Name: single cell analysis of transcriptionally active alleles by single molecule fish
Uploaded: 2020-09-20T14:00:00
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MAM, FS e MGM são financiados pela NIEHS (Projeto 4, P42ES027704, PI, Rusyn). MAM, FS, RMM, MGM e PKS são suportados pelo Centro GCC de Microscopia Avançada e Informática de Imagem (RP170719) financiado pelo CPRIT. A imagem também é apoiada pelo Núcleo Integrado de Microscopia da Baylor College of Medicine com financiamento do NIH (DK56338, e CA125123), CPRIT (RP150578), Dan L. Duncan Comprehensive Cancer Center e John S. Dunn Gulf Coast Consortium for Chemical Genomics.

Para garantir os melhores resultados, a parte de laboratório molhada deste protocolo requer precauções padrão sem RNase em todas as etapas. Por exemplo, o uso de pontas de pipeta filtradas, vasos estéreis e tampões sem RNase é altamente incentivado. O uso de inibidores de RNase, como os complexos ribonucleosídeos vanadyl, também é sugerido, especialmente para RNAs de alvo de baixa abundância.
1. Cultura celular e configuração experimental
<ol><li>Manter as célu...

<ol>
	<li>Russell, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+Expression:+Transcription.">Gene Expression: Transcription.</a> iGenetics: A Mendelian Approach. , 331-352 (2006).</li><li>Darnell, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Variety+in+the+level+of+gene+control+in+eukaryotic+cells.">Variety in the level of gene control in eukaryotic cells.</a> Nature. 297, 365-371 (1982).</li><li>K&#246;hler, A., Hurt, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exporting+RNA+from+the+nucleus+to+the+cytoplasm.">Exporting RNA from the nucleus to the cytoplasm.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 8, 761-773 (2007).</li><li>Kolodziejczyk, A. A., Kim, J. K., Svensson, V., Marioni, J. 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B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bursty+Gene+Expression+in+the+Intact+Mammalian+Liver.">Bursty Gene Expression in the Intact Mammalian Liver.</a> Molecular Cell. 58, 147-156 (2015).</li><li>Stossi, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Estrogen-induced+transcription+at+individual+alleles+is+independent+of+receptor+level+and+active+conformation+but+can+be+modulated+by+coactivators+activity.">Estrogen-induced transcription at individual alleles is independent of receptor level and active conformation but can be modulated by coactivators activity.</a> Nucleic Acids Research. 48, 1800-1810 (2020).</li><li>Coassin, S. R., Orjalo, A. V., Semaan, S. J., Johansson, H. 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M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+ribonucleoside+vanadyl+complex+(RVC)+for+developing+a+multifunctional+tissue+preservative+solution.">Application of ribonucleoside vanadyl complex (RVC) for developing a multifunctional tissue preservative solution.</a> PLoS One. 13, 1-14 (2018).</li><li>Waters, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accuracy+and+precision+in+quantitative+fluorescence+microscopy.">Accuracy and precision in quantitative fluorescence microscopy.</a> Journal of Cell Biology. 185, 1135-1148 (2009).</li><li>Vinegoni, C., Feruglio, P. 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R., Zhuang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+Imaging+with+Multiplexed+Error-Robust+Fluorescence+in+situ+Hybridization+(MERFISH).">RNA Imaging with Multiplexed Error-Robust Fluorescence in situ Hybridization (MERFISH).</a> Methods in Enzymology. 572, 1-49 (2016).</li><li>Shah, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+and+Spatial+Genomics+of+the+Nascent+Transcriptome+by+Intron+seqFISH.">Dynamics and Spatial Genomics of the Nascent Transcriptome by Intron seqFISH.</a> Cell. 174, 363-376 (2018).</li><li>Xia, C., Babcock, H. P., Moffitt, J. R., Zhuang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplexed+detection+of+RNA+using+MERFISH+and+branched+DNA+amplification.">Multiplexed detection of RNA using MERFISH and branched DNA amplification.</a> Scientific Reports. 9, 1-13 (2019).</li><li>Lubeck, E., Coskun, A. F., Zhiyentayev, T., Ahmad, M., Cai, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+in+situ+RNA+profiling+by+sequential+hybridization.">Single-cell in situ RNA profiling by sequential hybridization.</a> Nature Methods. 11, 360-361 (2014).</li><li>Wang, G., Moffitt, J. R., Zhuang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplexed+imaging+of+high-density+libraries+of+RNAs+with+MERFISH+and+expansion+microscopy.">Multiplexed imaging of high-density libraries of RNAs with MERFISH and expansion microscopy.</a> Scientific Reports. 8, (2018).</li><li>Wassie, A. T., Zhao, Y., Boyden, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expansion+microscopy:+principles+and+uses+in+biological+research.">Expansion microscopy: principles and uses in biological research.</a> Nature Methods. 16, 33-41 (2019).</li><li>Zimmerman, S. G., Peters, N. C., Altaras, A. E., Berg, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimized+RNA+ISH,+RNA+FISH+and+protein-RNA+double+labeling+(IF/FISH)+in+Drosophila+ovaries.">Optimized RNA ISH, RNA FISH and protein-RNA double labeling (IF/FISH) in Drosophila ovaries.</a> Nature Protocols. 8, 2158-2179 (2013).</li><li>Kochan, J., Wawro, M., Kasza, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+detection+of+mRNA+and+protein+in+single+cells+using+immunofluorescence-combined+single-molecule+RNA+FISH.">Simultaneous detection of mRNA and protein in single cells using immunofluorescence-combined single-molecule RNA FISH.</a> Biotechniques. 59, 209-221 (2015).</li></ol>

