Name: single cell analysis of transcriptionally active alleles by single molecule fish
Uploaded: 2020-09-20T14:00:00
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MAM, FS und MGM werden von NIEHS gefördert (Project 4, P42ES027704, PI, Rusyn). MAM, FS, RMM, MGM und PKS werden vom CPRIT-finanzierten GCC Center for Advanced Microscopy and Image Informatics (RP170719) unterstützt. Die Bildgebung wird auch vom Integrated Microscopy Core am Baylor College of Medicine mit Mitteln von NIH (DK56338 und CA125123), CPRIT (RP150578), dem Dan L. Duncan Comprehensive Cancer Center und dem John S. Dunn Gulf Coast Consortium for Chemical Genomics unterstützt.

Um optimale Ergebnisse zu gewährleisten, erfordert der Nasslaborteil dieses Protokolls standard-RNase-freie Vorsichtsmaßnahmen bei allen Schritten. Zum Beispiel wird die Verwendung von gefilterten Pipettenspitzen, sterilen Gefäßen und RNase-freien Puffern dringend empfohlen. Die Verwendung von RNase-Inhibitoren wie Vanadyl-Ribonukleosid-Komplexen wird ebenfalls empfohlen, insbesondere für Ziel-RNAs mit geringer Häufigkeit.
1. Zellkultur und Versuchsaufbau
<ol><li>Halte...

<ol>
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Die beschriebene smFISH-Methodik basiert auf den zuvor veröffentlichten Protokollen7,12,14. In diesem Protokoll erklären wir die kritischen Schritte, die vom Nasslabor (einschließlich Seeding-Dichte, Fixierungszeit, Permeabilisierung und Sondenkonzentration) bis hin zur Bildgebung und Bildanalyse optimiert wurden, um eine vollständige experimentelle Pipeline für Labore bereitzustellen, die an der Durchführung von Einzelzel...

