Name: live imaging of chemokine receptors in zebrafish neutrophils during wound responses
Uploaded: 2020-12-04T13:30:00
Duration: 6 min 48 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Live Imaging of Chemokine Receptors in Zebrafish Neutrophils During Wound Responses at JoVE.com

Agradecemos a Christine Holt y Bill Harris por su ayuda con la microscopía confocal. Agradecemos a Darren Gilmour por las construcciones de la columna vertebral del temporizador fluorescente y a Anna Huttenlocher por el vector de la columna vertebral Tol2-Lyz. Agradecemos a Steve Renshaw por la línea Tg(mpx:GFP)i114 . Esta labor contó con el apoyo del MRC (MR/L019523/1), el Wellcome Trust [204845/Z/16/Z]; Isaac Newton Trust [12.21(a)i] y una subvención de Isaac Newton Trust 19.23(n). C.C. contó con el apoyo de una beca de MRC DTP y en parte del Wellcome Trust [204845/Z/16/Z]; Isaac Newton Trust [12.21(a)i] subvención. H.W. fue apoyado por un MRC DTP Studentship. H.P. fue apoyado por una beca de doctorado de Wellcome Trust (105391/Z/14/Z) y en parte por un Wellcome Trust [204845/Z/16/Z]; Subvención del Isaac Newton Trust [12.21(a)i] y el MRC (MR/L019523/1).

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Los autores declaran no tener conflicto de intereses

El método descrito permite obtener imágenes en vivo de la dinámica de los receptores en respuesta a ligandos endógenos in situ durante una respuesta inflamatoria al daño tisular. El uso de reporteros de neutrófilos Cxcr1/Cxcr2 podría ampliarse a otros entornos fisiológicos, como infecciones, modelos tumorales u otros tipos de daño tisular 14,25,26,27. Además, las líneas de rescate transgénico, en las que el receptor endógeno es suprimido y rescatado por un receptor mutante exógeno, podrían proporcionar herramientas útiles para diseccionar la importancia de los patrones específicos de migración de neutrófilos en las respuestas inmunes. Por ejemplo, los mutantes del receptor Cxcr1 que tienen una desensibilización deteriorada causan agrupamiento de neutrófilos más prominente en los sitios inflamatorios14. Esta ganancia de fenotipo de función podría usarse para comprender el papel de la congregación de neutrófilos en diferentes procesos fisiológicos, por ejemplo, reparación de heridas, enfermedades infecciosas o evolución tumoral, y experimentos de derribo / eliminación de receptores del complemento. La metodología también proporciona una base para ampliar la gama de reporteros disponibles. La elección del reportero fluorescente es importante de considerar y depende de la cuestión biológica. Encontramos que el recambio constitutivo de estos receptores de quimiocinas en neutrófilos fue alto, en comparación con las células epiteliales, y que los reporteros con maduración rápida (p.ej., sfGFP) debían informar los niveles de membrana en estado estacionario y resolver las diferencias tras la estimulación de neutrófilos 8,14. Por lo tanto, las proporciones de membrana de sfGFP / tagRFP no son aplicables para medir la internalización inducida por ligandos en este tipo de célula, pero el patrón de tagRFP permite el seguimiento de los destinos intracelulares del receptor, lo que podría ser útil en algunos estudios. También encontramos que la señal intracelular más concentrada de tagRFP es útil para la detección de larvas individuales. Un enfoque alternativo para medir los niveles de receptores en la membrana plasmática sería coexpresar un marcador de membrana fluorescente en neutrófilos, ya sea en el mismo transgén9 o en un transgén14 independiente. En el primer escenario, el transgén proporcionaría un medio adicional para examinar a los peces y los niveles de expresión serían comparables entre el marcador y el receptor. Este último enfoque sería más modular, ya que una línea de pez cebra con un reportero receptor podría combinarse con diferentes líneas de reportero. En cualquier caso, vale la pena señalar que la cuantificación de la membrana de los niveles del receptor es un desafío en los neutrófilos agrupados (ver más abajo). Finalmente, observamos que una posible extensión de este protocolo sería hacer un seguimiento de las imágenes en vivo por inmunohistoquímica para análisis de localización más detallados.
