Name: live imaging of chemokine receptors in zebrafish neutrophils during wound responses
Uploaded: 2020-12-04T13:30:00
Duration: 6 min 48 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Live Imaging of Chemokine Receptors in Zebrafish Neutrophils During Wound Responses at JoVE.com

Vi tackar Christine Holt och Bill Harris för hjälp med konfokalmikroskopi. Vi tackar Darren Gilmour för de fluorescerande timerryggradskonstruktionerna och Anna Huttenlocher för Tol2-Lyz ryggradsvektor. Vi tackar Steve Renshaw för Tg(mpx:GFP)i114-linjen . Detta arbete stöddes av MRC (MR/L019523/1), Wellcome Trust [204845/Z/16/Z]; Isaac Newton Trust [12.21(a)i] och ett Isaac Newton Trust-bidrag 19.23(n). C.C. stöddes av en MRC DTP-studentskap och delvis av Wellcome Trust [204845 /Z/16/Z]; Isaac Newton Trust [12.21(a)i] bidrag. H.W. stöddes av en MRC DTP Studentship. H.P. stöddes av ett Wellcome Trust-doktorandbidrag (105391/Z/14/Z) och delvis av ett Wellcome Trust [204845/Z/16/Z]; Isaac Newton Trust [12.21(a)i] bidrag och MRC (MR/L019523/1).

