Name: subretinal transplantation of human embryonic stem cell-derived retinal tissue in a feline large animal model
Uploaded: 2021-08-05T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Subretinal Transplantation of Human Embryonic Stem Cell-Derived Retinal Tissue in a Feline Large Animal Model at JoVE.com

Diese Arbeit wurde finanziert durch NEI Fast-Track SBIR Grant R44-EY027654-01A1 und SBIR Grant 3 R44 EY 027654 - 02 S1 (I.O.N., Lineage Cell Therapeutics; Dr. Petersen-Jones ist Co-PI). Die Autoren danken Frau Janice Querubin (MSU RATTS) für ihre Hilfe bei der Anästhesie und der allgemeinen Pflege der in dieser Studie eingeschlossenen Tiere sowie bei der chirurgischen Einstellung und der Vorbereitung/Sterilisation von Instrumenten. Die Autoren bedanken sich bei Dr. Paige Winkler für die Hilfe bei der Entgegennahme der Organoide und deren Platzierung in Medien am Tag vor der Implantation und für die Hilfe am Tag der Implantation. Die Autoren danken auch Herrn Randy Garchar (LCTX) für den gewissenhaften Versand von Netzhaut-Organoiden, die Zusammenstellung des Spediteurs und das Herunterladen von Temperatur- und G-Stress-Aufzeichnungen nach jeder Sendung. Diese Arbeit wurde durchgeführt, als der Autor Igor Nasonkin bei Biotime (jetzt Lineage) angestellt war.

Die Verfahren wurden in Übereinstimmung mit der Erklärung der Association for Research in Vision and Ophthalmology (ARVO) für die Verwendung von Tieren in der Augen- und Sehforschung durchgeführt. Sie wurden auch vom Institutional Animal Care and Use Committee der Michigan State University genehmigt. In dieser Studie wurden Wildtyp- und CrxRdy/+ -Katzen aus einer Katzenkolonie verwendet, die an der Michigan State University gehalten wurde. Die Tiere wurden unter 12 h : 12 h Hell-Dunkel-Zy...

Die Implantation von hPSC-abgeleitetem Netzhautgewebe (Netzhautorganoide) in den subretinalen Raum ist ein vielversprechender experimenteller Ansatz zur Wiederherstellung des Sehvermögens bei degenerativen Netzhauterkrankungen im Spätstadium, die durch den Tod von PR-Zellen (hochgradige oder terminale Blindheit) verursacht werden. Der vorgestellte Ansatz baut auf einer zuvor entwickelten und erfolgreich getesteten experimentellen Therapie auf, die auf der subretinalen Transplantation eines Stücks menschlichen fetalen ...