A metodologia smFISH descrita baseia-se nos protocolos publicados anteriormente7,12,14. Neste protocolo, explicamos as etapas críticas que foram otimizadas desde o laboratório molhado (incluindo densidade de semeadura, tempo de fixação, permeabilização e concentração de sondas), até análise de imagens e imagens, fornecendo um pipeline experimental completo para laboratórios interessados em realizar análises celulares...

Transcrição genética e tradução são os dois principais processos envolvidos no dogma central da biologia, indo da sequência de DNA para RNA para proteína1. Neste estudo, focamos na produção de RNA mensageiro (mRNA) durante a transcrição. A molécula nascente de RNA inclui introns não codificadores e exons de codificação. Os introns são co-transcriçãoseticamente emendados antes que o mRNA se mova para o citoplasma para tradução nos ribossomos2,3.
Tradicionalmente, a medição do mRNA é realizada em populações a granel de células (centenas a milhões) com ensaios clássicos como RT-qPCR ou mancha norte. Embora muito poderosos, esses métodos são limitados, pois não fornecem insights sobre a variação célula-celular (heterogeneidade fenotípica), identificação do número de alelos ativos transcricionalmente e, talvez mais importante, falta de informações espaciais. Mais recentemente, as tecnologias de genoma amplo que permitem o sequenciamento de RNA de células únicas (RNAseq) começaram a fazer a ponte entre os métodos de imagem e o sequenciamento4. No entanto, a RNAseq sofre de eficiências de detecção relativamente baixas e as etapas de processamento resultam em perda completa de informações espaciais5. Embora a rnAseq unicelular possa fornecer insights sobre a heterogeneidade fenotípica entre uma população de células isogênicas, a fluorescência de RNA na hibridização situ (RNA-FISH) pode facilitar uma exploração mais completa da expressão genética-alvo no nível espacial, e em uma base de aleelo por alelo6,7.
RNA FISH é uma técnica que permite a detecção e localização de moléculas de RNA alvo em células fixas. Ao contrário dos métodos anteriores e trabalhosos, o RNA-FISH de última geração utiliza sondas de ácido nucleico comercialmente disponíveis que são complementares às sequências de RNA alvo, e essas sondas hibridizam seus alvos pelo emparelhamento base Watson-Crick8. As técnicas iniciais de hibridização in situ envolveram um protocolo semelhante estabelecido por Gall e Pardue em 1969, uma vez que uma amostra foi processada com sondas de ácido nucleico que especificamente hibridizadas para um RNA9alvo . Originalmente, o ensaio foi realizado utilizando-se detecção radioativa ou colorimétrica; no entanto, na década de 1980, o desenvolvimento da fluorescência nos protocolos de hibridização situ (FISH) para o DNA FISH e posteriormente RNA FISH abriu o caminho para uma detecção mais sensível, e o potencial de multiplexação10,11.
Outros desenvolvimentos no RNA FISH levaram à capacidade de detectar e quantificar moléculas de RNA únicas (smFISH)12,13. A detecção direta é um método no qual as próprias sondas são rotuladas com fluoroforos. Um desafio com o smFISH é que há necessidade de sondas/alvos hibridizadores suficientes para facilitar a detecção de sinais fluorescentes como pontos distintos e limitados por difração. Para resolver esse problema, pode-se usar um conjunto de sondas de oligonucleotídeos de DNA de uma única vez complementares a várias regiões do RNA8,12,14. A ligação de múltiplas sondas aumenta a densidade fluorófora local, tornando o RNA visível como um ponto distinto e de alta intensidade por microscopia de fluorescência. Este método é vantajoso porque a ligação fora do alvo de oligonucleotídeos no pool de conjuntos de sondas pode ser distinguida do verdadeiro sinal spot do RNA, analisando quantitativamente o tamanho e intensidade do spot para diferenciar entre o verdadeiro sinal e a ligação espúria de oligonucleotídeos, facilitando assim uma análise mais precisa através da redução de falsos positivos12.
Métodos alternativos para detectar mRNA são o clássico método de tradução nick baseado em clones BAC e o sistema de DNA ramificado mais recentemente desenvolvido. No método clonado por BAC, nick-translation, o DNA a ser rotulado é enzimaticamente cortado e um novo nucleotídeo é adicionado ao final exposto de 3'. A atividade da polimerase de DNA I adiciona um nucleotídeo rotulado resultando na sonda desejada15,16. A técnica de DNA ramificada envolve sondas oligonucleotídeos que hibridizam em pares para alvos de RNA e essas sondas são amplificadas utilizando múltiplas moléculas de amplificação de sinal. Este método pode melhorar significativamente a relação sinal-ruído, mas a amplificação pode distorcer a quantitação precisa, uma vez que as manchas fluorescentes podem ser extremamente diferentes em tamanho e intensidade17.
Como um sistema modelo para este protocolo, que é totalmente empregado como parte da participação do Programa de Pesquisa de Superfundo niehs para quantificar os efeitos de produtos químicos endócrinos disruptivos em Galveston Bay/Houston Ship Channel, usamos o receptor de estrogênio (ER) linha de células de câncer de mama positiva MCF-7 tratada durante a noite com um agonista ER, 17β-estradiol (E2)7,18,19. O E2 regula muitos genes alvos de ER, incluindo o gene prototípico alvo de ER, GREB17,20,21,22. O protocolo smFISH descrito aqui utiliza um conjunto de dois conjuntos de sondas espectralmente separados visando o GREB1; um que hibridize para exons e o outro para introns, permitindo a medição tanto do RNA maduro quanto nascente7. Em seguida, usamos microscopia de epifluorescência juntamente com a desconvolução para amostras rotuladas por SmFISH de imagem e, em seguida, aplicamos rotinas de análise de imagem para quantificar o número de alelos ativos e RNAs maduros por célula.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:572px;" width="573">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">17&#946; Estradiol</td>
