Name: subretinal transplantation of human embryonic stem cell-derived retinal tissue in a feline large animal model
Uploaded: 2021-08-05T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Subretinal Transplantation of Human Embryonic Stem Cell-Derived Retinal Tissue in a Feline Large Animal Model at JoVE.com

Ce travail a été financé par la subvention SBIR accélérée R44-EY027654-01A1 de NEI et la subvention SBIR 3 R44 EY 027654 - 02 S1 (I.O.N., Lineage Cell Therapeutics; Le Dr Petersen-Jones est cochercheur principal). Les auteurs aimeraient remercier Mme Janice Querubin (MSU RATTS) pour son aide à l’anesthésie et aux soins généraux pour les animaux inclus dans cette étude ainsi que pour son aide avec le cadre chirurgical et la préparation / stérilisation des instruments. Les auteurs tiennent à remercier le Dr Paige Winkler pour l’aide apportée à la réception des organoïdes et à leur placement dans les milieux la veille de l’implantation et pour l’aide apportée le jour de l’implantation. Les auteurs sont également reconnaissants à M. Randy Garchar (LCTX) pour l’expédition diligente des organoïdes rétiniens, l’assemblage de l’expéditeur et le téléchargement des enregistrements de température et de stress G après chaque expédition. Ce travail a été réalisé alors que l’auteur Igor Nasonkin était employé par Biotime (maintenant Lineage).

Les procédures ont été menées conformément à la déclaration de l’Association for Research in Vision and Ophthalmology (ARVO) sur l’utilisation des animaux dans la recherche en ophtalmologie et sur la vision. Ils ont également été approuvés par le Michigan State University Institutional Animal Care and Use Committee. Des chats de type sauvage et CrxRdy/+ provenant d’une colonie de chats maintenus à la Michigan State University ont été utilisés dans cette étude. Les animau...

L’implantation de tissu rétinien dérivé de hPSC (organoïdes rétiniens) dans l’espace sous-rétinien est une approche expérimentale prometteuse pour restaurer la vision des maladies dégénératives rétiniennes à un stade avancé causées par la mort des cellules PR (cécité profonde ou terminale). L’approche présentée s’appuie sur une thérapie expérimentale précédemment développée et testée avec succès basée sur la greffe sous-rétinienne d’un morceau de tissu rétinien fœtal humain<sup cla...