El sistema de transgénesis Tol2 está bien establecido7 y el promotor de lisozima C se ha utilizado ampliamente para la expresión de neutrófilos11,15. El enfoque de transgénesis es, por lo tanto, relativamente sencillo y el nivel de expresión alcanzado con este promotor es lo suficientemente alto como para proporcionar suficiente contraste para el análisis de la dinámica del receptor. Una posible limitación es que el nivel de expresión no recapitula los niveles de expresión del receptor endógeno. Se podrían implementar nuevas tecnologías CRISPR para establecer líneas de llamada para receptores de particular interés28. Estas tecnologías siguen siendo engorrosas y pueden no garantizar los niveles de expresión requeridos para las imágenes subcelulares, pero su desarrollo exitoso sería un avance importante para comprender la dinámica de señalización endógena. Las validaciones funcionales son importantes para interpretar los datos con construcciones de receptores transgénicos. Por ejemplo, los ensayos de reconocimiento de ligandos se pueden utilizar para establecer que la proteína de fusión fluorescente es funcional y el rescate de fenotipos knockout podría utilizarse para establecer que los niveles de expresión de neutrófilos transgénicos son compatibles con la funcionalidad14. Finalmente, una forma más directa de validar la fusión del receptor sería utilizar un ensayo funcional in vitro con receptor etiquetado junto con las versiones no marcadas14.
El enfoque de cuantificación aborda dificultades específicas en la segmentación precisa de la membrana en neutrófilos in vivo. En células de naturaleza epitelial, la cuantificación de los niveles de receptores se puede ejecutar automáticamente normalizando los niveles de receptores de membrana a un marcador de control, que se puede expresar en tándem o por separado9. De hecho, hemos aplicado este enfoque, al utilizar el ensayo de reconocimiento de ligandos en embriones gastrulatantes14. Sin embargo, los neutrófilos experimentan cambios complejos y rápidos en la forma de la célula in vivo, lo que dificulta la segmentación de la membrana tanto en 2D como en 3D14. Esto es aún más difícil cuando los neutrófilos se agrupan, lo que ocurre en muchos entornos fisiológicos29. La métrica de contraste supera esta limitación, ya que no requiere segmentación de membrana, sino que refleja el estado general de distribución del receptor en la célula (membranoso / liso vs vesicular / puntiagudo). Es importante tener en cuenta que la métrica de contraste puede verse afectada por el contraste general de la imagen, por lo que se requiere la normalización de los valores celulares individuales a una referencia interna para tener en cuenta la variabilidad de la señal en diferentes embriones / muestras. Por ejemplo, utilizamos el valor medio de contraste celular de neutrófilos no sensibles en la CHT (es decir, neutrófilos que permanecen estacionarios y no migran a la aleta ventral)14. Una posibilidad adicional sería normalizar con valores de contraste de un marcador de control en la misma celda. Esto proporcionaría una solución cuando no se dispone de una referencia interna de células que no responden y es probable que resuelva diferencias cuantitativas más finas en la dinámica del receptor entre diferentes afecciones.
La ubicación de las imágenes es otra variable a considerar. La razón para elegir la herida de la aleta ventral aquí, a diferencia del modelo de herida de la aleta caudal más comúnmente utilizado16,30, es porque el sitio de la herida está cerca del sitio de residencia de neutrófilos / origen migratorio. Esto acelera la línea de tiempo del ensayo, ya que los neutrófilos tardan relativamente poco tiempo en llegar. Además, brinda la oportunidad de capturar el comportamiento celular tanto en el origen de la migración (CHT) como en la ubicación objetivo de interés (herida). Esto es relevante aquí, porque la resolución espacial y temporal requerida para las imágenes subcelulares es difícil de combinar con un gran campo de visión o escaneo de múltiples posiciones. Así, el ensayo de herida de aleta ventral permite rastrear la evolución de la respuesta migratoria desde el origen migratorio y la captura simultánea de fluctuaciones inespecíficas del receptor en células que no responden. Como se mencionó anteriormente, este último es útil para fines de cuantificación, ya que proporciona una referencia interna para dinámicas inespecíficas. En otros sistemas, puede que no sea posible disponer de una referencia interna de este tipo, en cuyo caso los valores de contraste de un marcador de membrana coexpresado proporcionarían un control alternativo.