<ol>
	<li>Rot, A., von Andrian, U. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemokines+in+innate+and+adaptive+host+defense:+basic+chemokinese+grammar+for+immune+cells.">Chemokines in innate and adaptive host defense: basic chemokinese grammar for immune cells.</a> Annual Review of Immunology. 22, 891-928 (2004).</li><li>Cotton, M., Claing, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=G+protein-coupled+receptors+stimulation+and+the+control+of+cell+migration.">G protein-coupled receptors stimulation and the control of cell migration.</a> Cellular Signalling. 21 (7), 1045-1053 (2009).</li><li>Liu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bidirectional+regulation+of+neutrophil+migration+by+mitogen-activated+protein+kinases.">Bidirectional regulation of neutrophil migration by mitogen-activated protein kinases.</a> Nature Immunology. 13 (5), 457-464 (2012).</li><li>Wen, X., Jin, T., Xu, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+G+Protein-coupled+Receptor-mediated+Chemotaxis+and+its+Signaling+Events+in+Neutrophil-like+HL60+Cells.">Imaging G Protein-coupled Receptor-mediated Chemotaxis and its Signaling Events in Neutrophil-like HL60 Cells.</a> Journal of Visualized Experiments. (115), e54511 (2016).</li><li>Arnon, T. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GRK2-dependent+S1PR1+desensitization+is+required+for+lymphocytes+to+overcome+their+attraction+to+blood.">GRK2-dependent S1PR1 desensitization is required for lymphocytes to overcome their attraction to blood.</a> Science. 333 (6051), 1898-1903 (2011).</li><li>Jung, H., Mithal, D. S., Park, J. E., Miller, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Localized+CCR2+Activation+in+the+Bone+Marrow+Niche+Mobilizes+Monocytes+by+Desensitizing+CXCR4.">Localized CCR2 Activation in the Bone Marrow Niche Mobilizes Monocytes by Desensitizing CXCR4.</a> PloS One. 10 (6), 0128387 (2015).</li><li>Kwan, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Tol2kit:+a+multisite+gateway-based+construction+kit+for+Tol2+transposon+transgenesis+constructs.">The Tol2kit: a multisite gateway-based construction kit for Tol2 transposon transgenesis constructs.</a> Developmental Dynamics: An Official Publication of the American Association of Anatomists. 236 (11), 3088-3099 (2007).</li><li>Don&#224;, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directional+tissue+migration+through+a+self-generated+chemokine+gradient.">Directional tissue migration through a self-generated chemokine gradient.</a> Nature. 503 (7475), 285-289 (2013).</li><li>Venkiteswaran, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+and+dynamics+of+an+endogenous,+self-generated+signaling+gradient+across+a+migrating+tissue.">Generation and dynamics of an endogenous, self-generated signaling gradient across a migrating tissue.</a> Cell. 155 (3), 674-687 (2013).</li><li>Minina, S., Reichman-Fried, M., Raz, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+receptor+internalization,+signaling+level,+and+precise+arrival+at+the+target+in+guided+cell+migration.">Control of receptor internalization, signaling level, and precise arrival at the target in guided cell migration.</a> Current Biology. 17 (13), 1164-1172 (2007).</li><li>Yoo, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+microtubules+in+neutrophil+polarity+and+migration+in+live+zebrafish.">The role of microtubules in neutrophil polarity and migration in live zebrafish.</a> Journal of Cell Science. 125, 5702-5710 (2012).</li><li>Yoo, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+regulation+of+protrusion+and+polarity+by+PI3K+during+neutrophil+motility+in+live+zebrafish.">Differential regulation of protrusion and polarity by PI3K during neutrophil motility in live zebrafish.</a> Developmental Cell. 18 (2), 226-236 (2010).</li><li>Buchan, K. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+transgenic+zebrafish+line+for+in+vivo+visualisation+of+neutrophil+myeloperoxidase.">A transgenic zebrafish line for in vivo visualisation of neutrophil myeloperoxidase.</a> PLoS One. 14 (4), 0215592 (2019).</li><li>Coombs, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemokine+receptor+trafficking+coordinates+neutrophil+clustering+and+dispersal+at+wounds+in+zebrafish.">Chemokine receptor trafficking coordinates neutrophil clustering and dispersal at wounds in zebrafish.</a> Nature Communications. 10 (1), 5166 (2019).</li><li>Hall, C., Flores, M. V., Storm, T., Crosier, K., Crosier, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+zebrafish+lysozyme+C+promoter+drives+myeloid-specific+expression+in+transgenic+fish.">The zebrafish lysozyme C promoter drives myeloid-specific expression in transgenic fish.</a> BMC Developmental Biology. 7, 42 (2007).</li><li>Renshaw, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+transgenic+zebrafish+model+of+neutrophilic+inflammation.">A transgenic zebrafish model of neutrophilic inflammation.</a> Blood. 108 (13), 3976-3978 (2006).</li><li>Khmelinskii, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tandem+fluorescent+protein+timers+for+in+vivo+analysis+of+protein+dynamics.">Tandem fluorescent protein timers for in vivo analysis of protein dynamics.</a> Nature Biotechnology. 30 (7), 708-714 (2012).</li><li>Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The zebrafish book. A guide for the laboratory use of zebrafish (Brachydanio rerio). , (2007).</li><li>Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microinjection+of+Zebrafish+Embryos+to+Analyze+Gene+Function.">Microinjection of Zebrafish Embryos to Analyze Gene Function.</a> Journal of Visualized Experiments. (25), 1115 (2009).</li><li>Detrich, H. W., Zon, L. I., Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Zebrafish: Genetics, Genomics and Informatics. , (2004).</li><li>Le Guyader, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Origins+and+unconventional+behavior+of+neutrophils+in+developing+zebrafish.">Origins and unconventional behavior of neutrophils in developing zebrafish.</a> Blood. 111 (1), 132-141 (2008).</li><li>Chan, T. F., Vese, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Active+contours+without+edges.">Active contours without edges.</a> IEEE Transactions on Image Processing. 10 (2), 266-277 (2001).</li><li>Haralick, R. M., Shanmugam, K., Dinstein, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Textural+features+for+image+Classification.">Textural features for image Classification.</a> IEEE Transactions on Systems, Man, and Cybernetics. SMC-3 (6), 610-621 (1973).</li><li>Deng, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Localized+bacterial+infection+induces+systemic+activation+of+neutrophils+through+Cxcr2+signaling+in+zebrafish.">Localized bacterial infection induces systemic activation of neutrophils through Cxcr2 signaling in zebrafish.</a> Journal of Leukocyte Biology. 93 (5), 761-769 (2013).</li><li>Torraca, V., Mostowy, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+infection:+From+pathogenesis+to+cell+biology.">Zebrafish infection: From pathogenesis to cell biology.</a> Trends in Cell Biology. 28 (2), 143-156 (2018).</li><li>Feng, Y., Santoriello, C., Mione, M., Hurlstone, A., Martin, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+imaging+of+innate+immune+cell+sensing+of+transformed+cells+in+zebrafish+larvae:+parallels+between+tumor+initiation+and+wound+inflammation.">Live imaging of innate immune cell sensing of transformed cells in zebrafish larvae: parallels between tumor initiation and wound inflammation.</a> PLoS Biology. 8 (12), 1000562 (2010).</li><li>Poplimont, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+swarming+in+damaged+tissue+is+orchestrated+by+connexins+and+cooperative+calcium+alarm+signals.">Neutrophil swarming in damaged tissue is orchestrated by connexins and cooperative calcium alarm signals.</a> Current Biology. 30 (14), 2761-2776.e7 (2020).</li><li>Cornet, C., Di Donato, V., Terriente, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combining+Zebrafish+and+CRISPR/Cas9:+Toward+a+more+efficient+drug+discovery+pipeline.">Combining Zebrafish and CRISPR/Cas9: Toward a more efficient drug discovery pipeline.</a> Frontiers in Pharmacology. 9, 703 (2018).</li><li>Kienle, K., L&#228;mmermann, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+swarming:+an+essential+process+of+the+neutrophil+tissue+response.">Neutrophil swarming: an essential process of the neutrophil tissue response.</a> Immunological Reviews. 273 (1), 76-93 (2016).</li><li>Lisse, T. S., Brochu, E. A., Rieger, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Capturing+tissue+repair+in+zebrafish+larvae+with+time-lapse+brightfield+stereomicroscopy.">Capturing tissue repair in zebrafish larvae with time-lapse brightfield stereomicroscopy.</a> Journal of Visualized Experiments. (95), e52654 (2015).</li></ol>