Des millions de personnes dans le monde sont touchées par la dégénérescence rétinienne (DR) avec une déficience visuelle ou une cécité associée à la perte des photorécepteurs (PR) de détection de la lumière. La dégénérescence maculaire liée à l’âge (DMLA) est une cause majeure de cécité résultant d’une combinaison de facteurs de risque génétiques et de facteurs environnementaux / liés au mode de vie. En outre, plus de 200 gènes et loci ont été trouvés pour causer la RD héréditaire (IRD)1. La rétinite pigmentaire (RP), l’IRD la plus courante, est génétiquement hétérogène avec plus de 3 000 mutations génétiques dans environ 70 gènes signalés 2,3,4. L’amaurose congénitale de Leber (ACL), qui provoque la cécité dans l’enfance, est également génétiquement hétérogène 5,6. La thérapie d’augmentation génique a été développée et fait l’objet d’essais cliniques pour le traitement d’un petit nombre d’IRDs 3,7. Cependant, une thérapie distincte doit être développée pour le traitement de chaque forme génétique distincte d’IRD et ne traiter ainsi qu’un petit sous-ensemble de patients. De plus, l’augmentation génique repose sur la présence d’une population de photorécepteurs récupérables et n’est donc pas applicable à la dégénérescence avancée.
Il existe donc un besoin clinique urgent et non encore satisfait pour le développement de thérapies abordant et traitant les DR avancés et la cécité profonde à terminale. Au cours des 2 dernières décennies, des implants neuroprothétiques ont été développés et testés sur de grands modèles animaux, tels que le chat, avant l’utilisation humaine 8,9,10,11,12,13,14. De même, au cours des 20 dernières années, des thérapies de remplacement de la rétine utilisant des feuilles de rétine embryonnaire ou même de mammifères matures greffées sous rétine ont été développées 15,16,17,18,19,20,21,22 et même testées avec succès chez des patients RD 23,24,25. Les deux approches utilisent l’idée d’introduire de nouveaux capteurs (photodiodes photovoltaïques en silicium dans le cas des dispositifs neuroprothétiques26,27, et photorécepteurs sains sans mutation organisés en feuilles, dans le cas de l’implantation de feuilles rétiniennes) dans la rétine avec des PR dégénérés. Des études récentes ont étudié l’utilisation d’approches basées sur les cellules souches telles que la transplantation de progéniteurs rétiniens dérivés de cellules souches pluripotentes humaines (hPSC)28,29, de photorécepteurs hPSC 30 et d’organoïdes hPSC-rétiniens31,32,33. Les organoïdes rétiniens permettent la formation de tissu rétinien dans une boîte et la dérivation de feuilles photoréceptrices avec des milliers de RP sans mutation, qui ressemblent à la couche photoréceptrice dans la rétine fœtale humaine en développement 34,35,36,37,38,39,40. La transplantation de tissu rétinien dérivé de hPSC (organoïdes) dans l’espace sous-rétinien de patients atteints de maladies de RD est l’une des nouvelles approches prometteuses de thérapie cellulaire expérimentale, poursuivie par un certain nombre d’équipes 31,32,41,42. Par rapport à la transplantation de la suspension cellulaire (de jeunes photorécepteurs ou de progéniteurs rétiniens), il a été démontré que les feuilles transplantées de photorécepteurs fœtaux entraînaient des améliorations de la vision dans les essais cliniques23,24.
Le protocole présenté ici décrit, en détail, une procédure de transplantation pour l’administration sous-rétinienne des organoïdes rétiniens entiers (plutôt que des bords organoïdes33,41) comme un moyen potentiellement meilleur d’introduire des feuilles rétiniennes intactes avec des PN, d’augmenter la survie du greffon et d’améliorer la préservation de la feuille. Bien que des procédures pour introduire un morceau plat de rétine humaine et des patchs RPE aient été développées43,44,45, la transplantation de greffons 3D plus importants n’a pas été étudiée. Les organoïdes rétiniens dérivés de cellules souches constituent une source inépuisable de feuilles de photorécepteurs pour le développement de technologies de restauration de la vision, sont exempts de restrictions éthiques et sont considérés comme une excellente source de tissu rétinien humain pour les thérapies axées sur le traitement de la RD avancée et de la cécité terminale46. Le développement de méthodes chirurgicales pour l’implantation sous-rétinienne précise d’organoïdes rétiniens avec une lésion minimale de la niche rétinienne de l’hôte (rétine neurale, épithélium pigmentaire rétinien et système vasculaire rétinien et choroïdien) est l’une des étapes critiques pour faire progresser cette thérapie vers des applications cliniques31,32. Les grands modèles animaux tels que les chats, les chiens, les porcs et les singes se sont révélés être de bons modèles pour étudier les méthodes d’administration chirurgicale ainsi que pour démontrer l’innocuité des feuilles de tissu implantées (cellules de l’épithélium pigmentaire rétinien (EPR)) et étudier l’utilisation d’organoïdes 41,44,45,47,48,49,50 . Le grand œil animal a une taille de globe similaire à celle de l’homme ainsi qu’une anatomie similaire, y compris la présence d’une région de forte densité de photorécepteurs, y compris des cônes (la zone centrale), ressemblant à la macula humaine 6,51,52.