			<td style="width:71px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">E2257</td>
			<td style="width:167px;">CAS Number 50-28-2</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Ambion SSC (20X) Buffer, Rnase-free</td>
			<td style="width:71px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">AM9770</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Corning DMEM with L-Glutamine and 4.5 g/L Glucose</td>
			<td style="width:71px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">MT10017CV</td>
			<td>Manufactured by Invitrogen</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">DAPI</td>
			<td style="width:71px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">D8417</td>
			<td>Without sodium pyruvate</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Dextran Sulfate, 50% Solution Sterile</td>
			<td style="width:71px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">3730-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Dulbecco&#39;s Phosphate Buffered Saline Ca++/Mg++</td>
			<td style="width:71px;">Corning</td>
			<td style="width:119px;">21030CV</td>
			<td>Manufactured by Calbiochem</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Ethanol, 200 Proof (100%)</td>
			<td style="width:71px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">07-678-005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Falcon 24-Well Clear Flat Bottom TC-treated Multiwell Cell Culture Plate</td>
			<td style="width:71px;">Corning</td>
			<td align="right" style="width:119px;">353047</td>
			<td>Manufactured by Decon Laboratories</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Fetal Bovine Serum (FBS), 500 mL</td>
			<td style="width:71px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">50-753-2978</td>
			<td>Manufactured by Gemini Bio Products</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">GE Healthcare DeltaVision LIVE High Resolution Deconvolution Microscope</td>
			<td style="width:71px;">GE Healthcare</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Hyclone Water, Molecular Biology Grade</td>
			<td style="width:71px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">SH3053802</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:216px;">Immersion Oil 1.516</td>
			<td style="width:71px;">GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td align="right" style="width:119px;">29162940</td>
			<td>Manufactured by GE Healthcare Bio-Science</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">L-glutamine Solution</td>
			<td style="width:71px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">MT25005Cl</td>
			<td>Manufactured by Corning</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">MCF-7 cells</td>
			<td style="width:71px;">ATCC</td>
			<td style="width:119px;">HTB-22</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Molecular Grade Formamide</td>
			<td style="width:71px;">Promega</td>
			<td style="width:119px;">PAH5051</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Olympus 60x/1.42 NA Objective</td>
			<td style="width:71px;">Olympus</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Parafilm</td>
			<td style="width:71px;">Bemis Company, Inc.</td>
			<td style="width:119px;">52858-076</td>
			<td>Distributed by VWR</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:216px;">Paraformaldehyde, 16% Solution, EM Grade</td>
			<td style="width:71px;">Electron Microscopy Sciences</td>
			<td align="right" style="width:119px;">15710</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Penicilin-Streptomycin Solution</td>
			<td style="width:71px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">MT3001Cl</td>
			<td>Manufactured by Corning</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Ribonucleoside Vanadyl Complex</td>
			<td style="width:71px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">101229-716</td>
			<td>Manufactured by New England Biosciences</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">RNase Away</td>
			<td style="width:71px;">Ambion</td>
			<td align="right" style="width:119px;">9780</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Sodium pyruvate, 100 mM</td>
			<td style="width:71px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">11-360-070</td>
			<td>Manufactured by Gibco</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Thermo Scientific Glass Coverslips, #1.5</td>
			<td style="width:71px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">12-545-81P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Triton X-100, 100 mL</td>
			<td style="width:71px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">BP151-100</td>
			<td>Manufactured by Fisher BioReagents</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Trypsin-EDTA Solution 0.25%</td>
			<td style="width:71px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">T4049-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Vectashield Antifade Mounting Medium 10 mL</td>
			<td style="width:71px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">NC9265087</td>
			<td>Manufactured by Vector Laboratories</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