Gentranskription und -translation sind die beiden Hauptprozesse, die am zentralen Dogma der Biologie beteiligt sind und von der DNA-Sequenz über RNA bis hin zu Protein1reichen. In dieser Studie konzentrieren wir uns auf die Produktion von Boten-RNA (mRNA) während der Transkription. Das entstehende RNA-Molekül umfasst sowohl nicht-kodierende Introns als auch kodierende Exons. Introns werden co-transkriptionell ausgespleißt, bevor sich die mRNA zur Translation auf die Ribosomen2,3in das Zytoplasma bewegt.
Traditionell wird die Messung von mRNA in Massenpopulationen von Zellen (Hunderte bis Millionen) mit klassischen Assays wie RT-qPCR oder Northern Blotting durchgeführt. Obwohl diese Methoden sehr leistungsfähig sind, sind sie begrenzt, da sie keine Einblicke in die Zell-zu-Zell-Variation (phänotypische Heterogenität), die Identifizierung der Anzahl der transkriptionell aktiven Allele und, was vielleicht noch wichtiger ist, den Mangel an räumlichen Informationen liefern. In jüngerer Zeit begannen genomweite Technologien, die eine Einzelzell-RNA-Sequenzierung (RNAseq) ermöglichen, die Lücke zwischen bildgebenden Verfahren und Sequenzierung zu schließen4. RNAseq leidet jedoch unter relativ geringen Erkennungseffizienzen und die Verarbeitungsschritte führen zum vollständigen Verlust räumlicher Informationen5. Obwohl Einzelzell-RNAseq Einblicke in die phänotypische Heterogenität einer Population isogener Zellen liefern kann, kann die RNA-Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung (RNA-FISH) eine vollständigere Untersuchung der Zielgenexpression auf räumlicher Ebene und auf Allel-für-Allel-Basis ermöglichen6,7.
RNA FISH ist eine Technik, die den Nachweis und die Lokalisierung von Ziel-RNA-Molekülen in festen Zellen ermöglicht. Im Gegensatz zu früheren, mühsamen Methoden verwendet das derzeit hochmoderne RNA-FISH kommerziell verfügbare Nukleinsäuresonden, die die Ziel-RNA-Sequenzen ergänzen, und diese Sonden hybridisieren durch Watson-Crick-Basenpaarung8zu ihren Zielen. Die frühen In-situ-Hybridisierungstechniken beinhalteten ein ähnliches Protokoll, das 1969 von Gall und Pardue festgelegt wurde, als eine Probe mit Nukleinsäuresonden verarbeitet wurde, die spezifisch zu einer Ziel-RNA9hybridisiert wurden. Ursprünglich wurde der Assay mittels radioaktiver oder kolorimetrischer Detektion durchgeführt; In den 1980er Jahren eröffnete jedoch die Entwicklung von Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierungsprotokollen (FISH) zu DNA FISH und später RNA FISH den Weg zu empfindlicheren Nachweisen und das Potenzial für multiplexing10,11.
Weiterentwicklungen in RNA FISH haben dazu geführt, dass einzelne RNA-Moleküle (smFISH) nachgewiesen und quantifiziert werdenkönnen 12,13. Der direkte Nachweis ist eine Methode, bei der die Sonden selbst mit Fluorophoren markiert werden. Eine Herausforderung bei smFISH besteht darin, dass genügend hybridisierende Sonden/ Target benötigt werden, um die Detektion von fluoreszierenden Signalen als ausgeprägte, beugungsbegrenzte Flecken zu erleichtern. Um dieses Problem zu lösen, kann man einen Sondensatz von kurzen einzelsträngigen DNA-Oligonukleotiden verwenden, die sich komplementär zu verschiedenen Regionen der Ziel-RNA8,12,14ergänzen. Die Bindung mehrerer Sonden erhöht die lokale Fluorophordichte, wodurch die RNA durch Fluoreszenzmikroskopie als eigenständiger, hochintensiver Spot sichtbar wird. Diese Methode ist vorteilhaft, da die Off-Target-Bindung von Oligonukleotiden im Sondensatzpool vom echten RNA-Spot-Signal unterschieden werden kann, indem die Spotgröße und -intensität quantitativ analysiert wird, um zwischen echter Signal- und falscher Oligonukleotidbindung zu unterscheiden, wodurch eine genauere Analyse durch Reduzierung von Fehlalarmen ermöglicht wird12.
Alternative Methoden zum Nachweis von mRNA sind die klassische BAC-klonbasierte Nick-Translation-Methode und das neu entwickelte verzweigte DNA-System. Bei der BAC-geklonten Nick-Translation-Methode wird die zu kennzeichnende DNA enzymatisch genickt und dem exponierten 3'-Ende wird ein neues Nukleotid hinzugefügt. Die Aktivität der DNA-Polymerase I fügt ein markiertes Nukleotid hinzu, was zu der gewünschtenSonde 15,16führt. Die verzweigte DNA-Technik beinhaltet Oligonukleotidsonden, die paarweise zu RNA-Zielen hybridisieren, und diese Sonden werden unter Verwendung mehrerer Signalverstärkungsmoleküle amplifiziert. Diese Methode kann das Signal-Rausch-Verhältnis erheblich verbessern, aber die Verstärkung kann die genaue Quantifizierung verzerren, da fluoreszierende Flecken in Größe und Intensität stark unterschiedlich sein können17.
Als Modellsystem für dieses Protokoll, das im Rahmen des NIEHS Superfund Research Program voll eingesetzt wird, um die Auswirkungen endokrin wirksamer Chemikalien in Galveston Bay / Houston Ship Channel zu quantifizieren, verwendeten wir die Östrogenrezeptor (ER) positive Brustkrebszelllinie MCF-7, die über Nacht mit einem ER-Agonisten, 17β-Estradiol (E2)7,18,19behandelt wurde. E2 reguliert viele ER-Target-Gene, darunter das prototypische ER-Target-Gen GREB17,20,21,22. Das hier beschriebene smFISH-Protokoll verwendet einen Satz von zwei spektral getrennten Sondensätzen, die auf GREB1 abzielen; eine, die zu Exons und die andere zu Introns hybridisiert, was die Messung sowohl von reifer als auch von naszierender RNA7ermöglicht. Wir verwenden dann Epifluoreszenzmikroskopie in Verbindung mit Dekonvolution, um smFISH-markierte Proben abbilden, und wenden dann Bildanalyseroutinen an, um die Anzahl der aktiven Allele und reifen RNAs pro Zelle zu quantifizieren.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:572px;" width="573">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">17&#946; Estradiol</td>
			<td style="width:71px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">E2257</td>
			<td style="width:167px;">CAS Number 50-28-2</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Ambion SSC (20X) Buffer, Rnase-free</td>
			<td style="width:71px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">AM9770</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Corning DMEM with L-Glutamine and 4.5 g/L Glucose</td>
			<td style="width:71px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">MT10017CV</td>
			<td>Manufactured by Invitrogen</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">DAPI</td>
			<td style="width:71px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">D8417</td>
			<td>Without sodium pyruvate</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Dextran Sulfate, 50% Solution Sterile</td>
			<td style="width:71px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">3730-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Dulbecco&#39;s Phosphate Buffered Saline Ca++/Mg++</td>
			<td style="width:71px;">Corning</td>
			<td style="width:119px;">21030CV</td>
			<td>Manufactured by Calbiochem</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Ethanol, 200 Proof (100%)</td>
			<td style="width:71px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">07-678-005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Falcon 24-Well Clear Flat Bottom TC-treated Multiwell Cell Culture Plate</td>
			<td style="width:71px;">Corning</td>
			<td align="right" style="width:119px;">353047</td>
			<td>Manufactured by Decon Laboratories</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Fetal Bovine Serum (FBS), 500 mL</td>
			<td style="width:71px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">50-753-2978</td>
			<td>Manufactured by Gemini Bio Products</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">GE Healthcare DeltaVision LIVE High Resolution Deconvolution Microscope</td>
			<td style="width:71px;">GE Healthcare</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Hyclone Water, Molecular Biology Grade</td>
			<td style="width:71px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">SH3053802</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:216px;">Immersion Oil 1.516</td>
			<td style="width:71px;">GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td align="right" style="width:119px;">29162940</td>
			<td>Manufactured by GE Healthcare Bio-Science</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">L-glutamine Solution</td>
			<td style="width:71px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">MT25005Cl</td>
			<td>Manufactured by Corning</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">MCF-7 cells</td>
			<td style="width:71px;">ATCC</td>
			<td style="width:119px;">HTB-22</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Molecular Grade Formamide</td>
			<td style="width:71px;">Promega</td>
			<td style="width:119px;">PAH5051</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Olympus 60x/1.42 NA Objective</td>
			<td style="width:71px;">Olympus</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Parafilm</td>
			<td style="width:71px;">Bemis Company, Inc.</td>
			<td style="width:119px;">52858-076</td>
			<td>Distributed by VWR</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:216px;">Paraformaldehyde, 16% Solution, EM Grade</td>
			<td style="width:71px;">Electron Microscopy Sciences</td>
			<td align="right" style="width:119px;">15710</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Penicilin-Streptomycin Solution</td>
			<td style="width:71px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">MT3001Cl</td>
			<td>Manufactured by Corning</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Ribonucleoside Vanadyl Complex</td>
			<td style="width:71px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">101229-716</td>
			<td>Manufactured by New England Biosciences</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">RNase Away</td>
			<td style="width:71px;">Ambion</td>
			<td align="right" style="width:119px;">9780</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Sodium pyruvate, 100 mM</td>
			<td style="width:71px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">11-360-070</td>
			<td>Manufactured by Gibco</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Thermo Scientific Glass Coverslips, #1.5</td>
			<td style="width:71px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">12-545-81P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Triton X-100, 100 mL</td>
			<td style="width:71px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">BP151-100</td>
			<td>Manufactured by Fisher BioReagents</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Trypsin-EDTA Solution 0.25%</td>
			<td style="width:71px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">T4049-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Vectashield Antifade Mounting Medium 10 mL</td>
			<td style="width:71px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">NC9265087</td>
			<td>Manufactured by Vector Laboratories</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