En resumen, anticipamos que la metodología es aplicable a otros sistemas y se puede implementar para una variedad de propósitos. Por ejemplo, los mismos reporteros podrían utilizarse en otros entornos inflamatorios, como entornos de infección u otros modelos de enfermedad. El repertorio de líneas reporteras de receptores de pez cebra podría ampliarse a otros receptores de señalización, para comprender los mecanismos de señalización o informar sobre la dinámica del ligando in vivo. El enfoque se puede combinar con técnicas de derribo / nocaut para interrogar la base mecanicista de la dinámica observada. Por ejemplo, la perturbación de la expresión del ligando puede indicar la dependencia del ligando para la dinámica del receptor observada. En el futuro, prevemos que el sistema podría perfeccionarse aún más para incorporar la inserción de reporteros. En última instancia, los hallazgos que utilizan esta metodología proporcionarían nuevos conocimientos valiosos más allá de la comunidad del pez cebra, dada la conservación de estos receptores de señalización en mamíferos y el desafío relativo de realizar estos estudios en organismos más grandes.

La migración de leucocitos es de suma importancia para las respuestas inmunes. Las células inmunes son células migratorias prototípicas, que son notablemente capaces de atravesar tejidos y vasos sanguíneos y detectar una serie de señales de guía química para migrar direccionalmente hacia microbios u otras células huésped de importancia. La orientación correcta se basa en el reconocimiento de quimioatrayentes, entre los cuales las quimiocinas representan la categoría1 más prominente. Las quimiocinas son reconocidas por receptores altamente específicos acoplados a la proteína G de siete transmembranas. Tras la unión a quimiocinas, los receptores de quimiocinas cambian la conformación, lo que lleva a la activación de las proteínas G triméricas asociadas y su disociación en subunidades de señalización funcional que promueven cambios citoesqueléticos y migración dirigida1. Secundariamente, los receptores de quimiocinas están fosforilados, y esta modificación conduce a la desensibilización al atrayente, que puede ser seguida por una rápida resensibilización / reciclaje o degradación intracelular y regulación descendente de la superficie celular2. Esta dinámica de los receptores influye en la duración y la dosis de señalización recibida por las células, pero la forma en que afectan el comportamiento de migración de leucocitos ha sido difícil de dilucidar in vivo.
El seguimiento de la dinámica de los receptores en leucocitos vivos en sistemas tradicionales de mamíferos se enfrenta a varios desafíos. Para los estudios en vivo, las fusiones de receptores con proteínas fluorescentes deben expresarse en las células. Esto es un desafío en los leucocitos primarios, particularmente en neutrófilos, y los estudios hasta ahora han utilizado líneas celulares de neutrófilos sustitutos para expresar los receptores de quimiocinas 3,4. La generación de modelos de ratón transgénico, en los que los leucocitos expresan un receptor fluorescente o receptores mutantes con defectos de tráfico informativos 5,6, conlleva una considerable inversión de tiempo y recursos. Incluso en estos casos, la resolución de imágenes y el contraste para la dinámica de los receptores de imágenes en el animal vivo pueden ser limitados y los estudios han utilizado inmunohistoquímica en secciones de tejido fijo5. Dados estos desafíos técnicos, nuestra comprensión de cómo la dinámica de los receptores quimioatrayentes afecta el comportamiento celular en un entorno de tejido vivo es actualmente limitada.
Aquí proporcionamos una metodología para monitorear el tráfico de receptores en neutrófilos de pez cebra. Los peces cebra son genéticamente tratables, como los ratones, pero la transgénesis es relativamente más sencilla mediante el uso de sistemas de transposones eficientes y la manipulación directa decigotos 7. La larva transparente es idealmente susceptible de imágenes. La dinámica del receptor de quimiocinas se ha visualizado en células germinales primordiales y en la línea lateral primordium mediante la expresión de fusiones correspondientes con reporteros fluorescentes 8,9,10. Las larvas de pez cebra están equipadas con neutrófilos maduros que tienen propiedades genéticas y celulares altamente conservadas con respecto a los neutrófilos de mamíferos. La dinámica de señalización subcelular como la dinámica citoesquelética y los reguladores de polaridad se han visualizado en estas células mediante la generación de las líneas transgénicas correspondientes 11,12,13. Recientemente, visualizamos y analizamos funcionalmente la dinámica de los receptores de quimiocinas en neutrófilos durante el curso de las respuestas inflamatorias al daño tisular14. Aquí, describimos la generación de líneas reporteras transgénicas para la señalización de quimiocinas en neutrófilos, la preparación de embriones para imágenes en vivo, un ensayo de heridas para el estudio de la señalización de neutrófilos y el protocolo para la adquisición y análisis de imágenes. También proporcionamos un protocolo lateral para probar las respuestas de los receptores de quimiocinas a los ligandos candidatos, que es útil cuando se trata de establecer patrones de reconocimiento de ligandos en receptores no caracterizados. Estas técnicas se pueden utilizar en combinación con otras manipulaciones genéticas, como la inhibición de la expresión endógena de quimiocinas o la generación de receptores mutantes con tráfico alterado inducido por ligandos, para interrogar cómo la dinámica de señalización específica afecta el comportamiento de los leucocitos in vivo. Las líneas transgénicas que expresan receptores de quimiocinas marcados fluorescentemente también se pueden usar como reporteros para gradientes endógenos de quimiocinas, que de otro modo son difíciles de detectar por tinción directa de anticuerpos. La metodología descrita proporciona un margen para ampliar la generación de reporteros a otros receptores de inmunocopuntía.