Millionen von Menschen auf der ganzen Welt sind von Netzhautdegeneration (RD) betroffen, was zu einer Sehbehinderung oder Blindheit führt, die mit dem Verlust der lichtempfindlichen Photorezeptoren (PRs) einhergeht. Die altersbedingte Makuladegeneration (AMD) ist eine der Hauptursachen für Erblindung, die auf eine Kombination aus genetischen Risikofaktoren und Umwelt-/Lebensstilfaktoren zurückzuführen ist. Darüber hinaus wurde festgestellt, dass über 200 Gene und Loci vererbte RD (IRD) verursachen1. Retinitis pigmentosa (RP), die häufigste IRD, ist genetisch heterogen mit mehr als 3.000 genetischen Mutationen in etwa 70 Genen, die berichtet wurden 2,3,4. Die Leber-Kongenitale Amaurose (LCA), die im Kindesalter zur Erblindung führt, ist ebenfalls genetisch heterogen 5,6. Die Genaugmentationstherapie wurde entwickelt und befindet sich in klinischen Studien zur Behandlung einer kleinen Anzahl von IRDs 3,7. Für die Behandlung jeder einzelnen genetischen Form der IRD muss jedoch eine eigene Therapie entwickelt werden, wobei nur eine kleine Untergruppe von Patienten behandelt werden kann. Darüber hinaus beruht die Genaugmentation auf dem Vorhandensein einer Population von rettbaren Photorezeptoren und ist daher bei fortgeschrittener Degeneration nicht anwendbar.
Es besteht daher ein dringender und noch ungedeckter klinischer Bedarf an der Entwicklung von Therapien zur Behandlung fortgeschrittener RDs und hochgradiger Blindheit bis zum Endstadium. In den letzten 2 Jahrzehnten wurden neuroprothetische Implantate entwickelt und in Großtiermodellen, wie z.B. der Katze, vordem Einsatz beim Menschen getestet 8,9,10,11,12,13,14. Ebenso wurden in den letzten 20 Jahren Netzhautersatztherapien entwickelt, bei denen Schichten aus embryonaler oder sogar reifer Säugetiernetzhaut subretinal transplantiert wurden 15,16,17,18,19,20,21,22 und sogar erfolgreich an RD-Patienten getestet wurden 23,24,25. Beide Ansätze nutzen die Idee, neue Sensoren (photovoltaische Silizium-Fotodioden im Falle von Neuroprothesen26,27 und gesunde mutationsfreie Photorezeptoren, die in Schichten organisiert sind, im Falle der Implantation von Netzhautblättern) in die Netzhaut mit degenerierten PRs einzuführen. Neuere Studien haben die Verwendung stammzellbasierter Ansätze untersucht, wie z. B. die Transplantation von aus humanen pluripotenten Stammzellen (hPSC) gewonnenen Netzhautvorläuferzellen28,29, hPSC-Photorezeptoren 30 und hPSC-Netzhautorganoiden31,32,33. Retinale Organoide ermöglichen die Bildung von Netzhautgewebe in einer Schale und die Ableitung von Photorezeptorblättern mit Tausenden von mutationsfreien PRs, die der Photorezeptorschicht in der sich entwickelnden menschlichen fetalen Netzhaut ähneln 34,35,36,37,38,39,40 . Die Transplantation von hPSC-abgeleitetem Netzhautgewebe (Organoide) in den subretinalen Raum von Patienten mit RD-Erkrankungen ist einer der neuen und vielversprechenden Ansätze für die Zelltherapie, der von einer Reihe von Teams verfolgtwird 31,32,41,42. Im Vergleich zur Transplantation der Zellsuspension (von jungen Photorezeptoren oder retinalen Vorläuferzellen) konnte in klinischen Studien gezeigt werden, dass transplantierte Schichten fetaler Photorezeptoren zu einer Verbesserung des Sehvermögens führen23,24.
Das hier vorgestellte Protokoll beschreibt detailliert ein Transplantationsverfahren zur subretinalen Verabreichung der gesamten Netzhaut-Organoide (anstelle von Organoid-Rändern33,41) als eine potenziell bessere Möglichkeit, intakte Netzhautblätter mit PRs einzuführen, um das Transplantatüberleben zu erhöhen und die Blattkonservierung zu verbessern. Obwohl Verfahren zum Einbringen eines flachen Stücks menschlicher Netzhaut und auch RPE-Pflaster entwickelt wurden43,44,45, wurde die Transplantation größerer 3D-Transplantate nicht untersucht. Aus Stammzellen gewonnene Netzhautorganoide bieten eine unerschöpfliche Quelle von Photorezeptorblättern für die Entwicklung von Technologien zur Wiederherstellung des Sehvermögens, sind frei von ethischen Einschränkungen und gelten als hervorragende Quelle für menschliches Netzhautgewebe für Therapien, die sich auf die Behandlung von fortgeschrittener RD und terminaler Blindheit konzentrieren46. Die Entwicklung chirurgischer Methoden zur präzisen subretinalen Implantation von retinalen Organoiden mit minimaler Schädigung der retinalen Wirtsnische (neuronale Netzhaut, retinales Pigmentepithel sowie retinale und choroidale Gefäße) ist einer der entscheidenden Schritte, um eine solche Therapie in Richtung klinischer Anwendungen voranzutreiben31,32. Großtiermodelle wie Katzen, Hunde, Schweine und Affen haben sich als gute Modelle erwiesen, um chirurgische Verabreichungsmethoden zu untersuchen sowie die Sicherheit von implantierten Gewebeschichten (retinale Pigmentepithelzellen (RPE) zu demonstrieren und die Verwendung von Organoiden zu untersuchen 41,44,45,47,48,49,50. Das große Tierauge hat eine ähnliche Kugelgröße wie der Mensch sowie eine ähnliche Anatomie, einschließlich des Vorhandenseins einer Region mit hoher Photorezeptordichte, einschließlich Zapfen (der Area centralis), die der menschlichen Makula ähnelt 6,51,52.
In diesem Manuskript wird eine Technik zur Implantation von hPSC-abgeleitetem Netzhautgewebe (Organoiden) in den subretinalen Raum von felinen Großtiermodellen (sowohl Wildtyp- als auch CrxRdy/+-Katzen) beschrieben, die zusammen mit vielversprechenden Wirksamkeitsergebnissen32,53 eine Grundlage für die weitere Entwicklung einer solchen Prüftherapie in Richtung klinischer Anwendungen zur Behandlung von RD-Erkrankungen bildet.