single cell analysis of transcriptionally active alleles by single molecule fish

A transcrição genética é um processo essencial na biologia celular, e permite que as células interpretem e respondam a pistas internas e externas. Os métodos tradicionais de população em massa (Northern blot, PCR e RNAseq) que medem os níveis de mRNA não têm a capacidade de fornecer informações sobre a variação célula-celular nas respostas. A visualização e quantificação de células únicas precisas e allelic é possível através de fluorescência de RNA de molécula única na hibridização situ (smFISH). O RNA-FISH é realizado por RNAs de alvo hibridizado com sondas oligonucleotídeas rotuladas. Estes podem ser imagens em modalidades de rendimento médio/alto e, por meio de pipelines de análise de imagem, fornecem dados quantitativos tanto sobre RNAs maduras quanto nascentes, todos no nível único celular. A fixação, permeabilização, hibridização e medidas de imagem foram otimizadas em laboratório ao longo de muitos anos usando o sistema de modelo descrito aqui, o que resulta em uma análise celular única bem sucedida e robusta da rotulagem smFISH. O principal objetivo com a preparação e processamento da amostra é produzir imagens de alta qualidade caracterizadas por uma alta relação sinal-ruído para reduzir falsos positivos e fornecer dados mais precisos. Aqui, apresentamos um protocolo descrevendo o pipeline desde a preparação da amostra até a análise de dados em conjunto com sugestões e etapas de otimização para adaptar a amostras específicas.