Författarna förklarar ingen intressekonflikt

Den beskrivna metoden möjliggör levande avbildning av receptordynamiken som svar på endogena ligander in situ under ett inflammatoriskt svar på vävnadsskada. Användningen av Cxcr1 / Cxcr2 neutrofila reportrar kan utvidgas till andra fysiologiska inställningar, såsom infektion, tumörmodeller eller andra typer av vävnadsskador 14,25,26,27. Dessutom kan transgena räddningslinjer, där den endogena receptorn undertrycks och räddas av en exogen mutantreceptor, ge användbara verktyg för att dissekera vikten av specifika neutrofila migrationsmönster i immunsvar. Till exempel orsakar Cxcr1-receptormutanter som har nedsatt desensibilisering mer framträdande neutrofila kluster vid inflammatoriska platser14. Denna förstärkning av funktionsfenotyp kan användas för att förstå rollen som neutrofil församling i olika fysiologiska processer, t.ex. sårreparation, infektionssjukdom eller tumörutveckling och komplettera receptor knockdown / knockout-experiment. Metoden ger också en grund för att utöka utbudet av tillgängliga reportrar. Valet av fluorescerande reporter är viktigt att överväga och beror på den biologiska frågan. Vi fann att den konstitutiva omsättningen av dessa kemokinreceptorer i neutrofiler var hög, jämfört med epitelceller, och att reportrar med snabb mognad (t.ex. sfGFP) var skyldiga att rapportera membrannivåer vid steady state och lösa skillnader vid neutrofilstimulering 8,14. Således är membranförhållanden för sfGFP / tagRFP inte tillämpliga för mätning av ligandinducerad internalisering i denna celltyp, men mönstret för tagRFP möjliggör spårning av receptorns intracellulära öden, vilket kan vara användbart i vissa studier. Vi fann också att den mer koncentrerade intracellulära signalen av tagRFP är användbar för screening av enskilda larver. Ett alternativt tillvägagångssätt för att mäta receptornivåer vid plasmamembranet skulle vara att samuttrycka en fluorescerande membranmarkör hos neutrofiler antingen i samma transgen9 eller i en oberoende transgen14. I det förra scenariot skulle transgenen ge ytterligare ett sätt att screena fisken och uttrycksnivåerna skulle vara jämförbara mellan markören och receptorn. Det senare tillvägagångssättet skulle vara mer modulärt, eftersom en zebrafisklinje med en receptorreporter kunde kombineras med olika reporterlinjer. I båda fallen är det värt att notera att membrankvantifiering av receptornivåerna är utmanande i klusterade neutrofiler (se nedan). Slutligen noterar vi att en möjlig förlängning av detta protokoll skulle vara att följa upp den levande avbildningen genom immunohistokemi för mer detaljerade lokaliseringsanalyser.
Tol2-transgenessystemet är väl etablerat7 och lysozym C-promotorn har använts i stor utsträckning för neutrofila uttryck11,15. Transgenesmetoden är därför relativt enkel och uttrycksnivån som uppnås med denna promotor är tillräckligt hög för att ge tillräcklig kontrast för analys av receptordynamik. En möjlig begränsning är att uttrycksnivån inte rekapitulerar endogena receptoruttrycksnivåer. Ny CRISPR-teknik skulle kunna användas för att upprätta knock-in-linjer för receptorer av särskilt intresse28. Dessa tekniker är fortfarande besvärliga och kanske inte garanterar de nödvändiga uttrycksnivåerna för subcellulär avbildning, men deras framgångsrika utveckling skulle vara ett viktigt genombrott för att förstå endogen signaldynamik. Funktionella valideringar är viktiga för att tolka data med transgena receptorkonstruktioner. Till exempel kan ligandigenkänningsanalyser användas för att fastställa att det fluorescerande fusionsproteinet är funktionellt och räddning av knockout-fenotyper kan användas för att fastställa att de transgena neutrofila uttrycksnivåerna är kompatibla med funktionalitet14. Slutligen skulle ett mer direkt sätt att validera receptorfusionen vara att använda en in vitro-funktionell analys med märkt receptor tillsammans med icke-märkta versioner14.
Kvantifieringsmetoden behandlar specifika svårigheter vid exakt membransegmentering hos neutrofiler in vivo. I celler av epitelial natur kan kvantifiering av receptornivåer utföras automatiskt genom normalisering av membranreceptornivåer till en kontrollmarkör, som kan uttryckas i tandem eller separat9. Vi har faktiskt tillämpat ett sådant tillvägagångssätt när vi använder ligandigenkänningsanalysen i gastrulerande embryon14. Neutrofiler genomgår emellertid komplexa, snabba förändringar i cellform in vivo, vilket gör membransegmenteringen svår både i 2D och 3D14. Detta är ännu mer utmanande när neutrofiler kluster, vilket förekommer i många fysiologiska miljöer29. Kontrastmåttet övervinner denna begränsning eftersom det inte kräver membransegmentering utan istället återspeglar det övergripande tillståndet för receptorfördelning i cellen (membranös / slät vs vesikulär / prickig). Det är viktigt att notera att kontrastmått kan påverkas av bildens totala kontrast, så normalisering av enskilda cellvärden till en intern referens krävs för att ta hänsyn till signalens variabilitet i olika embryon / prover. Till exempel använde vi det genomsnittliga cellkontrastvärdet för icke-responsiva neutrofiler i CHT (dvs. neutrofiler som förblir stationära och inte migrerar in i ventralfenan)14. En ytterligare möjlighet skulle vara att normalisera med kontrastvärden för en kontrollmarkör i samma cell. Detta skulle ge en lösning när en intern referens av icke-svarande celler inte är tillgänglig och sannolikt kan lösa finare kvantitativa skillnader i receptordynamik mellan olika tillstånd.
Placeringen av avbildning är en annan variabel att tänka på. Anledningen till att välja det ventrala fensåret här, i motsats till den vanligare svansfensårmodellen 16,30, beror på att sårplatsen ligger i närheten av platsen för neutrofil bostad / migrerande ursprung. Detta påskyndar analysens tidslinje, eftersom det tar relativt lite tid för neutrofiler att komma fram. Dessutom ger det möjlighet att fånga cellbeteende både vid migrationens ursprung (CHT) och målplatsen av intresse (sår). Detta är relevant här, eftersom den rumsliga och tidsmässiga upplösningen som krävs för subcellulär avbildning är svår att kombinera med ett stort synfält eller skanning med flera positioner. Således tillåter den ventrala fensåranalysen spårning av utvecklingen av det migrerande svaret från migrationsursprunget och samtidig infångning av ospecifika receptorfluktuationer i celler som inte svarar. Som nämnts ovan är det senare användbart för kvantifieringsändamål eftersom det ger en intern referens för ospecifik dynamik. I andra system kanske det inte är möjligt att ha en sådan intern referens, i vilket fall kontrastvärdena för en samuttryckt membranmarkör skulle ge en alternativ kontroll.
Sammanfattningsvis räknar vi med att metoden är tillämplig på andra system och kan användas för en mängd olika ändamål. Till exempel kan samma reportrar användas i andra inflammatoriska inställningar, såsom infektionsinställningar eller andra sjukdomsmodeller. Repertoaren av zebrafiskreceptorreporterlinjer kan utvidgas till andra signalreceptorer, för att förstå signalmekanismer eller rapportera liganddynamik in vivo. Tillvägagångssättet kan kombineras med knockdown / knockout-tekniker för att förhöra den mekanistiska grunden för observerad dynamik. Exempelvis kan störning av liganduttryck indikera ligandberoendet för observerad receptordynamik. I framtiden ser vi framför oss att systemet skulle kunna förfinas ytterligare för att inkludera knock-in-insättning av reportrar. I slutändan skulle fynd som använder denna metod ge nya insikter som är värdefulla bortom zebrafisksamhället, med tanke på bevarandet av dessa signalreceptorer hos däggdjur och den relativa utmaningen att genomföra dessa studier i större organismer.