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	<tbody>
		<tr>
			<td>0.22 &#181;m pore syringe filter with PES membrane</td>
			<td>Cameo</td>
			<td>NA</td>
			<td>can be found by various suppliers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>23G subretinal injector with extendable 41 G cannula</td>
			<td>DORC</td>
			<td>1270.EXT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>250 &#181;L hamilton gas tight luer lock syringe</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>NA</td>
			<td>can be found by various suppliers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-0 Silk suture</td>
			<td>Ethicon</td>
			<td>707G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-0/7-0 polyglactin suture</td>
			<td>Ethicon</td>
			<td>J570G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acepromazine maleate 500mg/5mL (Aceproject)</td>
			<td>Henry Schein Animal Health</td>
			<td>NA</td>
			<td>can be found by various suppliers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buprenorphine 0.3 mg/mL</td>
			<td>Par Pharmaceutical</td>
			<td>NA</td>
			<td>can be found by various suppliers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cSLO + SD-OCT</td>
			<td>Heidelberg Engineering</td>
			<td>Spectralis HRA+ OCT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cyclosporine</td>
			<td>Novartis</td>
			<td>NA</td>
			<td>can be found by various suppliers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dexamethasone 2mg/mL (Azium)</td>
			<td>Vetone</td>
			<td>NA</td>
			<td>can be found by various suppliers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Doxycyline 25mg/5mL</td>
			<td>Cipla</td>
			<td>NA</td>
			<td>can be found by various suppliers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fatal Plus solution (pentobarnital solution)</td>
			<td>Vortech</td>
			<td>NA</td>
			<td>can be found by various suppliers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamicin 20mg/2mL</td>
			<td>Hospira</td>
			<td>NA</td>
			<td>can be found by various suppliers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass capillary (Thin-Wall Single-Barrel Standard Borosilicate (Schott Duran) Glass Tubing</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>TW150-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methylprednisolone actetate 40 mg/mL</td>
			<td>Pfizer</td>
			<td>NA</td>
			<td>can be found by various suppliers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OCT medium (Tissue-Tek O.C.T. Compound)</td>
			<td>Sakura</td>
			<td>4583</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Olympic Vac-Pac Size 23</td>
			<td>Natus</td>
			<td>NA</td>
			<td>can be found by various suppliers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde 16% solution</td>
			<td>EMS</td>
			<td>15719</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenylephrine Hydrochloride 10% Ophthalmic Solution</td>
			<td>Akorn</td>
			<td>NA</td>
			<td>can be found by various suppliers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prednisolone 15mg/5mL</td>
			<td>Akorn</td>
			<td>NA</td>
			<td>can be found by various suppliers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Propofol 5000mg/50mL (10 mg/mL) (PropoFlo28)</td>
			<td>Zoetis</td>
			<td>NA</td>
			<td>can be found by various suppliers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RetCam II video fundus camera</td>
			<td>Clarity Medical Systems</td>
			<td>NA</td>
			<td>can be found by various suppliers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triamcinolone 400mg/10 mL (Kenalog-40)</td>
			<td>Bristol -Myers Squibb Company</td>
			<td>NA</td>
			<td>can be found by various suppliers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tropicamide 1% ophthalmic solution</td>
			<td>Akorn</td>
			<td>NA</td>
			<td>can be found by various suppliers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vitrectomy 23G port</td>
			<td>Alcon</td>
			<td>Accurus systems</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vitrectomy machine</td>
			<td>Alcon</td>
			<td>Accurus systems</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vitreo-retinal vertical 80&#176; scissors with squeeze handle</td>
			<td>Frimen</td>
			<td>FT170206T</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
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subretinal transplantation of human embryonic stem cell-derived retinal tissue in a feline large animal model