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	<tbody>
		<tr>
			<td>1-phenyl-2-thiourea</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P7629-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50mL CellStar Centrifuge Tube</td>
			<td>Grenier Bio-One Limited</td>
			<td>210270</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clark capillary glass</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>30-0020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cleanline Thin Bleach</td>
			<td>Scientific Laboratory Supplies</td>
			<td>CLE0301</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting scope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>SMZ645</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dri Block heater</td>
			<td>Techne</td>
			<td>FDB02AD</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiji</td>
			<td>National Institutes of Health, Bethesda, MD</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps, Jewelers Dumont No. 5</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F6521</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass bottom microwell dishes</td>
			<td>MatTek</td>
			<td>P35G-1.5-14-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass pasteur pipette</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>11795098</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Invitrogen Ambion mMESSAGE mMACHINE SP6 Transcription Kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>10391175</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica SP8 confocal microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low melting point agarose</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>16520-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic stand</td>
			<td>Narishige</td>
			<td>GJ-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MATLAB</td>
			<td>The MathWorks, Inc., Natick, MA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methylene blue</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M9140-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgSO4</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M-2643</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microinjection system</td>
			<td>Parker</td>
			<td>Picospritzer III</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microloader pipette tips</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5242956003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micromanipulator</td>
			<td>Narishige</td>
			<td>M-152</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette Puller</td>
			<td>Sutter Instrument Company</td>
			<td>Flaming/Brown P-97</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope slide</td>
			<td>Thermo-Scientific</td>
			<td>J1800AMNZ</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PerkinElmer Spinning Disk UltraVIEW ERS, Olympus IX81 spinnng disk confocal microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish (120mm)</td>
			<td>Grenier Bio-One Limited</td>
			<td>632180</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenol red</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P0290-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly(A) Tailing Kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM1350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prism</td>
			<td>GraphPad Software</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Small paintbrush</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectral Applied Research LMM5 laser module</td>
			<td></td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical Scalpel Blade No. 23</td>
			<td>Swann-Morton</td>
			<td>233-5528</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tricaine MS222</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E10521-50G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Volocity software</td>
			<td></td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yokogawa CSU10 spinning disc confocal scanner</td>
			<td>Yokogawa</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

live imaging of chemokine receptors in zebrafish neutrophils during wound responses

La guía de leucocitos por gradientes químicos es esencial para las respuestas inmunes. Los neutrófilos son las primeras células en ser reclutadas en sitios de daño tisular donde ejecutan funciones antimicrobianas cruciales. Su tráfico a estos loci está orquestado por varios quimioatrayentes inflamatorios, incluidas las quimiocinas. A nivel molecular, la señalización quimioatrayente está regulada por el tráfico intracelular de los receptores correspondientes. Sin embargo, no está claro cómo los cambios subcelulares en los receptores de quimiocinas afectan la dinámica de migración de leucocitos a nivel celular y tisular. Aquí describimos una metodología para imágenes en vivo y análisis cuantitativo de la dinámica de los receptores de quimiocinas en neutrófilos durante las respuestas inflamatorias al daño tisular. Estas herramientas han revelado que el tráfico diferencial de receptores de quimiocinas en neutrófilos de pez cebra coordina la agrupación y dispersión de neutrófilos en sitios de daño tisular. Esto tiene implicaciones para nuestra comprensión de cómo las respuestas inflamatorias se auto-resuelven. Las herramientas descritas podrían utilizarse para comprender los patrones de migración de neutrófilos en una variedad de entornos fisiológicos y patológicos y la metodología podría ampliarse a otros receptores de señalización.