Leukocytmigration är av största vikt för immunsvar. Immunceller är prototypiska migrationsceller, som är anmärkningsvärt kapabla att korsa vävnader och blodkärl och känna av en rad kemiska vägledningssignaler för att migrera riktningsvis mot mikrober eller andra värdceller av betydelse. Korrekt vägledning bygger på erkännande av kemoattractants, bland vilka kemokiner representerar den mest framträdande kategorin1. Kemokiner känns igen av mycket specifika sju-transmembran G-proteinkopplade receptorer. Vid kemokinbindning förändrar kemokinreceptorer konformation vilket leder till aktivering av associerade trimeriska G-proteiner och deras dissociation i funktionella signalunderenheter som främjar cytoskelettförändringar och riktad migration1. För det andra fosforyleras kemokinreceptorer, och denna modifiering leder till desensibilisering för att attrahera, vilket kan följas av snabb återsensibilisering / återvinning eller intracellulär nedbrytning och nedreglering från cellytan2. Dessa receptordynamiker påverkar varaktigheten och dosen av signalering som cellerna mottar, men hur de påverkar leukocytmigrationsbeteendet har varit svårt att belysa in vivo.
Att spåra receptordynamiken i levande leukocyter i traditionella däggdjurssystem står inför flera utmaningar. För levande studier måste receptorfusioner med fluorescerande proteiner uttryckas i cellerna. Detta är utmanande i primära leukocyter, särskilt hos neutrofiler, och studier har hittills använt surrogatneutrofila cellinjer för att uttrycka kemokinreceptorer 3,4. Generering av transgena musmodeller, där leukocyter uttrycker en fluorescerande receptor eller mutantreceptorer med informativa traffickingdefekter 5,6, innebär betydande investeringar i tid och resurser. Även i dessa fall kan bildupplösningen och kontrasten för avbildningsreceptordynamiken hos det levande djuret begränsas och studier har använt immunohistokemi på fasta vävnadssektioner5. Med tanke på dessa tekniska utmaningar är vår förståelse för hur kemoattractant receptordynamik påverkar cellbeteende i en levande vävnadsinställning för närvarande begränsad.
Här tillhandahåller vi en metod för att övervaka receptorhandel med zebrafiskneutrofiler. Zebrafiskar är genetiskt lätthanterliga, som möss, men transgenes är relativt enklare genom användning av effektiva transposonsystem och direkt zygotmanipulation7. Den genomskinliga larven är idealiskt mottaglig för avbildning. Kemokinreceptordynamiken har visualiserats i ursprungliga könsceller och laterallinjen primordium genom uttryck av motsvarande fusioner med fluorescerande reportrar 8,9,10. Zebrafisklarver är utrustade med mogna neutrofiler som har mycket bevarade genetiska och cellulära egenskaper med avseende på däggdjursneutrofiler. Subcellulär signaldynamik såsom cytoskelettdynamik och polaritetsregulatorer har visualiserats i dessa celler genom generering av motsvarande transgena linjer 11,12,13. Nyligen visualiserade och funktionellt analyserade vi kemokinreceptordynamiken hos neutrofiler under inflammatoriska reaktioner på vävnadsskador14. Här beskriver vi genereringen av transgena reporterlinjer för kemokinsignalering i neutrofiler, beredning av embryon för levande avbildning, en såranalys för att studera neutrofilsignalering och protokollet för förvärv och analys av bilder. Vi tillhandahåller också ett sidoprotokoll för att testa kemokinreceptorsvar på kandidatligander, vilket är användbart när man försöker fastställa ligandigenkänningsmönster i okarakteriserade receptorer. Dessa tekniker kan användas i kombination med ytterligare genetiska manipulationer, såsom hämning av endogent kemokinuttryck eller generering av mutantreceptorer med förändrad ligandinducerad handel, för att undersöka hur specifik signaldynamik påverkar leukocytbeteende in vivo. De transgena linjerna som uttrycker fluorescerande märkta kemokinreceptorer kan också användas som reportrar för endogena kemokingradienter, som annars är svåra att detektera genom direkt antikroppsfärgning. Den beskrivna metoden ger utrymme för att utöka genereringen av reportrar till andra immunsignalreceptorer.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>1-phenyl-2-thiourea</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P7629-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50mL CellStar Centrifuge Tube</td>
			<td>Grenier Bio-One Limited</td>
			<td>210270</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clark capillary glass</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>30-0020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cleanline Thin Bleach</td>
			<td>Scientific Laboratory Supplies</td>
			<td>CLE0301</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting scope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>SMZ645</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dri Block heater</td>
			<td>Techne</td>
			<td>FDB02AD</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiji</td>
			<td>National Institutes of Health, Bethesda, MD</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps, Jewelers Dumont No. 5</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F6521</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass bottom microwell dishes</td>
			<td>MatTek</td>
			<td>P35G-1.5-14-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass pasteur pipette</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>11795098</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Invitrogen Ambion mMESSAGE mMACHINE SP6 Transcription Kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>10391175</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica SP8 confocal microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low melting point agarose</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>16520-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic stand</td>
			<td>Narishige</td>
			<td>GJ-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MATLAB</td>
			<td>The MathWorks, Inc., Natick, MA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methylene blue</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M9140-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgSO4</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M-2643</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microinjection system</td>
			<td>Parker</td>
			<td>Picospritzer III</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microloader pipette tips</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5242956003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micromanipulator</td>
			<td>Narishige</td>
			<td>M-152</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette Puller</td>
			<td>Sutter Instrument Company</td>
			<td>Flaming/Brown P-97</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope slide</td>
			<td>Thermo-Scientific</td>
			<td>J1800AMNZ</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PerkinElmer Spinning Disk UltraVIEW ERS, Olympus IX81 spinnng disk confocal microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish (120mm)</td>
			<td>Grenier Bio-One Limited</td>
			<td>632180</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenol red</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P0290-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly(A) Tailing Kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM1350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prism</td>
			<td>GraphPad Software</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Small paintbrush</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectral Applied Research LMM5 laser module</td>
			<td></td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical Scalpel Blade No. 23</td>
			<td>Swann-Morton</td>
			<td>233-5528</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tricaine MS222</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E10521-50G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Volocity software</td>
			<td></td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yokogawa CSU10 spinning disc confocal scanner</td>
			<td>Yokogawa</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