Degenerative (RD) Netzhauterkrankungen, die mit dem Verlust von Photorezeptoren einhergehen, wie z. B. altersbedingte Makuladegeneration (AMD), Retinitis pigmentosa (RP) und Leber-kongenitale Amaurose (LCA), verursachen einen fortschreitenden und schwächenden Sehverlust. Es besteht ein ungedeckter Bedarf an Therapien, die das Sehvermögen wiederherstellen können, wenn die Photorezeptoren verloren gegangen sind. Die Transplantation von aus humanen pluripotenten Stammzellen (hPSC) gewonnenem Netzhautgewebe (Organoiden) in den subretinalen Raum eines Auges mit fortgeschrittener RD bringt Netzhautgewebeblätter mit Tausenden von gesunden, mutationsfreien Photorezeptoren und hat das Potenzial, die meisten/alle Erblindungskrankheiten, die mit Photorezeptordegeneration verbunden sind, mit einem zugelassenen Protokoll zu behandeln. Die Transplantation von fetalem Netzhautgewebe in den subretinalen Raum von Tiermodellen und Menschen mit fortgeschrittener RD wurde erfolgreich entwickelt, kann aber aufgrund ethischer Bedenken und begrenzter Gewebeversorgung nicht als Routinetherapie eingesetzt werden. Tiermodelle für große, am Auge vererbte Netzhautdegeneration (IRD) sind wertvoll für die Entwicklung von Therapien zur Wiederherstellung des Sehvermögens, bei denen fortschrittliche chirurgische Ansätze zur Transplantation von Netzhautzellen/-gewebe in den subretinalen Raum verwendet werden. Die Ähnlichkeiten in der Größe des Bulbus und der Verteilung der Photorezeptoren (z. B. das Vorhandensein einer Makula-ähnlichen Region Area centralis) und die Verfügbarkeit von IRD-Modellen, die die menschliche IRD genau rekapitulieren, würden eine schnelle Translation einer vielversprechenden Therapie in die Klinik erleichtern. Hier wird eine chirurgische Technik zur Transplantation von hPSC-abgeleitetem Netzhautgewebe in den subretinalen Raum eines Großtiermodells vorgestellt, die es ermöglicht, diesen vielversprechenden Ansatz in Tiermodellen zu bewerten.

Dieses Verfahren ermöglicht die erfolgreiche und reproduzierbare Implantation von hPSC-abgeleiteten Netzhautorganoiden in den subretinalen Raum eines Tiermodells mit großen Augen (hier demonstriert anhand von 2 Beispielen: Wildtyp-Katzen mit gesunden Photorezeptoren (PRs) und CrxRdy/+ -Katzen mit degenerierenden PRs und Netzhaut). Bereiten Sie die aus hPSC gewonnenen Netzhautorganoide mit den in Abbildung 1 angegebenen Schritten vor und laden Sie sie in die Bor...

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Subretinal Transplantation of Human Embryonic Stem Cell-Derived Retinal Tissue in a Feline Large Animal Model

Hier wird eine Operationstechnik zur Transplantation von aus humanen pluripotenten Stammzellen (hPSC) gewonnenem Netzhautgewebe in den subretinalen Raum eines Großtiermodells vorgestellt.

Subretinale Transplantation von menschlichem embryonalem Stammzellgewebe in einem katzenartigen Großtiermodell

Retinal degenerative (RD) conditions associated with photoreceptor loss such as age-related macular degeneration (AMD), retinitis pigmentosa (RP) and ...

