Name: live imaging of chemokine receptors in zebrafish neutrophils during wound responses
Uploaded: 2020-12-04T13:30:00
Duration: 6 min 48 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Live Imaging of Chemokine Receptors in Zebrafish Neutrophils During Wound Responses at JoVE.com

Мы благодарим Кристин Холт и Билла Харриса за помощь в конфокальной микроскопии. Мы благодарим Даррена Гилмора за флуоресцентные конструкции основы таймера и Анну Хаттенлохер за вектор магистрали Tol2-Lyz. Мы благодарим Стива Реншоу за линию Tg(mpx:GFP)i114 . Эта работа была поддержана MRC (MR/L019523/1), Wellcome Trust [204845/Z/16/Z]; Исаак Ньютон Траст [12.21(a)i] и грант Исаака Ньютона Траст 19.23(n). C.C. был поддержан студенческим курсом MRC DTP и частично Wellcome Trust [204845/Z/16/Z]; Грант Исаака Ньютона [12.21(a)i]. H.W. был поддержан MRC DTP Studentship. H.P. был поддержан грантом Wellcome Trust PhD (105391/Z/14/Z) и частично Wellcome Trust [204845/Z/16/Z]; Грант Isaac Newton Trust [12.21(a)i] и грант MRC (MR/L019523/1).