live imaging of chemokine receptors in zebrafish neutrophils during wound responses

Leukocytvägledning genom kemiska gradienter är avgörande för immunsvar. Neutrofiler är de första cellerna som rekryteras till platser för vävnadsskador där de utför viktiga antimikrobiella funktioner. Deras handel med dessa loci orkestreras av flera inflammatoriska kemoattractanter, inklusive kemokiner. På molekylär nivå regleras kemoattractant signalering av den intracellulära handeln med motsvarande receptorer. Det är emellertid fortfarande oklart hur subcellulära förändringar i kemokinreceptorer påverkar leukocytmigrationsdynamiken på cell- och vävnadsnivå. Här beskriver vi en metodik för live imaging och kvantitativ analys av kemokinreceptordynamiken hos neutrofiler under inflammatoriska reaktioner på vävnadsskador. Dessa verktyg har avslöjat att differentiell kemokinreceptorhandel i zebrafiskneutrofiler samordnar neutrofila kluster och spridning på platser för vävnadsskada. Detta har konsekvenser för vår förståelse av hur inflammatoriska svar är självupplösta. De beskrivna verktygen kan användas för att förstå neutrofila migrationsmönster i en mängd olika fysiologiska och patologiska inställningar och metodiken kan utvidgas till andra signalreceptorer.