Dans ce manuscrit, une technique d’implantation de tissu rétinien dérivé de hPSC (organoïdes) dans l’espace sous-rétinien de grands modèles animaux félins (chats de type sauvage et CrxRdy/+) est décrite, ce qui, avec des résultats d’efficacité prometteurs32,53, jette les bases du développement ultérieur d’une telle thérapie expérimentale vers des applications cliniques pour traiter les conditions de RD.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.22 &#181;m pore syringe filter with PES membrane</td>
			<td>Cameo</td>
			<td>NA</td>
			<td>can be found by various suppliers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>23G subretinal injector with extendable 41 G cannula</td>
			<td>DORC</td>
			<td>1270.EXT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>250 &#181;L hamilton gas tight luer lock syringe</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>NA</td>
			<td>can be found by various suppliers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-0 Silk suture</td>
			<td>Ethicon</td>
			<td>707G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-0/7-0 polyglactin suture</td>
			<td>Ethicon</td>
			<td>J570G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acepromazine maleate 500mg/5mL (Aceproject)</td>
			<td>Henry Schein Animal Health</td>
			<td>NA</td>
			<td>can be found by various suppliers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buprenorphine 0.3 mg/mL</td>
			<td>Par Pharmaceutical</td>
			<td>NA</td>
			<td>can be found by various suppliers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cSLO + SD-OCT</td>
			<td>Heidelberg Engineering</td>
			<td>Spectralis HRA+ OCT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cyclosporine</td>
			<td>Novartis</td>
			<td>NA</td>
			<td>can be found by various suppliers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dexamethasone 2mg/mL (Azium)</td>
			<td>Vetone</td>
			<td>NA</td>
			<td>can be found by various suppliers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Doxycyline 25mg/5mL</td>
			<td>Cipla</td>
			<td>NA</td>
			<td>can be found by various suppliers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fatal Plus solution (pentobarnital solution)</td>
			<td>Vortech</td>
			<td>NA</td>
			<td>can be found by various suppliers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamicin 20mg/2mL</td>
			<td>Hospira</td>
			<td>NA</td>
			<td>can be found by various suppliers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass capillary (Thin-Wall Single-Barrel Standard Borosilicate (Schott Duran) Glass Tubing</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>TW150-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methylprednisolone actetate 40 mg/mL</td>
			<td>Pfizer</td>
			<td>NA</td>
			<td>can be found by various suppliers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OCT medium (Tissue-Tek O.C.T. Compound)</td>
			<td>Sakura</td>
			<td>4583</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Olympic Vac-Pac Size 23</td>
			<td>Natus</td>
			<td>NA</td>
			<td>can be found by various suppliers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde 16% solution</td>
			<td>EMS</td>
			<td>15719</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenylephrine Hydrochloride 10% Ophthalmic Solution</td>
			<td>Akorn</td>
			<td>NA</td>
			<td>can be found by various suppliers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prednisolone 15mg/5mL</td>
			<td>Akorn</td>
			<td>NA</td>
			<td>can be found by various suppliers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Propofol 5000mg/50mL (10 mg/mL) (PropoFlo28)</td>
			<td>Zoetis</td>
			<td>NA</td>
			<td>can be found by various suppliers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RetCam II video fundus camera</td>
			<td>Clarity Medical Systems</td>
			<td>NA</td>
			<td>can be found by various suppliers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triamcinolone 400mg/10 mL (Kenalog-40)</td>
			<td>Bristol -Myers Squibb Company</td>
			<td>NA</td>
			<td>can be found by various suppliers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tropicamide 1% ophthalmic solution</td>
			<td>Akorn</td>
			<td>NA</td>
			<td>can be found by various suppliers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vitrectomy 23G port</td>
			<td>Alcon</td>
			<td>Accurus systems</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vitrectomy machine</td>
			<td>Alcon</td>
			<td>Accurus systems</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vitreo-retinal vertical 80&#176; scissors with squeeze handle</td>
			<td>Frimen</td>
			<td>FT170206T</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