single cell analysis of transcriptionally active alleles by single molecule fish

Die Gentranskription ist ein wesentlicher Prozess in der Zellbiologie und ermöglicht es Zellen, interne und externe Hinweise zu interpretieren und darauf zu reagieren. Herkömmliche Massenpopulationsmethoden (Northern Blot, PCR und RNAseq), die den mRNA-Spiegel messen, sind nicht in der Lage, Informationen über die Variation der Reaktionen zwischen Zellen zu liefern. Eine präzise Einzelzell- und allelische Visualisierung und Quantifizierung ist über die Einzelmolekül-RNA-Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung (smFISH) möglich. RNA-FISH wird durch Hybridisierung von Ziel-RNAs mit markierten Oligonukleotidsonden durchgeführt. Diese können in Modalitäten mit mittlerem /hohem Durchsatz abgebildet werden und liefern durch Bildanalyse-Pipelines quantitative Daten sowohl zu ausgereiften als auch zu entstehenden RNAs, alles auf Einzelzellenebene. Die Fixierungs-, Permeabilisierungs-, Hybridisierungs- und Bildgebungsschritte wurden im Labor über viele Jahre mit dem hier beschriebenen Modellsystem optimiert, was zu einer erfolgreichen und robusten Einzelzellanalyse der smFISH-Markierung führt. Das Hauptziel bei der Probenvorbereitung und -verarbeitung ist es, qualitativ hochwertige Bilder zu erzeugen, die sich durch ein hohes Signal-Rausch-Verhältnis auszeichnen, um Fehlalarme zu reduzieren und genauere Daten bereitzustellen. Hier präsentieren wir ein Protokoll, das die Pipeline von der Probenvorbereitung bis zur Datenanalyse in Verbindung mit Vorschlägen und Optimierungsschritten beschreibt, um sie auf bestimmte Proben zuzuschneiden.