<ol>
	<li>Rot, A., von Andrian, U. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemokines+in+innate+and+adaptive+host+defense:+basic+chemokinese+grammar+for+immune+cells.">Chemokines in innate and adaptive host defense: basic chemokinese grammar for immune cells.</a> Annual Review of Immunology. 22, 891-928 (2004).</li><li>Cotton, M., Claing, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=G+protein-coupled+receptors+stimulation+and+the+control+of+cell+migration.">G protein-coupled receptors stimulation and the control of cell migration.</a> Cellular Signalling. 21 (7), 1045-1053 (2009).</li><li>Liu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bidirectional+regulation+of+neutrophil+migration+by+mitogen-activated+protein+kinases.">Bidirectional regulation of neutrophil migration by mitogen-activated protein kinases.</a> Nature Immunology. 13 (5), 457-464 (2012).</li><li>Wen, X., Jin, T., Xu, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+G+Protein-coupled+Receptor-mediated+Chemotaxis+and+its+Signaling+Events+in+Neutrophil-like+HL60+Cells.">Imaging G Protein-coupled Receptor-mediated Chemotaxis and its Signaling Events in Neutrophil-like HL60 Cells.</a> Journal of Visualized Experiments. (115), e54511 (2016).</li><li>Arnon, T. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GRK2-dependent+S1PR1+desensitization+is+required+for+lymphocytes+to+overcome+their+attraction+to+blood.">GRK2-dependent S1PR1 desensitization is required for lymphocytes to overcome their attraction to blood.</a> Science. 333 (6051), 1898-1903 (2011).</li><li>Jung, H., Mithal, D. S., Park, J. E., Miller, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Localized+CCR2+Activation+in+the+Bone+Marrow+Niche+Mobilizes+Monocytes+by+Desensitizing+CXCR4.">Localized CCR2 Activation in the Bone Marrow Niche Mobilizes Monocytes by Desensitizing CXCR4.</a> PloS One. 10 (6), 0128387 (2015).</li><li>Kwan, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Tol2kit:+a+multisite+gateway-based+construction+kit+for+Tol2+transposon+transgenesis+constructs.">The Tol2kit: a multisite gateway-based construction kit for Tol2 transposon transgenesis constructs.</a> Developmental Dynamics: An Official Publication of the American Association of Anatomists. 236 (11), 3088-3099 (2007).</li><li>Don&#224;, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directional+tissue+migration+through+a+self-generated+chemokine+gradient.">Directional tissue migration through a self-generated chemokine gradient.</a> Nature. 503 (7475), 285-289 (2013).</li><li>Venkiteswaran, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+and+dynamics+of+an+endogenous,+self-generated+signaling+gradient+across+a+migrating+tissue.">Generation and dynamics of an endogenous, self-generated signaling gradient across a migrating tissue.</a> Cell. 155 (3), 674-687 (2013).</li><li>Minina, S., Reichman-Fried, M., Raz, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+receptor+internalization,+signaling+level,+and+precise+arrival+at+the+target+in+guided+cell+migration.">Control of receptor internalization, signaling level, and precise arrival at the target in guided cell migration.</a> Current Biology. 17 (13), 1164-1172 (2007).</li><li>Yoo, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+microtubules+in+neutrophil+polarity+and+migration+in+live+zebrafish.">The role of microtubules in neutrophil polarity and migration in live zebrafish.</a> Journal of Cell Science. 125, 5702-5710 (2012).</li><li>Yoo, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+regulation+of+protrusion+and+polarity+by+PI3K+during+neutrophil+motility+in+live+zebrafish.">Differential regulation of protrusion and polarity by PI3K during neutrophil motility in live zebrafish.</a> Developmental Cell. 18 (2), 226-236 (2010).</li><li>Buchan, K. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+transgenic+zebrafish+line+for+in+vivo+visualisation+of+neutrophil+myeloperoxidase.">A transgenic zebrafish line for in vivo visualisation of neutrophil myeloperoxidase.</a> PLoS One. 14 (4), 0215592 (2019).</li><li>Coombs, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemokine+receptor+trafficking+coordinates+neutrophil+clustering+and+dispersal+at+wounds+in+zebrafish.">Chemokine receptor trafficking coordinates neutrophil clustering and dispersal at wounds in zebrafish.</a> Nature Communications. 10 (1), 5166 (2019).