Para analisar as respostas hormonais via smFISH, como exemplo, optou-se pelo modelo receptor de estrogênio (ER) utilizado em ensaios de alto rendimento para determinar a presença de produtos químicos endócrinos em desastres ambientais no contexto de participação no Programa de Pesquisa de Superfundoniehs 7. Neste experimento, as células cancerígenas de mama mcf-7 aderiram foram tratadas com o agonista ER 17β-estradiol (E2, 10 nM) ou veículo (DMSO) durante 24 horas. Conjuntos de sondas se...

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Single Cell Analysis Of Transcriptionally Active Alleles By Single Molecule FISH

Fluorescência de RNA de molécula única in situ hibridização (smFISH) é um método para quantificar com precisão os níveis e a localização de RNAs específicos no nível único celular. Aqui, relatamos nossos protocolos de laboratório validados para processamento de banco molhado, imagem e análise de imagens para quantificação de células únicas de RNAs específicas.

Análise celular única de alelos ativos transcricionralmente por peixe de molécula única

Gene transcription is an essential process in cell biology, and allows cells to interpret and respond to internal and external cues. Traditional bulk ...

Research

JoVE Journal

Biochemistry

High Precision FRET at Single-molecule Level for Biomolecule Structure Determination

FRET de alta precisão em nível de molécula única para determinação de estrutura de biomoléculas

A protocol on how to perform high-precision interdye distance measurements using F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) at the single-molecule ...

Bioquímica

Single-molecule Manipulation of G-quadruplexes by Magnetic Tweezers

Manipulação de único-molécula de G-quadruplexes por pinça magnética

Non-canonical nucleic acid secondary structure G-quadruplexes (G4) are involved in diverse cellular processes, such as DNA replication, transcription, RNA ...

Using Three-color Single-molecule FRET to Study the Correlation of Protein Interactions

Usando três cores único-molécula FRET para estudar a correlação de interações da proteína

Single-molecule F&#246;rster resonance energy transfer (smFRET) has become a widely used biophysical technique to study the dynamics of biomolecules. For ...

Covalent Immobilization of Proteins for the Single Molecule Force Spectroscopy

Imobilização covalente de proteínas para a espectroscopia de força única molécula

In recent years, atomic force microscopy (AFM) based single molecule force spectroscopy (SMFS) extended our understanding of molecular properties and ...

Proteome-wide Quantification of Labeling Homogeneity at the Single Molecule Level

Quantificação de Proteome-largo de rotulagem homogeneidade a nível da molécula

Cell proteomes are often characterized using electrophoresis assays, where all species of proteins in the cells are non-specifically labeled with a ...

Single-Molecule Tracking Microscopy - A Tool for Determining the Diffusive States of Cytosolic Molecules

Microscopia de seguimento da único-molécula-uma ferramenta para determinar os Estados diffusive de moléculas cytosolic

Single-molecule localization microscopy probes the position and motions of individual molecules in living cells with tens of nanometer spatial and ...

Conventional BODIPY Conjugates for Live-Cell Super-Resolution Microscopy and Single-Molecule Tracking

Conjugados BODIPY convencionais para microscopia de super-resolução de células vivas e rastreamento de moléculas únicas

Single molecule localization microscopy (SMLM) techniques overcome the optical diffraction limit of conventional fluorescence microscopy and can resolve ...

An In Vitro Single-Molecule Imaging Assay for the Analysis of Cap-Dependent Translation Kinetics

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Um ensaio de imagem de molécula única in vitro para a análise de cinética de tradução dependente da tampa

Cap-dependent protein synthesis is the predominant translation pathway in eukaryotic cells. While various biochemical and genetic approaches have allowed ...

Single Molecule Fluorescence Energy Transfer Study of Ribosome Protein Synthesis

Estudo de transferência de energia de fluorescência única da síntese de proteína ribossa

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Single-Molecule Imaging of EWS-FLI1 Condensates Assembling on DNA

Imagem de molécula única de condensados EWS-FLI1 montados no DNA

The fusion genes resulting from chromosomal translocation have been found in many solid tumors or leukemia. EWS-FLI1, which belongs to the FUS/EWS/TAF15 ...