La herida de la aleta ventral es seguida por una rápida movilización de neutrófilos desde el CHT hacia la aleta ventral y la agrupación en el margen de la herida, dentro de los 30-60 min (Figura 1). Visualizamos la distribución de dos receptores de quimiocinas, Cxcr1 y Cxcr2, que son expresados por los neutrófilos de pez cebra24 y reconocen Cxcl8a y Cxcl8b14, utilizando microscopía confocal de disco giratorio. Generamos dos líneas transgénicas correspondientes, Tg(lyz:Cxcr1-FT) y Tg(lyz:Cxcr2-FT), en las que los neutrófilos expresan un constructo de temporizador fluorescente (FT) del receptor, es decir, una fusión con un tándem de sfGFP y tagRFP (Figura 2 y referencia14). El uso de los dos fluoróforos estaba destinado a permitir el monitoreo de una amplia gama de destinos de receptores y proporcionar estimaciones del tiempo de renovación de proteínas en la membrana plasmática, ya que los receptores recién sintetizados fluorescen en verde y progresivamente se volverían rojos a medida que envejecen 8,14. Sin embargo, se encontró que estos receptores tenían un rápido recambio constitutivo en la membrana plasmática de neutrófilos y que el tiempo de residencia era más corto que el tiempo de maduración de tagRFP, con sfGFP mostrando localización de membrana y tagRFP mostrando localización vesicular en estado estacionario (Video suplementario 1 y ref14). Por lo tanto, nos centramos en la distribución de sfGFP para monitorear la internalización inducida por ligandos en sitios de daño tisular. El patrón de distribución del receptor se cuantificó utilizando la métrica de contraste, que informa las diferencias de intensidad entre los píxeles vecinos. La razón es que cuando la distribución del receptor es membranosa y suave, el valor de contraste es bajo. Cuando la distribución del receptor es vesicular y más punteada, entonces el valor de contraste es alto (Figura 3).
Un método alternativo es cuantificar la relación entre los niveles de receptores (intensidad de sfGFP) sobre los niveles de un marcador de membrana de control, por ejemplo, CFP de membrana (mCFP) (Figura 3). Ambos métodos podrían detectar la internalización del receptor, como lo indica un patrón de distribución de receptores vesiculares más globalmente en la célula (mayor valor de contraste) o niveles más bajos de receptores en la membrana (menor relación sfGFP / mCFP). Sin embargo, la métrica de contraste también pudo detectar la internalización del receptor en grupos de neutrófilos en la herida, en los que la segmentación de la membrana fue menos precisa y no aplicable (Figura 3). Utilizando esta métrica, pudimos cuantificar las diferencias visibles entre el tráfico de Neutrófilos en las heridas de Cxcr1 y Cxcr2 (Figura 4 y Video Complementario 2). Cxcr1-FT internalizado en células localizadas en la herida, mientras que Cxcr2-FT permaneció membranoso en neutrófilos en la herida (Figura 4A-C, Video Suplementario 2 y Video Suplementario 3). La supresión de Cxcl8a y Cxcl8b, mediante tratamiento con morfolino, afectó diferencialmente la internalización de Cxcr1-FT en las heridas (Figura 4C,D). Para validar aún más que Cxcr1-FT responde a Cxcl8a, realizamos ensayos de respuesta de quimiocinas en embriones tempranos. Encontramos que Cxcr1-FT se interiorizó marcadamente en embriones en los que Cxcl8a fue coexpresado (Figura 5). En conjunto, estos resultados indican que los métodos descritos se pueden implementar para medir la internalización del receptor inducida por quimiocinas en neutrófilos y establecer la identidad del ligando que media estos efectos.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61679/61679fig01.jpg"> Figura 1: Migración de neutrófilos a heridas de aleta ventral. (A) (Izquierda) Caricatura de larva de 3 dpf que muestra la ubicación del tejido hematopoyético caudal (CHT), la circulación de venus (VC, azul), la aleta ventral (VF) y el sitio de la herida. (Derecha) Caricatura que representa el área de la herida (W) con neutrófilos que se movilizan desde el CHT y se agrupan en la herida. El plexo de la vena caudal (CVP) del tejido CHT se dibuja en azul. (B) Imagen de campo brillante (izquierda) y proyección confocal (derecha) que muestra la herida de la aleta ventral y la distribución de neutrófilos en larvas de Tg (mpx: GFP) a las 2 h después de la herida. Las líneas discontinuas muestran