</li><li>Hall, C., Flores, M. V., Storm, T., Crosier, K., Crosier, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+zebrafish+lysozyme+C+promoter+drives+myeloid-specific+expression+in+transgenic+fish.">The zebrafish lysozyme C promoter drives myeloid-specific expression in transgenic fish.</a> BMC Developmental Biology. 7, 42 (2007).</li><li>Renshaw, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+transgenic+zebrafish+model+of+neutrophilic+inflammation.">A transgenic zebrafish model of neutrophilic inflammation.</a> Blood. 108 (13), 3976-3978 (2006).</li><li>Khmelinskii, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tandem+fluorescent+protein+timers+for+in+vivo+analysis+of+protein+dynamics.">Tandem fluorescent protein timers for in vivo analysis of protein dynamics.</a> Nature Biotechnology. 30 (7), 708-714 (2012).</li><li>Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The zebrafish book. A guide for the laboratory use of zebrafish (Brachydanio rerio). , (2007).</li><li>Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microinjection+of+Zebrafish+Embryos+to+Analyze+Gene+Function.">Microinjection of Zebrafish Embryos to Analyze Gene Function.</a> Journal of Visualized Experiments. (25), 1115 (2009).</li><li>Detrich, H. W., Zon, L. I., Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Zebrafish: Genetics, Genomics and Informatics. , (2004).</li><li>Le Guyader, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Origins+and+unconventional+behavior+of+neutrophils+in+developing+zebrafish.">Origins and unconventional behavior of neutrophils in developing zebrafish.</a> Blood. 111 (1), 132-141 (2008).</li><li>Chan, T. F., Vese, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Active+contours+without+edges.">Active contours without edges.</a> IEEE Transactions on Image Processing. 10 (2), 266-277 (2001).</li><li>Haralick, R. M., Shanmugam, K., Dinstein, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Textural+features+for+image+Classification.">Textural features for image Classification.</a> IEEE Transactions on Systems, Man, and Cybernetics. SMC-3 (6), 610-621 (1973).</li><li>Deng, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Localized+bacterial+infection+induces+systemic+activation+of+neutrophils+through+Cxcr2+signaling+in+zebrafish.">Localized bacterial infection induces systemic activation of neutrophils through Cxcr2 signaling in zebrafish.</a> Journal of Leukocyte Biology. 93 (5), 761-769 (2013).</li><li>Torraca, V., Mostowy, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+infection:+From+pathogenesis+to+cell+biology.">Zebrafish infection: From pathogenesis to cell biology.</a> Trends in Cell Biology. 28 (2), 143-156 (2018).</li><li>Feng, Y., Santoriello, C., Mione, M., Hurlstone, A., Martin, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+imaging+of+innate+immune+cell+sensing+of+transformed+cells+in+zebrafish+larvae:+parallels+between+tumor+initiation+and+wound+inflammation.">Live imaging of innate immune cell sensing of transformed cells in zebrafish larvae: parallels between tumor initiation and wound inflammation.</a> PLoS Biology. 8 (12), 1000562 (2010).</li><li>Poplimont, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+swarming+in+damaged+tissue+is+orchestrated+by+connexins+and+cooperative+calcium+alarm+signals.">Neutrophil swarming in damaged tissue is orchestrated by connexins and cooperative calcium alarm signals.</a> Current Biology. 30 (14), 2761-2776.e7 (2020).</li><li>Cornet, C., Di Donato, V., Terriente, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combining+Zebrafish+and+CRISPR/Cas9:+Toward+a+more+efficient+drug+discovery+pipeline.">Combining Zebrafish and CRISPR/Cas9: Toward a more efficient drug discovery pipeline.</a> Frontiers in Pharmacology. 9, 703 (2018).</li><li>Kienle, K., L&#228;mmermann, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+swarming:+an+essential+process+of+the+neutrophil+tissue+response.">Neutrophil swarming: an essential process of the neutrophil tissue response.</a> Immunological Reviews. 273 (1), 76-93 (2016).</li><li>Lisse, T. S., Brochu, E. A., Rieger, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Capturing+tissue+repair+in+zebrafish+larvae+with+time-lapse+brightfield+stereomicroscopy.">Capturing tissue repair in zebrafish larvae with time-lapse brightfield stereomicroscopy.</a> Journal of Visualized Experiments. (95), e52654 (2015).</li></ol>