Ventral fensårning följs av snabb neutrofil mobilisering från CHT till ventralfenan och kluster vid sårmarginalen inom 30-60 min (Figur 1). Vi visualiserade fördelningen av två kemokinreceptorer, Cxcr1 och Cxcr2, som uttrycks av zebrafiskneutrofiler24 och känner igen Cxcl8a och Cxcl8b14, med hjälp av konfokalmikroskopi av spinnskivor. Vi genererade två motsvarande transgena linjer, Tg (lyz: Cxcr1-FT) och Tg (lyz: Cxcr2-FT), där neutrofiler uttrycker en fluorescerande timer (FT) konstruktion av receptorn, dvs en fusion med en tandem av sfGFP och tagRFP (Figur 2 och referens14). Användningen av de två fluoroforerna var avsedd att möjliggöra övervakning av ett brett spektrum av receptoröden och ge uppskattningar av proteinomsättningstiden vid plasmamembranet, eftersom nyligen syntetiserade receptorer skulle fluoresce i grönt och gradvis bli röda när de åldras 8,14. Dessa receptorer visade sig emellertid ha snabb konstitutiv omsättning vid neutrofila plasmamembranet och att uppehållstiden var kortare än mognadstiden för tagRFP, med sfGFP som visade membranlokalisering och tagRFP som visade vesikulär lokalisering vid steady state (kompletterande video 1 och ref14). Därför fokuserade vi på distributionen av sfGFP för att övervaka ligandinducerad internalisering vid vävnadsskador. Mönstret för receptorfördelning kvantifierades med hjälp av kontrastmetriken, som rapporterar skillnader i intensitet mellan angränsande pixlar. Motiveringen är att när receptorfördelningen är membranös och jämn är kontrastvärdet lågt. När receptorfördelningen är vesikulär och mer punktlig är kontrastvärdet högt (figur 3).
En alternativ metod är att kvantifiera förhållandet mellan receptornivåer (sfGFP-intensitet) över nivåerna av en kontrollmembranmarkör, t.ex. membran CFP (mCFP) (figur 3). Båda metoderna kan detektera receptor internalisering, vilket indikeras av mer vesikulärt receptorfördelningsmönster globalt i cellen (högre kontrastvärde) eller lägre receptornivåer vid membranet (lägre sfGFP / mCFP-förhållande). Kontrastmetriken kunde emellertid också detektera receptor internalisering i neutrofila kluster vid såret, där membransegmentering var mindre exakt och inte tillämplig (Figur 3). Med hjälp av detta mått kunde vi kvantifiera synliga skillnader mellan Cxcr1 och Cxcr2 handel med neutrofiler vid sår (Figur 4 och kompletterande video 2). Cxcr1-FT internaliserades i celler belägna vid såret medan Cxcr2-FT förblev membranös hos neutrofiler vid såret (Figur 4A-C, Kompletterande video 2 och kompletterande video 3). Undertryckande av Cxcl8a och Cxcl8b, genom morfolinobehandling, påverkade differentiellt Cxcr1-FT-internalisering vid sår (Figur 4C,D). För att ytterligare validera att Cxcr1-FT svarar på Cxcl8a utförde vi kemokinresponsanalyser i tidiga embryon. Vi fann att Cxcr1-FT markant internaliserades i embryon där Cxcl8a uttrycktes samtidigt (figur 5). Sammantaget indikerar dessa resultat att de beskrivna metoderna kan användas för att mäta kemokininducerad receptor internalisering i neutrofiler och fastställa identiteten hos liganden som förmedlar dessa effekter.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61679/61679fig01.jpg"> Figur 1: Neutrofil migration till ventrala fensår. (A) (Vänster) Tecknad film av 3 dpf larv som visar placeringen av den kaudala hematopoietiska vävnaden (CHT), venuscirkulationen (VC, blå), ventralfenan (VF) och sårplatsen. (Höger) Tecknad film som visar sårets område (W) med neutrofiler som mobiliseras från CHT och kluster vid såret. Cht-vävnadens kaudala venplexus (CVP) dras i blått. (B) Ljus fältbild (vänster) och konfokal projektion (höger) som visar det ventrala fensåret och fördelningen av neutrofiler i Tg (mpx: GFP) larver vid 2 timmar efter sårning. Streckade linjer visar VF- och CHT-konturer. Skalstång = 25 μm. Tecknad och fluorescerande bild modifierad från ref.14 (http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61679/61679fig01large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna figur.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61679/61679fig02.jpg"> Figur 2: Levande avbildning av kemokinreceptorhandel med neutrofiler. A) Konstruktioner som används för neutrofilspecifikt transgent uttryck av Cxcr1-FT (fluorescerande timer) och Cxcr2-FT. Konfokala projektioner av neutrofiler i huvudet på en 3 dpf transgen larv (Tg(lyz:Cxcr1-FT), topp. Tg(lyz:Cxcr2-FT), nederst) som visar kanalerna tRFP (magenta) och sfGFP (gröna). Skala bar = 20 μm. (B) Anatomiskt schema med 3 dpf larv som i figur 1A. Under larven finns scheman som visar sårets område (W) med neutrofiler som mobiliseras från CHT (överst) eller utför kemotaxis när de kommer in i ventralfenan (botten). Streckad kvadrat anger område som avbildats i ögonblicksbilder till höger. (C) Neutrofiler i Tg (lyz: Cxcr1-FT) larver (sfGFP visas) vid mobilisering från CHT (topppaneler) eller kemotaxis mot såret (bottenpaneler). Pilar visar samma celler över tid. Tidpunkter på den högra bilden är minuter som förfluter efter bilden till vänster. Skala bar = 10 μm. (D) Schematisk representation av experimentell metod för levande avbildning av kemokinreceptorhandel. Panelerna A-C modifierade från ref.14 (http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61679/61679fig02large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna figur.