Um hormonelle Reaktionen über smFISH zu analysieren, haben wir beispielsweise das Östrogenrezeptormodell (ER) gewählt, das in Hochdurchsatztests verwendet wird, um das Vorhandensein endokrin wirksamer Chemikalien bei Umweltkatastrophen im Rahmen der Teilnahme am NIEHS Superfund Research Program7zu bestimmen. In diesem Experiment wurden adhärente MCF-7-Brustkrebszellen 24 Stunden lang mit dem ER-Agonisten 17β-Estradiol (E2, 10 nM) oder Vehikel (DMSO) behandelt. Spektral getrennte Sondensätze ...

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Single Cell Analysis Of Transcriptionally Active Alleles By Single Molecule FISH

Die Einzelmolekül-RNA-Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung (smFISH) ist eine Methode zur genauen Quantifizierung der Konzentrationen und Lokalisierung spezifischer RNAs auf Einzelzellebene. Hier berichten wir über unsere validierten Laborprotokolle für die Nasstischverarbeitung, Bildgebung und Bildanalyse zur Einzelzellquantifizierung spezifischer RNAs.

Einzelzellanalyse transkriptionell aktiver Allele mittels Einzelmolekül FISH

Gene transcription is an essential process in cell biology, and allows cells to interpret and respond to internal and external cues. Traditional bulk ...

Research

JoVE Journal

Biochemistry

High Precision FRET at Single-molecule Level for Biomolecule Structure Determination

Hochpräzisions-FRET auf Einzelmolekül-Niveau für die Bestimmung der Biomolekülstruktur

A protocol on how to perform high-precision interdye distance measurements using F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) at the single-molecule ...

Forschung

Biochemie

Single-molecule Manipulation of G-quadruplexes by Magnetic Tweezers

Einzelmolekül-Manipulation von G-Quadruplexe von magnetischen Pinzette

Non-canonical nucleic acid secondary structure G-quadruplexes (G4) are involved in diverse cellular processes, such as DNA replication, transcription, RNA ...

Using Three-color Single-molecule FRET to Study the Correlation of Protein Interactions

Verwendung von dreifarbigen Einzelmolekül-Bund, die Korrelation von Protein-Interaktionen zu studieren

Single-molecule F&#246;rster resonance energy transfer (smFRET) has become a widely used biophysical technique to study the dynamics of biomolecules. For ...

Covalent Immobilization of Proteins for the Single Molecule Force Spectroscopy

Kovalente Immobilisierung von Proteinen für die Einzelmolekül-Spektroskopie Kraft

In recent years, atomic force microscopy (AFM) based single molecule force spectroscopy (SMFS) extended our understanding of molecular properties and ...

Proteome-wide Quantification of Labeling Homogeneity at the Single Molecule Level

Proteom-weite Quantifizierung des Benennens Homogenität auf der Ebene des einzelnen Moleküls

Cell proteomes are often characterized using electrophoresis assays, where all species of proteins in the cells are non-specifically labeled with a ...

Single-Molecule Tracking Microscopy - A Tool for Determining the Diffusive States of Cytosolic Molecules

Single-Molecule Tracking-Mikroskopie - Ein Werkzeug zur Bestimmung der diffusiven Zustände von zytosolischen Molekülen

Single-molecule localization microscopy probes the position and motions of individual molecules in living cells with tens of nanometer spatial and ...

Conventional BODIPY Conjugates for Live-Cell Super-Resolution Microscopy and Single-Molecule Tracking

Konventionelle BODIPY-Konjugate für Live-Cell Super-Resolution-Mikroskopie und Single-Molecule Tracking

Single molecule localization microscopy (SMLM) techniques overcome the optical diffraction limit of conventional fluorescence microscopy and can resolve ...

An In Vitro Single-Molecule Imaging Assay for the Analysis of Cap-Dependent Translation Kinetics

An In Vitro Single-Molecule Imaging Assay for the Analysis of Cap-Dependent Translation Kinetics

Ein In Vitro Single-Molecule Imaging Assay zur Analyse von cap-dependent Translation Kinetics

Cap-dependent protein synthesis is the predominant translation pathway in eukaryotic cells. While various biochemical and genetic approaches have allowed ...

Single Molecule Fluorescence Energy Transfer Study of Ribosome Protein Synthesis

Einzelmolekül-Fluoreszenz-Energieübertragungsstudie zur Ribosomenproteinsynthese

The ribosome is a large ribonucleoprotein complex that assembles proteins processively along mRNA templates. The diameter of the ribosome is approximately ...

Single-Molecule Imaging of EWS-FLI1 Condensates Assembling on DNA

Einzelmolekül-Bildgebung von EWS-FLI1-Kondensaten auf DNA

The fusion genes resulting from chromosomal translocation have been found in many solid tumors or leukemia. EWS-FLI1, which belongs to the FUS/EWS/TAF15 ...