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов

Описанный способ позволяет в реальном времени визуализировать динамику рецепторов в ответ на эндогенные лиганды in situ во время воспалительной реакции на повреждение тканей. Использование нейтрофильных репортеров Cxcr1 /Cxcr2 может быть распространено на другие физиологические условия, такие как инфекция, модели опухолей или другие типы повреждения тканей 14,25,26,27. Кроме того, трансгенные спасательные линии, в которых эндогенный рецептор подавляется и спасается экзогенным мутантным рецептором, могут предоставить полезные инструменты для анализа важности специфических моделей миграции нейтрофилов в иммунных реакциях. Например, мутанты рецепторов Cxcr1, которые имеют нарушенную десенсибилизацию, вызывают более заметную кластеризацию нейтрофилов в воспалительных участках14. Это усиление фенотипа функции может быть использовано для понимания роли конгрегации нейтрофилов в различных физиологических процессах, например, заживление ран, инфекционные заболевания или эволюция опухоли, а также в экспериментах по нокдауну / нокауту рецепторов комплемента. Методология также обеспечивает основу для расширения круга имеющихся репортеров. Выбор флуоресцентного репортера важен для рассмотрения и зависит от биологического вопроса. Мы обнаружили, что конститутивный оборот этих хемокиновых рецепторов в нейтрофилах был высоким по сравнению с эпителиальными клетками, и что репортеры с быстрым созреванием (например, sfGFP) должны были сообщать об уровнях мембраны в устойчивом состоянии и разрешать различия при стимуляции нейтрофилов 8,14. Таким образом, мембранные соотношения sfGFP/tagRFP неприменимы для измерения лиганд-индуцированной интернализации в этом типе клеток, но паттерн tagRFP позволяет отслеживать внутриклеточные судьбы рецептора, что может быть полезно в некоторых исследованиях. Мы также обнаружили, что более концентрированный внутриклеточный сигнал tagRFP полезен для скрининга отдельных личинок. Альтернативный подход к измерению уровней рецепторов на плазматической мембране заключается в совместной экспрессии флуоресцентного мембранного маркера в нейтрофилах либо в том же трансгене9, либо в независимом трансгене14. В первом сценарии трансген обеспечит дополнительные средства для скрининга рыбы, и уровни экспрессии будут сопоставимы между маркером и рецептором. Последний подход будет более модульным, поскольку линия рыбок данио с рецепторным репортером может быть объединена с различными репортерными линиями. В любом случае, стоит отметить, что мембранная количественная оценка уровней рецепторов является сложной задачей в кластеризованных нейтрофилах (см. Ниже). Наконец, мы отмечаем, что возможным расширением этого протокола было бы наблюдение за живой визуализацией с помощью иммуногистохимии для более детального анализа локализации.
Система трансгенеза Tol2 хорошо зарекомендовала себя7, а промотор лизоцима С широко использовался для экспрессии нейтрофилов11,15. Таким образом, подход трансгенеза относительно прост, и уровень экспрессии, достигнутый с помощью этого промотора, достаточно высок, чтобы обеспечить достаточный контраст для анализа динамики рецепторов. Возможным ограничением является то, что уровень экспрессии не повторяет уровни экспрессии эндогенных рецепторов. Новые технологии CRISPR могут быть развернуты для создания линий детонации для рецепторов, представляющих особый интерес28. Эти технологии по-прежнему громоздки и могут не гарантировать требуемые уровни экспрессии для субклеточной визуализации, но их успешное развитие станет важным прорывом для понимания динамики эндогенной сигнализации. Функциональные валидации важны для интерпретации данных с трансгенными рецепторными конструкциями. Например, анализы распознавания лигандов могут быть использованы для установления того, что флуоресцентный слитый белок функционален, а спасение нокаутных фенотипов может быть использовано для установления того, что уровни экспрессии трансгенных нейтрофилов совместимы с функциональностью14. Наконец, более прямым способом подтверждения слияния рецепторов было бы использование функционального анализа in vitro с меченым рецептором наряду с немаркированными версиями14.
Подход к количественной оценке решает конкретные трудности в точной сегментации мембран в нейтрофилах in vivo. В клетках эпителиальной природы количественная оценка уровней рецепторов может быть выполнена автоматически путем нормализации уровней мембранных рецепторов до контрольного маркера, который может быть экспрессирован в тандеме или отдельно9. Действительно, мы применили такой подход при использовании анализа распознавания лигандов при гаструлировании эмбрионов14. Однако нейтрофилы претерпевают сложные, быстрые изменения формы клеток in vivo, что затрудняет сегментацию мембран как в 2D, так и в 3D14. Это еще более сложно, когда нейтрофилы группируются, что происходит во многих физиологических условиях29. Метрика контраста преодолевает это ограничение, поскольку она не требует сегментации мембраны, а вместо этого отражает общее состояние распределения рецепторов в клетке (мембранное / гладкое против везикулярного / точечного). Важно отметить, что на метрику контрастности может влиять общая контрастность изображения, поэтому нормализация значений отдельных клеток к внутренней ссылке необходима для учета изменчивости сигнала у разных эмбрионов / образцов. Например, мы использовали среднее значение клеточного контраста нечувствительных нейтрофилов в CHT (т.е. нейтрофилов, которые остаются неподвижными и не мигрируют в вентральный плавник)14. Дополнительной возможностью будет нормализация с контрастностью значений контрольного маркера в той же ячейке. Это обеспечит решение, когда внутренняя ссылка на не отвечающие клетки недоступна, и, вероятно, может разрешить более тонкие количественные различия в динамике рецепторов между различными условиями.
Местоположение изображения является еще одной переменной, которую следует учитывать. Причина выбора раны брюшного плавника здесь, в отличие от более часто используемой раны хвостового плавника модели16,30, заключается в том, что место ранения находится рядом с местом проживания нейтрофилов / мигрирующего происхождения. Это ускоряет временную шкалу анализа, так как для прибытия нейтрофилов требуется относительно мало времени. Кроме того, он дает возможность фиксировать поведение клеток как в начале миграции (CHT), так и в целевом месте, представляющем интерес (рана). Это актуально и здесь, потому что пространственное и временное разрешение, необходимое для субклеточной визуализации, трудно сочетать с большим полем зрения или многопозиционным сканированием. Таким образом, раневой анализ вентрального плавника позволяет отслеживать эволюцию миграционного ответа от происхождения миграции и одновременно захватывать неспецифические колебания рецепторов в клетках, которые не реагируют. Как упоминалось выше, последнее полезно для целей количественной оценки, поскольку оно обеспечивает внутреннюю ссылку на неконкретную динамику. В других системах может оказаться невозможным иметь такую внутреннюю привязку, и в этом случае значения контраста совместно экспрессированного мембранного маркера обеспечат альтернативный контроль.
Таким образом, мы ожидаем, что методология применима к другим системам и может быть развернута для различных целей. Например, те же репортеры могут быть использованы в других воспалительных условиях, таких как инфекции или другие модели заболеваний. Репертуар репортерных линий рецепторов рыбок данио может быть расширен на другие сигнальные рецепторы, чтобы понять сигнальные механизмы или сообщить о динамике лигандов in vivo. Этот подход может быть объединен с методами нокдауна/нокаута для опроса механистической основы наблюдаемой динамики. Например, возмущение экспрессии лиганда может указывать на зависимость лиганда от наблюдаемой динамики рецепторов. В будущем мы предполагаем, что эта система может быть доработана, с тем чтобы включить в нее вставку репортеров. В конечном счете, результаты, использующие эту методологию, предоставят новые идеи, ценные за пределами сообщества рыбок данио, учитывая сохранение этих сигнальных рецепторов у млекопитающих и относительную проблему проведения этих исследований на более крупных организмах.