subretinal transplantation of human embryonic stem cell-derived retinal tissue in a feline large animal model

Les conditions dégénératives rétiniennes (DR) associées à la perte de photorécepteurs telles que la dégénérescence maculaire liée à l’âge (DMLA), la rétinite pigmentaire (RP) et l’amaurose congénitale de Leber (ACL) entraînent une perte de vision progressive et débilitante. Il existe un besoin non satisfait de thérapies capables de restaurer la vision une fois que les photorécepteurs ont été perdus. La transplantation de tissu rétinien dérivé de cellules souches pluripotentes humaines (hPSC) (organoïdes) dans l’espace sous-rétinien d’un œil atteint de RD avancée apporte des feuilles de tissu rétinien avec des milliers de photorécepteurs sains sans mutation et a le potentiel de traiter la plupart / toutes les maladies cécitant associées à la dégénérescence des photorécepteurs avec un protocole approuvé. La transplantation de tissu rétinien fœtal dans l’espace sous-rétinien de modèles animaux et de personnes atteintes de RD avancée a été développée avec succès mais ne peut pas être utilisée comme traitement de routine en raison de préoccupations éthiques et d’un approvisionnement tissulaire limité. Les modèles animaux de dégénérescence rétinienne héréditaire (IRD) du grand œil sont précieux pour développer des thérapies de restauration de la vision utilisant des approches chirurgicales avancées pour transplanter des cellules / tissus rétiniens dans l’espace sous-rétinien. Les similitudes dans la taille du globe et la distribution des photorécepteurs (par exemple, la présence d’une région centrale semblable à la macula) et la disponibilité de modèles IRD récapitulant étroitement l’IRD humain faciliteraient la traduction rapide d’un traitement prometteur à la clinique. Une technique chirurgicale de transplantation de tissu rétinien dérivé de hPSC dans l’espace sous-rétinien d’un grand modèle animal permet d’évaluer cette approche prometteuse dans des modèles animaux.

