tg(lyz:Cxcr1-FT): n=24 células (CHT), n=47 células (ferida) de 8 larvas. Para Tg (lyz:Cxcr1-FT) com morfolnos: n=28 células (Cxcl8a-MO) de 5 larvas, n=16 células (Cxcl8b-MO) de 5 larvas. Para Tg (lyz:Cxcr2-FT): n=10 células (CHT) e n=20 células (ferida) de 3 larvas. Os dados foram agrupados de larvas independentes adquiridas em 1-5 sessões de imagem. Teste de Kruskal-Wallis com o teste de comparações múltiplas de Dunn para Tg (lyz:Cxcr1-FT), teste mann-whitney não pago de duas caudas para Tg (lyz:Cxcr2-FT). (D) Projeção confocal de neutrófilos em Tg(lyz:Cxcr1-FT) larvas transgênicas tratadas com cxcl8a morpholino (MO) (esquerda) e cxcl8b MO (direita) respondendo a feridas de barbatana (canal sfGFP mostrado em verde). Instantâneo tirada em pontos de tempo de acúmulo de neutrófilo equivalente (85 min pós-ferimentos na imagem esquerda e 45 minutos pós-ferimentos na imagem direita). Barra de escala = 10 μm. Figura modificada a partir do ref.14 (http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61679/61679fig04large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61679/61679fig05.jpg"> Figura 5: Ensaio de resposta de quimiocina em embriões primitivos. Fatias confocal de escaneamento a laser de embriões gastrulating mostrando expressão e distribuição de Cxcr1-FT. 100 pg de Cxcr1-FT mRNA foram injetadas em um estágio celular com ou sem 150 pg Cxcl8a mRNA. Receptores verdes e vermelhos são mostrados em canais separados. O marcador CFP da membrana de controle (mCFP) é mostrado no canal ciano. Barra de escala = 20 μm. Figura modificada a partir do ref.14 (http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61679/61679fig05large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
Filme suplementar 1: Neutrófilos transgênicos na cabeça de uma larva Tg(lyz:Cxcr1-FT) (esquerda) e Tg(lyz:Cxcr2-FT) (direita) a 3 dpf. sfGFP(verde), tagRFP (magenta). O intervalo de quadros é de 30 segundos e a taxa de quadros é de 5 fps. Barra de escala = 20 μm. O vídeo é originário do ref.14 (http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/). <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61679/Supplementary_Movie1.avi" target="_blank">Clique aqui para baixar este vídeo.</a>
Filme suplementar 2: Neutrófilos em Tg (lyz:Cxcr1-FT) (esquerda) e Tg (lyz:Cxcr2-FT) (direita) larvas transgênicas respondendo a feridas na barbatana. O filme começa dentro de 10 min pós-ferida e dura 60 min. sfGFP (verde), tagRFP (magenta). O intervalo de quadros é de 30 segundos e a taxa de quadros é de 10 fps. CHT = tecido hematopoiético caudal. VF = barbatana ventral. Barra de escala = 25 μm. O vídeo é originário do ref.14 (http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/). <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61679/Supplementary_Movie2.avi" target="_blank">Clique aqui para baixar este vídeo.</a>
Filme suplementar 3. Exemplos adicionais de neutrófilos de uma larva transgênica Tg(lyz:Cxcr1-FT) ferida (larva diferente da mostrada no Vídeo 2), adquirida em maior resolução, mostrando internalização receptora (canal sfGFP mostrado em verde) após mobilização no CHT ou na entrada e quimipeso na barbatana ventral. O intervalo de quadros é de 30 segundos e a taxa de quadros é de 2 fps. Barra de escala = 10 μm. O vídeo é originário do ref.14 (http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/). <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61679/Supplementary_Movie3.avi" target="_blank">Clique aqui para baixar este vídeo.</a>
Arquivo complementar 1: <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61679/Supplementary%20file%201.m" target="_blank">Clique aqui para baixar este arquivo.</a>
Arquivo suplementar 2: <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61679/Supplementary%20file%202.m" target="_blank">Clique aqui para baixar este arquivo.</a>
Arquivo complementar 3: <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61679/Supplementary%20file%203.m" target="_blank">Clique aqui para baixar este arquivo.</a>
Arquivo complementar 4: <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61679/Supplementary%20file%204.m" target="_blank">Clique aqui para baixar este arquivo.</a>

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Live Imaging of Chemokine Receptors in Zebrafish Neutrophils During Wound Responses

Aqui descrevemos protocolos para realizar imagens ao vivo e análise quantitativa da dinâmica do receptor quimioattractant em neutófilos de zebrafish

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Research

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