Миграция лейкоцитов имеет первостепенное значение для иммунных реакций. Иммунные клетки являются прототипами мигрирующих клеток, которые удивительно способны пересекать ткани и кровеносные сосуды и ощущать ряд химических ориентиров для направленной миграции к микробам или другим важным клеткам-хозяевам. Правильное руководство опирается на распознавание химиоаттрактантантов, среди которых хемокины представляют собой наиболее заметную категорию1. Хемокины распознаются высокоспецифичными семитрансмембранными рецепторами, связанными с G-белком. При связывании хемокина хемокиновые рецепторы изменяют конформацию, что приводит к активации ассоциированных тримерных G-белков и их диссоциации в функциональные сигнальные субъединицы, способствующие цитоскелетным изменениям и направленной миграции1. Во-вторых, хемокиновые рецепторы фосфорилируются, и эта модификация приводит к десенсибилизации к аттрактанту, за которой может последовать быстрая ресенсибилизация/рециркуляция или внутриклеточная деградация и понижение регуляции с поверхности клетки2. Динамика этих рецепторов влияет на продолжительность и дозу передачи сигналов, получаемых клетками, но как они влияют на поведение миграции лейкоцитов, было трудно выяснить in vivo.
Отслеживание динамики рецепторов в живых лейкоцитах в традиционных системах млекопитающих сталкивается с несколькими проблемами. Для живых исследований слияния рецепторов с флуоресцентными белками должны быть экспрессированы в клетках. Это является сложной задачей в первичных лейкоцитах, особенно в нейтрофилах, и исследования до сих пор использовали суррогатные клеточные линии нейтрофилов для экспрессии хемокиновых рецепторов 3,4. Генерация трансгенных мышиных моделей, в которых лейкоциты экспрессируют флуоресцентный рецептор или мутантные рецепторы с информативными дефектами трафика 5,6, влечет за собой значительные затраты времени и ресурсов. Даже в этих случаях разрешение изображения и контраст для визуализации динамики рецепторов у живого животного могут быть ограничены, и в исследованиях использовалась иммуногистохимия на фиксированных участкахткани 5. Учитывая эти технические проблемы, наше понимание того, как динамика рецепторов хемоаттрактанта влияет на поведение клеток в условиях живой ткани, в настоящее время ограничено.
Здесь мы приводим методологию мониторинга трафика рецепторов у нейтрофилов рыбок данио. Рыбки данио генетически поддаются обработке, как и мыши, но трансгенез относительно более прост благодаря использованию эффективных транспозонных систем и прямых манипуляций с зиготами7. Прозрачная личинка идеально поддается визуализации. Динамика хемокиновых рецепторов была визуализирована в первичных половых клетках и примордии боковой линии путем экспрессии соответствующих слияний с флуоресцентными репортерами 8,9,10. Личинки рыбок данио оснащены зрелыми нейтрофилами, которые обладают высококонсервативными генетическими и клеточными свойствами по отношению к нейтрофилам млекопитающих. Субклеточная динамика передачи сигналов, такая как динамика цитоскелета и регуляторы полярности, была визуализирована в этих клетках путем генерации соответствующих трансгенных линий 11,12,13. Недавно мы визуализировали и функционально проанализировали динамику хемокиновых рецепторов в нейтрофилах в ходе воспалительных реакций на повреждение тканей14. Здесь мы описываем генерацию трансгенных репортерных линий для передачи сигналов хемокинам в нейтрофилах, подготовку эмбрионов к живой визуализации, раневой анализ для изучения сигналов нейтрофилов и протокол получения и анализа изображений. Мы также предоставляем побочный протокол для проверки реакций хемокиновых рецепторов на лиганды-кандидаты, что полезно при попытке установить паттерны распознавания лигандов в нехарактеризованных рецепторах. Эти методы могут быть использованы в сочетании с дальнейшими генетическими манипуляциями, такими как ингибирование экспрессии эндогенного хемокина или генерация мутантных рецепторов с измененным лиганд-индуцированным трафиком, чтобы выяснить, как специфическая динамика передачи сигналов влияет на поведение лейкоцитов in vivo. Трансгенные линии, экспрессирующие флуоресцентно помеченные хемокиновые рецепторы, также могут быть использованы в качестве репортеров для эндогенных градиентов хемокина, которые в противном случае трудно обнаружить путем прямого окрашивания антител. Описанная методология предоставляет возможности для расширения генерации репортеров на другие иммуносигнационные рецепторы.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>1-phenyl-2-thiourea</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P7629-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50mL CellStar Centrifuge Tube</td>
			<td>Grenier Bio-One Limited</td>
			<td>210270</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clark capillary glass</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>30-0020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cleanline Thin Bleach</td>
			<td>Scientific Laboratory Supplies</td>
			<td>CLE0301</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting scope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>SMZ645</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dri Block heater</td>
			<td>Techne</td>
			<td>FDB02AD</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiji</td>
			<td>National Institutes of Health, Bethesda, MD</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps, Jewelers Dumont No. 5</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F6521</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass bottom microwell dishes</td>
			<td>MatTek</td>
			<td>P35G-1.5-14-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass pasteur pipette</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>11795098</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Invitrogen Ambion mMESSAGE mMACHINE SP6 Transcription Kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>10391175</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica SP8 confocal microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low melting point agarose</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>16520-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic stand</td>
			<td>Narishige</td>
			<td>GJ-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MATLAB</td>
			<td>The MathWorks, Inc., Natick, MA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methylene blue</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M9140-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgSO4</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M-2643</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microinjection system</td>
			<td>Parker</td>
			<td>Picospritzer III</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microloader pipette tips</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5242956003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micromanipulator</td>
			<td>Narishige</td>
			<td>M-152</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette Puller</td>
			<td>Sutter Instrument Company</td>
			<td>Flaming/Brown P-97</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope slide</td>
			<td>Thermo-Scientific</td>
			<td>J1800AMNZ</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PerkinElmer Spinning Disk UltraVIEW ERS, Olympus IX81 spinnng disk confocal microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish (120mm)</td>
			<td>Grenier Bio-One Limited</td>
			<td>632180</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenol red</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P0290-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly(A) Tailing Kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM1350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prism</td>
			<td>GraphPad Software</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Small paintbrush</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectral Applied Research LMM5 laser module</td>
			<td></td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical Scalpel Blade No. 23</td>
			<td>Swann-Morton</td>
			<td>233-5528</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tricaine MS222</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E10521-50G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Volocity software</td>
			<td></td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yokogawa CSU10 spinning disc confocal scanner</td>
			<td>Yokogawa</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