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61679/61679fig03.jpg"> Figur 3: Kvantifieringsexempel på receptordynamik. Enstaka (blå) eller grupperade neutrofiler (gröna) vid sår eller icke-mobiliserade neutrofiler i CHT (röd, orange) segmenterades och analyserades med olika metoder för att jämföra resultaten. Samma exempelceller som visades analyserades med två metoder för att relatera det som ses i bilden med det extraherade värdeintervallet. (A) Ytan på de valda exempelcellerna segmenterades baserat på konturdefinition i sfGFP-kanalen. (B) Kontrast beräknades från exempelcellerna som visas i A. (C) Membranet i de utvalda exempelcellerna segmenterades baserat på konturdefinition i CFP-kanalen. Ratiometrisk analys av sfGFP/CFP följde. (D) Förhållandet mellan sfGFP/CFP beräknades på exempelcellerna som visas i C. Felstaplar representerar S.E.M. från enskilda celler, i fall av n>1 användes värden här inte för statistisk analys utan endast för att exemplifiera mätningar som erhållits med de olika kvantifieringsmetoderna. Skalstång = 10 μm. Figuren ändrad från ref.14 (http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61679/61679fig03large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna figur.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61679/61679fig04v2.jpg"> Figur 4: Differentiell dynamik för Cxcr1 och Cxcr2 som svar på sårning. (A) Konfokal projektion av neutrofiler i Tg(lyz:Cxcr1-FT) eller Tg(lyz:Cxcr2-FT)larver vid såret vid 80 min efter sårningen (sfGFP-kanal visas). Skalstång = 10 μm.  (B) Förstorad Cxcr1-FT neutrofil (vänster) och Cxcr2-FT (höger) vid såret. Grön receptor visas i grått. Skalstång = 5 μm. (C) Normaliserad kontrast (kontrast per enskild neutrofil normaliserad till den genomsnittliga kontrasten för icke-mobiliserade celler i CHT). cxcl8a avser injektion av en skarvblockering tillsammans med en översättningsblockerande morfolino för cxcl8a. cxcl8b avser injektion med en skarvblockerande morfolino för cxcl8b. För Tg (lyz: Cxcr1-FT): n = 24 celler (CHT), n = 47 celler (sår) från 8 larver. För Tg(lyz:Cxcr1-FT) med morfolinos: n=28 celler (Cxcl8a-MO) från 5 larver, n=16 celler (Cxcl8b-MO) från 5 larver. För Tg (lyz: Cxcr2-FT): n = 10 celler (CHT) och n = 20 celler (sår) från 3 larver. Data samlades från oberoende larver som förvärvats i 1-5 bildsessioner. Kruskal-Wallis-test med Dunns multipeljämförelsetest för Tg (lyz: Cxcr1-FT), två-tailed unpaired Mann-Whitney-test för Tg (lyz: Cxcr2-FT). (D) Konfokal projektion av neutrofiler i Tg(lyz:Cxcr1-FT) transgena larver behandlade med cxcl8a morpholino (MO) (vänster) och cxcl8b MO (höger) som svarar på fensår (sfGFP-kanal visas i grönt). Ögonblicksbild tagen vid tidpunkter för motsvarande neutrofilackumulering (85 min eftersårning i vänster bild och 45 min eftersårning i höger bild). Skalstång = 10 μm. Figur ändrad från ref.14 (http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61679/61679fig04large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna figur.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61679/61679fig05.jpg"> Figur 5: Kemokinresponsanalys i tidiga embryon. Laserskanning av konfokala skivor av gastrulerande embryon som visar uttryck och distribution av Cxcr1-FT. 100 pg Cxcr1-FT mRNA injicerades i ägg i ett cellstadium med eller utan 150 pg Cxcl8a mRNA. Gröna och röda receptorer visas i separata kanaler. Kontrollmembran CFP-markör (mCFP) visas i cyankanalen. Skalstång = 20 μm. Figuren ändrad från ref.14 (http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61679/61679fig05large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna figur.</a>
Kompletterande film 1: Transgena neutrofiler i huvudet på en Tg(lyz:Cxcr1-FT) (vänster) och Tg(lyz:Cxcr2-FT) (höger) larv vid 3 dpf. sfGFP(grön), tagRFP (magenta). Ramintervallet är 30 sek och bildhastigheten är 5 fps. Skalstång = 20 μm. Videon kommer från ref.14 (http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/). <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61679/Supplementary_Movie1.avi" target="_blank">Klicka här för att ladda ner den här videon.</a>
Kompletterande film 2: Neutrofiler i Tg (lyz: Cxcr1-FT) (vänster) och Tg (lyz: Cxcr2-FT) (höger) transgena larver som svarar på fensår. Filmen börjar inom 10 min efter sårningen och varar 60 min. sfGFP (grön), tagRFP (magenta). Ramintervallet är 30 sek och bildhastigheten är 10 fps. CHT = kaudal hematopoetisk vävnad. VF = ventralfena. Skalstång = 25 μm. Videon kommer från ref.14 (http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/). <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61679/Supplementary_Movie2.avi" target="_blank">Klicka här för att ladda ner den här videon.</a>
Kompletterande film 3. Ytterligare exempel på neutrofiler från en sårad Tg (lyz: Cxcr1- FT) transgen larv (annan larv än den som visas i video 2), förvärvad vid högre upplösning, som visar receptor internalisering (sfGFP-kanal som visas i grönt) vid mobilisering i CHT eller vid inträde och kemotaxis i ventralfenan. Ramintervallet är 30 sekunder och bildhastigheten är 2 fps. Skalstång = 10 μm. Videon kommer från ref.14 (http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/). <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61679/Supplementary_Movie3.avi" target="_blank">Klicka här för att ladda ner den här videon.</a>
Kompletterande fil 1: <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61679/Supplementary%20file%201.m" target="_blank">Klicka här för att ladda ner den här filen.</a>
Kompletterande fil 2: <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61679/Supplementary%20file%202.m" target="_blank">Klicka här för att ladda ner den här filen.</a>
Kompletterande fil 3: <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61679/Supplementary%20file%203.m" target="_blank">Klicka här för att ladda ner den här filen.</a>
Kompletterande fil 4: <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61679/Supplementary%20file%204.m" target="_blank">Klicka här för att ladda ner den här filen.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Live Imaging of Chemokine Receptors in Zebrafish Neutrophils During Wound Responses at JoVE.com