los contornos vf y CHT. Barra de escala = 25 μm. Caricatura e imagen fluorescente modificada de la ref.14 (http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61679/61679fig01large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61679/61679fig02.jpg"> Figura 2: Imágenes en vivo del tráfico de receptores de quimiocinas en neutrófilos. (A) Constructos utilizados para la expresión transgénica específica de neutrófilos de Cxcr1-FT (Fluorescent Timer) y Cxcr2-FT. Proyecciones confocales de neutrófilos en la cabeza de una larva transgénica de 3 dpf (Tg(lyz:Cxcr1-FT), arriba; Tg(lyz:Cxcr2-FT), abajo) mostrando los canales tRFP (magenta) y sfGFP (verde). Barra de escala = 20 μm. (B) Esquema anatómico de larva de 3 dpf como en la Figura 1A. Debajo de la larva hay esquemas que representan el área de la herida (W) con neutrófilos que se movilizan desde el CHT (parte superior) o realizan quimiotaxis al ingresar a la aleta ventral (abajo). El cuadrado discontinuo indica el área fotografiada en instantáneas a la derecha. (C) Neutrófilos en larvas de Tg(lyz:Cxcr1-FT) (se muestra sfGFP) al movilizarse desde el CHT (paneles superiores) o quimiotaxis hacia la herida (paneles inferiores). Las flechas muestran las mismas celdas a lo largo del tiempo. Los puntos de tiempo en la imagen de la derecha son minutos transcurridos después de la imagen de la izquierda. Barra de escala = 10 μm. (D) Representación esquemática del enfoque experimental para la obtención de imágenes en vivo del tráfico de receptores de quimiocinas. Paneles A-C modificados de la ref.14 (http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61679/61679fig02large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61679/61679fig03.jpg"> Figura 3: Ejemplos de cuantificación de la dinámica de los receptores. Los neutrófilos individuales (azules) o agrupados (verdes) en las heridas o los neutrófilos no movilizados en el CHT (rojo, naranja) fueron segmentados y analizados por diferentes métodos para comparar los resultados. Las mismas celdas de ejemplo mostradas fueron analizadas con dos métodos para relacionar lo que se ve en la imagen con el rango de valores extraídos. (A) La superficie de las celdas de ejemplo seleccionadas se segmentó en función de la definición del contorno en el canal sfGFP. (B) El contraste se calculó a partir de las células de ejemplo que se muestran en A. (C) La membrana de las células de ejemplo seleccionadas se segmentó en función de la definición del contorno en el canal CFP. Se siguió un análisis ratiométrico de sfGFP/CFP. (D) La relación sfGFP/CFP se calculó sobre las celdas de ejemplo que se muestran en C. Las barras de error representan S.E.M. a partir de celdas individuales, en casos de n>1, los valores aquí no se utilizaron para el análisis estadístico sino simplemente para ejemplificar las mediciones obtenidas con los diferentes métodos de cuantificación. Barra de escala = 10 μm. Figura modificada de la ref.14 (http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61679/61679fig03large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61679/61679fig04v2.jpg"> Figura 4: Dinámica diferencial de Cxcr1 y Cxcr2 en respuesta a heridas. (A) Proyección confocal de neutrófilos en larvas Tg(lyz:Cxcr1-FT) o Tg(lyz:Cxcr2-FT) en la herida a los 80 min post-herida (se muestra el canal sfGFP). Barra de escala = 10 μm.  (B) Neutrófilo Cxcr1-FT magnificado (izquierda) y Cxcr2-FT (derecha) en la herida. El receptor verde se muestra en gris. Barra de escala = 5 μm. (C) Contraste normalizado (contraste por neutrófilo individual normalizado al contraste medio de células no movilizadas en el CHT). cxcl8a se refiere a la inyección de un bloqueo de empalme junto con un morfolino que bloquea la traslación para cxcl8a. cxcl8b se refiere a la inyección con un morfolino que bloquea el empalme para cxcl8b. Para Tg(lyz:Cxcr1-FT): n=24 células (CHT), n=47 células (herida) de 8 larvas. Para Tg(lyz:Cxcr1-FT) con morfolinos: n=28 células (Cxcl8a-MO) de 5 larvas, n=16 células (Cxcl8b-MO) de 5 larvas. Para Tg(lyz:Cxcr2-FT): n=10 células (CHT) y n=20 células (herida) de 3 larvas. Los datos se agruparon a partir de larvas independientes adquiridas en 1-5 sesiones de imágenes. Prueba de Kruskal-Wallis con la prueba de comparaciones múltiples de Dunn para Tg(lyz:Cxcr1-FT), prueba de Mann-Whitney de dos colas