live imaging of chemokine receptors in zebrafish neutrophils during wound responses

Руководство лейкоцитами по химическим градиентам имеет важное значение для иммунных реакций. Нейтрофилы являются первыми клетками, которые будут рекрутированы в места повреждения тканей, где они выполняют важнейшие антимикробные функции. Их перемещение в эти локусы организуется несколькими воспалительными химиоаттрактантантами, включая хемокины. На молекулярном уровне передача сигналов хемоаттрактанта регулируется внутриклеточным трафиком соответствующих рецепторов. Однако остается неясным, как субклеточные изменения в хемокиновых рецепторах влияют на динамику миграции лейкоцитов на клеточном и тканевом уровне. Здесь описана методология живой визуализации и количественного анализа динамики хемокиновых рецепторов у нейтрофилов при воспалительных реакциях на повреждение тканей. Эти инструменты показали, что дифференциальный трафик хемокиновых рецепторов у нейтрофилов рыбок данио координирует кластеризацию и рассеивание нейтрофилов в местах повреждения тканей. Это имеет значение для нашего понимания того, как воспалительные реакции саморазрешаются. Описанные инструменты могут быть использованы для понимания моделей миграции нейтрофилов в различных физиологических и патологических условиях, и методология может быть расширена на другие сигнальные рецепторы.