Cette procédure permet l’implantation réussie et reproductible d’organoïdes rétiniens dérivés de hPSC dans l’espace sous-rétinien d’un modèle animal grand œil (démontré ici à l’aide de 2 exemples: chats de type sauvage avec photorécepteurs (PR) sains et chats CrxRdy/+ avec PR et rétine dégénérés). En suivant les étapes indiquées à la figure 1 , préparer et charger les organoïdes rétiniens dérivés de l’hPSC dans la canule en v...

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Subretinal Transplantation of Human Embryonic Stem Cell-Derived Retinal Tissue in a Feline Large Animal Model

Une technique chirurgicale de transplantation de tissu rétinien dérivé de cellules souches pluripotentes humaines (hPSC) dans l’espace sous-rétinien d’un grand modèle animal est présentée ici.

Transplantation sous-rétinienne de tissu rétinien dérivé de cellules souches embryonnaires humaines dans un modèle félin de grand animal

Retinal degenerative (RD) conditions associated with photoreceptor loss such as age-related macular degeneration (AMD), retinitis pigmentosa (RP) and ...

Le protocole actuel montre en détail l’administration sous-rétinienne des organoïdes rétiniens entiers dans un grand modèle animal, visant à développer des approches de thérapie cellulaire pour la dégénérescence rétinienne. Le principal avantage de cette technique est qu’elle permet l’administration d’organoïdes directement au tissu cible, la rétine. La technique vise à traiter les affections dégénératives rétiniennes cécitant avancées, telles que la dégénérescence maculaire liée à l’âge, la rétinite pigmentaire ou l’amaurose congénitale léber.Le Dr Peterson Jones fera la démonstration de la procédure. Pour l’implantation sous-rétinienne des organoïdes, utilisez des ciseaux de ténotomie Stevens pour effectuer une canthotomie latérale de 0,5 à 1 centimètre chez un chat anesthésié à jeun de quatre mois et à jeun de nuit, et placez un spéculum de paupière Barraquer de taille appropriée dans l’incision pour garder les paupières ouvertes avec un assistant chirurgical irriguant régulièrement la cornée avec BSS tout au long de la procédure. Utilisez une pince cornéenne de 0,5 Castroviejo et un petit hémostatique de moustique pour saisir doucement la conjonctive bulbaire à côté du limbe.Placez deux sutures de soie 6-0 dans la conjonctive immédiatement adjacente au limbe aux positions 4 et 8 heures pour maintenir l’œil dans le regard primaire et rétracter la troisième paupière. Serrez les extrémités des sutures avec de petits hémostatiques de moustiques pour faciliter leur manipulation, et placez une autre suture à la position 12 heures au limbe partiellement à travers l’épaisseur du limbe, en prenant soin de ne pas pénétrer dans l’œil. Nouez lâchement la suture, en coupant l’extrémité courte, et placez une suture de hauban dans la conjonctive immédiatement adjacente au limbe à la position 4 heures pour tenir l’œil et le regard primaire.Réfléchissez la conjonctive bulbaire entre 10 et 2 heures et utilisez des ciseaux de ténotomie pour inciser la conjonctive à deux ou trois millimètres du limbe. Affaiblir la conjonctive et nettoyer la capsule de Tenon pour exposer la sclérotique aux deux et 10 heures des orifices de vitrectomie à trois à cinq millimètres du limbe. Utilisez des étriers pour identifier les sites de sclérotomie, en évitant les principaux vaisseaux scléraux qui peuvent être proéminents chez le chat.Planification d’une région de trois millimètres au port d’instruments de 10 heures pour un chirurgien droitier, pré-placer 6-0 ou 7-0 sutures de motif croisé en polyglactine sans attacher aux sites des sclérotomies proposées. Une fois les sutures en place, demandez à l’assistant de saisir les sutures de 12 heures pour aider à maintenir le globe en position et utilisez des pinces Castroviejo de 0,12 millimètre pour maintenir le tissu à côté du site de sclérotomie. Utilise un trocart pour introduire un orifice de vitrectomie de calibre 23 à travers la sclérotique aux positions 2 et 10 heures inclinées vers le nerf optique pour éviter le contact avec la lentille, et utilise des pinces à attacher pour pousser doucement l’orifice d’irrigation afin de déterminer si les pointes peuvent être visualisées dans le vitré.Demandez à l’assistant de placer une lentille de vitrectomie d’irrigation grossissante Machemer sur la cornée pour permettre la visualisation du segment postérieur de l’œil, et un coupe-sonde de vitrectomie de calibre 23 à travers le port de l’instrument pour effectuer une vitrectomie partielle du tronc. Ensuite, introduisez l’aiguille d’une seringue d’un millilitre contenant un millilitre de solution de triamcinolone dans le port de l’instrument et injectez 250 à 500 microlitres de la suspension cristalline. Lorsque la solution a été administrée, faire avancer la sonde de vitrectomie à travers l’orifice de l’instrument pour se rapprocher de la tête du nerf optique, l’orifice étant orienté vers l’extérieur de la surface rétinienne.Utilisez le vide poussé pour aider à détacher la face vitréenne de la rétine, insérez l’injecteur à travers l’orifice de l’instrument vers la surface rétinienne et extrudez l’extrémité de la canule. Appuyez doucement sur l’extrémité de la surface rétinienne et demandez à l’assistant de donner une légère pression rapide sur le piston de la seringue pour démarrer le décollement de la rétine, réduisant ainsi la pression d’injection pour permettre une augmentation lente du décollement de la rétine jusqu’à ce que la taille souhaitée soit atteinte. Utilisez une canule de calibre 41 de l’injecteur pour agrandir légèrement le détachement jusqu’à ce que des ciseaux rétiniens puissent être introduits, et retirez l’orifice scléral de 10 heures.Utilisez ensuite un couteau droit à fente de 2,850 millimètres orienté vers le nerf optique pour éviter de toucher la lentille pour agrandir la sclérotomie à cet endroit. Faites la rétinotomie sur le bleb loin du nerf optique pour éviter d’endommager les fibres nerveuses rétiniennes provenant de la région transplantée, et évitez de couper les principaux vaisseaux rétiniens pour réduire le risque d’hémorragie. Pour implanter les organoïdes, insérez un capillaire en verre chargé d’organoïdes à travers la sclérotomie élargie vers le site de rétinotomie, et utilisez l’extrémité du capillaire pour ouvrir légèrement la rétinotomie afin de permettre l’accès à l’ouverture du bleb sous-rétinien.Demandez à l’assistant d’appuyer à nouveau lentement sur le piston de l’injecteur pour injecter les organoïdes dans le bleb sous-rétinien. BSS doit procéder organoïdes, les organes, et rincer la rétinotomie ouverte. Lorsque tous les organoïdes ont été délivrés, laissez le capillaire en verre en place pendant quelques secondes avant de retirer lentement le capillaire de l’œil, en prenant soin d’éviter toute libération soudaine de liquide.Lorsque le capillaire a été enlevé, fermez la sclérotomie en utilisant la suture pré-placée dans un motif croisé. Demandez à l’assistant de retirer l’orifice de perfusion et d’attacher rapidement la suture de sclérotomie et de fermer la péritomie avec les sutures en polyglactine selon un schéma simple et continu. Fermez la cangotomie latérale avec une suture polyglactine 6-0 et des sutures cutanées en huit pour effectuer le canthus latéral et utilisez de simples sutures cutanées interrompues pour fermer le reste de la plaie.Ensuite, administrez le cocktail de stéroïdes et d’antibiotiques post-chirurgical approprié. La charge organoïde rétinienne pluripotente humaine dérivée de cellules souches peut être confirmée dans la canule en verre du dispositif d’injection et pendant la chirurgie par visualisation directe. La présence des organoïdes dans l’espace sous-rétinien peut être confirmée postopératoirement par un examen ophtalmique et une imagerie du fond d’œil.Avant l’euthanasie, l’ophtalmoscopie confocale au laser à balayage et l’imagerie par tomographie par cohérence optique dans le domaine spectral peuvent également être effectuées pour évaluer la position des organoïdes. Ces techniques peuvent être utilisées pour démontrer la persistance des organoïdes rétiniens dans l’espace sous-rétinien entre la rétine neurale et l’épithélium pigmentaire rétinien de l’œil receveur. Les analyses histologiques et immunohistochimiques peuvent être utilisées pour illustrer la survie des graphes xénogéniques dans l’espace sous-rétinien d’un gros œil chez un animal immunodéprimé.Seules les personnes qualifiées en chirurgie vitréo-rétinienne, telles que les ophtalmologistes vétérinaires formés ou les chirurgiens vitréo-rétiniens familiers avec les différences entre les espèces dans l’œil de chat par rapport à l’œil humain, devraient entreprendre cette procédure. La technique présentée dans cette vidéo devrait être applicable à d’autres grands modèles animaux utilisés pour traduire les techniques chirurgicales vitréo-rétiniennes dans les cliniques.

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