sin aparear para Tg(lyz:Cxcr2-FT). (D) Proyección confocal de neutrófilos en larvas transgénicas Tg(lyz:Cxcr1-FT) tratadas con cxcl8a morfolino (MO) (izquierda) y cxcl8b MO (derecha) respondiendo a heridas en las aletas (canal sfGFP mostrado en verde). Instantánea tomada en puntos de tiempo de acumulación equivalente de neutrófilos (85 min post-herida en la imagen izquierda y 45 min post-herida en la imagen derecha). Barra de escala = 10 μm. Figura modificada de la ref.14 (http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61679/61679fig04large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61679/61679fig05.jpg"> Figura 5: Ensayo de respuesta a quimiocinas en embriones tempranos. Se inyectaron cortes confocales de barrido láser de embriones gastrulatantes que muestran expresión y distribución de Cxcr1-FT. Se inyectaron 100 pg de ARNm Cxcr1-FT en un óvulo en etapa celular con o sin ARNm Cxcl8a de 150 pg. Los receptores verde y rojo se muestran en canales separados. El marcador CFP de membrana de control (mCFP) se muestra en el canal cian. Barra de escala = 20 μm. Figura modificada de la ref.14 (http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61679/61679fig05large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
Película suplementaria 1: Neutrófilos transgénicos en la cabeza de una larva Tg(lyz:Cxcr1-FT) (izquierda) y Tg(lyz:Cxcr2-FT) (derecha) a 3 dpf. sfGFP(verde), tagRFP (magenta). El intervalo de fotogramas es de 30 segundos y la velocidad de fotogramas es de 5 fps. Barra de escala = 20 μm. El video se origina en ref.14 (http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/). <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61679/Supplementary_Movie1.avi" target="_blank">Haga clic aquí para descargar este video.</a>
Película complementaria 2: Neutrófilos en larvas transgénicas Tg(lyz:Cxcr1-FT) (izquierda) y Tg(lyz:Cxcr2-FT) (derecha) que responden a heridas en las aletas. La película comienza dentro de los 10 minutos posteriores a la herida y dura 60 minutos sfGFP (verde), tagRFP (magenta). El intervalo de fotogramas es de 30 segundos y la velocidad de fotogramas es de 10 fps. CHT = tejido hematopoyético caudal. VF = aleta ventral. Barra de escala = 25 μm. El video se origina en ref.14 (http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/). <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61679/Supplementary_Movie2.avi" target="_blank">Haga clic aquí para descargar este video.</a>
Película suplementaria 3. Ejemplos adicionales de neutrófilos de una larva transgénica Tg(lyz:Cxcr1- FT) herida (larva diferente a la que se muestra en el Video 2), adquirida a mayor resolución, mostrando internalización del receptor (canal sfGFP mostrado en verde) al movilizarse en el CHT o al ingresar y quimiotaxis en la aleta ventral. El intervalo de fotogramas es de 30 segundos y la velocidad de fotogramas es de 2 fps. Barra de escala = 10 μm. El video se origina en ref.14 (http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/). <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61679/Supplementary_Movie3.avi" target="_blank">Haga clic aquí para descargar este video.</a>
Archivo complementario 1: <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61679/Supplementary%20file%201.m" target="_blank">Haga clic aquí para descargar este archivo.</a>
Archivo complementario 2: <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61679/Supplementary%20file%202.m" target="_blank">Haga clic aquí para descargar este archivo.</a>
Archivo complementario 3: <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61679/Supplementary%20file%203.m" target="_blank">Haga clic aquí para descargar este archivo.</a>
Archivo complementario 4: <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61679/Supplementary%20file%204.m" target="_blank">Haga clic aquí para descargar este archivo.</a>

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Live Imaging of Chemokine Receptors in Zebrafish Neutrophils During Wound Responses

Aquí describimos protocolos para realizar imágenes en vivo y análisis cuantitativo de la dinámica de los receptores quimioatrayentes en neutrófilos de pez cebra

Imágenes en vivo de los receptores de quimiocinas en neutrófilos de pez cebra durante las respuestas de la herida

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