Watch this Scientific Journal Video about Live Imaging of Chemokine Receptors in Zebrafish Neutrophils During Wound Responses at JoVE.com

Live Imaging of Chemokine Receptors in Zebrafish Neutrophils During Wound Responses

Здесь мы описываем протоколы для выполнения живой визуализации и количественного анализа динамики рецепторов хемоаттрактантов у нейтрофилов рыбок данио

Живая визуализация хемокиновых рецепторов у нейтрофилов рыбок данио во время раневых реакций

Leukocyte guidance by chemical gradients is essential for immune responses. Neutrophils are the first cells to be recruited to sites of tissue damage ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

In vivo Imaging of Transgenic Leishmania Parasites in a Live Host

In vivo Imaging of Transgenic Leishmania Parasites in a Live Host

В естественных изображений трансгенных Паразиты Leishmania в реальный хост

Distinct species of Leishmania, a protozoan parasite of the family Trypanosomatidae, typically cause different human disease manifestations. The most ...

Retroviral Transduction of T-cell Receptors in Mouse T-cells

Ретровирусные трансдукция Т-клеточных рецепторов в мышь Т-клеток

T-cell receptors (TCRs) play a central role in the immune system. TCRs on T-cell surfaces can specifically recognize peptide antigens presented by antigen ...

Non-invasive Imaging of Disseminated Candidiasis in Zebrafish Larvae

Неинвазивная визуализация диссеминированный кандидоз в Личинки данио рерио

Disseminated candidiasis caused by the pathogen Candida albicans is a clinically important problem in hospitalized individuals and is associated with a 30 ...

Visualization of Bacterial Toxin Induced Responses Using Live Cell Fluorescence Microscopy

Визуализация бактериальный токсин индуцированные ответы с помощью флуоресцентной микроскопии Онлайн сотовых

Bacterial toxins bind to cholesterol in membranes, forming pores that allow for leakage of cellular contents and influx of materials from the external ...

Real-time Imaging of Heterotypic Platelet-neutrophil Interactions on the Activated Endothelium During Vascular Inflammation and Thrombus Formation in Live Mice

Изображений в реальном времени из гетеротипические тромбоцитов нейтрофилами взаимодействий на активированного эндотелия Во сосудистого воспаления и тромбообразования в живых мышей

Interaction of activated platelets and leukocytes (mainly neutrophils) on the activated endothelium mediates thrombosis and vascular inflammation.1,2 ...

Characterization of Inflammatory Responses During Intranasal Colonization with Streptococcus pneumoniae

Characterization of Inflammatory Responses During Intranasal Colonization with Streptococcus pneumoniae

Характеристика воспалительных реакций во время интраназальной колонизации стрептококковой пневмонией

Nasopharyngeal colonization by Streptococcus pneumoniae is a prerequisite to invasion to the lungs or bloodstream1. This organism is capable of colonizing ...

Imaging Neutrophils and Monocytes in Mesenteric Veins by Intravital Microscopy on Anaesthetized Mice in Real Time

Воображение нейтрофилов и моноцитов в брыжеечных вен Прижизненное микроскопии на наркотизированных мышей в реальном времени

Efficient immune response is dependent on rapid mobilization of blood leukocytes to the site of infection or injury. Investigating leukocyte migration in ...

Measuring Physiological Responses of Drosophila Sensory Neurons to Lipid Pheromones Using Live Calcium Imaging

Measuring Physiological Responses of Drosophila Sensory Neurons to Lipid Pheromones Using Live Calcium Imaging

Измерение физиологических реакций<em&gt; Drosophila</em&gt; Сенсорными нейронами липид феромонов с использованием живых визуализации кальция

Unlike mammals, insects such as Drosophila have multiple taste organs. The chemosensory neurons on the legs, proboscis, wings and ovipositor of Drosophila ...

Live Imaging of Antifungal Activity by Human Primary Neutrophils and Monocytes in Response to A. fumigatus

Live Imaging of Antifungal Activity by Human Primary Neutrophils and Monocytes in Response to A. fumigatus

Живая съемка противогрибковой активности на человеке первичных нейтрофилов и моноцитах в ответ на<em&gt; A. fumigatus</em

Aspergillus fumigatus is an opportunistic fungal pathogen causing invasive infections in immunocompromised hosts with a high case-fatality rate. Research ...

Isolation of Salmonella typhimurium-containing Phagosomes from Macrophages

Isolation of Salmonella typhimurium-containing Phagosomes from Macrophages

Изоляция Salmonella typhimurium-содержащих Phagosomes от макрофагов

Salmonella typhimurium is a facultative intracellular bacterium that causes gastroenteritis in humans. After invasion of the lamina propria, S. ...