Live Imaging of Chemokine Receptors in Zebrafish Neutrophils During Wound Responses

Här beskriver vi protokoll för att utföra levande avbildning och kvantitativ analys av kemoattractant receptordynamik i zebrafiskneutrofiler

Levande avbildning av kemokinreceptorer i zebrafiskneutrofiler under sårsvar

Leukocyte guidance by chemical gradients is essential for immune responses. Neutrophils are the first cells to be recruited to sites of tissue damage ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

In vivo Imaging of Transgenic Leishmania Parasites in a Live Host

In vivo Imaging of Transgenic Leishmania Parasites in a Live Host

In vivo avbildning av Transgena Leishmania parasiter i ett Live-värd

Distinct species of Leishmania, a protozoan parasite of the family Trypanosomatidae, typically cause different human disease manifestations. The most ...

Retroviral Transduction of T-cell Receptors in Mouse T-cells

Retroviral Transduction av T-cell receptorer i Mus T-celler

T-cell receptors (TCRs) play a central role in the immune system. TCRs on T-cell surfaces can specifically recognize peptide antigens presented by antigen ...

Non-invasive Imaging of Disseminated Candidiasis in Zebrafish Larvae

Icke-invasiv avbildning av disseminerad candidiasis i zebrafisk Larver

Disseminated candidiasis caused by the pathogen Candida albicans is a clinically important problem in hospitalized individuals and is associated with a 30 ...

Visualization of Bacterial Toxin Induced Responses Using Live Cell Fluorescence Microscopy

Visualisering av bakterietoxin Inducerade svar Använda Live Mikroskopi Cell Fluorescens

Bacterial toxins bind to cholesterol in membranes, forming pores that allow for leakage of cellular contents and influx of materials from the external ...

Real-time Imaging of Heterotypic Platelet-neutrophil Interactions on the Activated Endothelium During Vascular Inflammation and Thrombus Formation in Live Mice

Realtid avbildning av heterotypisk blodplättar-neutrofila interaktioner på aktiverat endotel Under vaskulär inflammation och blodproppsbildning i levande möss

Interaction of activated platelets and leukocytes (mainly neutrophils) on the activated endothelium mediates thrombosis and vascular inflammation.1,2 ...

Characterization of Inflammatory Responses During Intranasal Colonization with Streptococcus pneumoniae

Characterization of Inflammatory Responses During Intranasal Colonization with Streptococcus pneumoniae

Karakterisering av inflammatoriska svar under intranasal kolonisering med Streptococcus pneumoniae

Nasopharyngeal colonization by Streptococcus pneumoniae is a prerequisite to invasion to the lungs or bloodstream1. This organism is capable of colonizing ...

Imaging Neutrophils and Monocytes in Mesenteric Veins by Intravital Microscopy on Anaesthetized Mice in Real Time

Imaging Neutrofiler och Monocyter i Mesenteric Veins av Intravital Mikroskopi på sövda möss i realtid

Efficient immune response is dependent on rapid mobilization of blood leukocytes to the site of infection or injury. Investigating leukocyte migration in ...

Measuring Physiological Responses of Drosophila Sensory Neurons to Lipid Pheromones Using Live Calcium Imaging

Measuring Physiological Responses of Drosophila Sensory Neurons to Lipid Pheromones Using Live Calcium Imaging

Att mäta fysiologiska reaktioner av<em&gt; Drosophila</em&gt; Sensoriska neuroner till Lipid Feromoner Använda Live Kalcium Imaging

Unlike mammals, insects such as Drosophila have multiple taste organs. The chemosensory neurons on the legs, proboscis, wings and ovipositor of Drosophila ...

Live Imaging of Antifungal Activity by Human Primary Neutrophils and Monocytes in Response to A. fumigatus

Live Imaging of Antifungal Activity by Human Primary Neutrophils and Monocytes in Response to A. fumigatus

Live avbildning antimykotiskt av humana primära neutrofiler och monocyter som svar på<em&gt; A. fumigatus</em

Aspergillus fumigatus is an opportunistic fungal pathogen causing invasive infections in immunocompromised hosts with a high case-fatality rate. Research ...