Das aktuelle Protokoll zeigt detailliert die subretinale Verabreichung der gesamten Netzhaut-Organoide in einem Großtiermodell mit dem Ziel, zelltherapeutische Ansätze für die Netzhautdegeneration zu entwickeln. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie die Abgabe von Organoiden direkt an das Zielgewebe, die Netzhaut, ermöglicht. Die Technik zielt darauf ab, fortgeschrittene erblindende degenerative Netzhauterkrankungen wie altersbedingte Makuladegeneration, Retinitis pigmentosa oder angeborene Leber-Amaurose zu behandeln.Das Verfahren wird von Dr. Peterson Jones demonstriert. Verwenden Sie für die subretinale Implantation der Organoide eine Stevens-Tenotomieschere, um eine 0,5 bis 1 Zentimeter lange laterale Kanthotomie bei einer vier Monate alten, über Nacht nüchternen anästhesierten Katze durchzuführen, und legen Sie ein Barraquer-Augenlidspekulum in angemessener Größe in den Einschnitt, um die Augenlider offen zu halten, wobei ein chirurgischer Assistent die Hornhaut während des gesamten Eingriffs regelmäßig mit BSS spült. Verwenden Sie 0,5 Castroviejo Hornhautbindezangen und ein kleines Mückenhämostat, um die bulbäre Bindehaut neben dem Limbus sanft zu greifen.Platzieren Sie zwei 6-0-Seidennähte in der Bindehaut unmittelbar neben dem Limbus in der 4- und 8-Uhr-Position, um das Auge im primären Blick zu halten und das dritte Augenlid zurückzuziehen. Klemmen Sie die Enden der Nähte mit kleinen Moskito-Hämostaten ein, um ihre Manipulation zu erleichtern, und platzieren Sie eine weitere Naht an der 12-Uhr-Position am Limbus teilweise durch die Dicke des Limbus, wobei Sie darauf achten, nicht in das Auge einzudringen. Verknoten Sie die Naht locker, schneiden Sie das Ende kurz ab und platzieren Sie eine Haltenaht in der Bindehaut unmittelbar neben dem Limbus in der 4-Uhr-Position, um das Auge und den primären Blick zu halten.Reflektieren Sie die bulbäre Bindehaut zwischen 10 und 2 Uhr und schneiden Sie die Bindehaut mit einer Tenotomieschere zwei bis drei Millimeter vom Limbus entfernt ein. Untergraben Sie die Bindehaut und reinigen Sie die Tenon-Kapsel, um die Sklera an den Zwei- und 10-Uhr-Vitrektomiestellen drei bis fünf Millimeter vom Limbus entfernt freizulegen. Verwenden Sie Messschieber, um die Stellen für die Sklerotomie zu identifizieren, und vermeiden Sie die großen Skleragefäße, die bei der Katze hervorstechen können.Planen Sie einen Bereich von drei Millimetern am 10-Uhr-Instrumentenanschluss für einen rechtshändigen Chirurgen, platzieren Sie 6-0- oder 7-0-Polyglactin-Kreuzmusternähte vor, ohne an den Stellen der vorgeschlagenen Sklerotomien zu binden. Sobald die Nähte angebracht sind, lassen Sie den Assistenten die 12-Uhr-Stehnähte greifen, um den Globus in Position zu halten, und verwenden Sie eine 0,12-Millimeter-Castroviejo-Pinzette, um das Gewebe neben der Sklerotomiestelle zu halten. Verwendet einen Trokar, um einen 23-Gauge-Vitrektomieanschluss durch die Sklera sowohl an der 2- als auch an der 10-Uhr-Position einzuführen, die zum Sehnerv hin abgewinkelt ist, um einen Kontakt mit der Linse zu vermeiden, und verwendet eine Bindezange, um den Spülanschluss vorsichtig zu drücken, um festzustellen, ob die Spitzen im Glaskörper sichtbar sind.Lassen Sie den Assistenten eine Machemer-Lupenlinse auf die Hornhaut setzen, um die Visualisierung des hinteren Augenabschnitts zu ermöglichen, und einen 23-Gauge-Vitrektomie-Sondenschneider durch den Instrumentenanschluss, um eine partielle Vitrektomie durchzuführen. Führen Sie dann die Nadel einer Ein-Milliliter-Spritze mit einem Milliliter Triamcinolon-Lösung in den Instrumentenanschluss ein und injizieren Sie 250 bis 500 Mikroliter der Kristallsuspension. Wenn die Lösung verabreicht wurde, schieben Sie die Vitrektomiesonde durch den Instrumentenanschluss in die Nähe des Sehnervenkopfes, wobei der Anschluss von der Netzhautoberfläche abgewandt ist.Verwenden Sie Hochvakuum, um das vitreale Gesicht von der Netzhaut zu lösen, führen Sie den Injektor durch den Instrumentenanschluss in Richtung der Netzhautoberfläche ein und extrudieren Sie die Kanülenspitze. Drücken Sie vorsichtig auf die Spitze der Netzhautoberfläche und lassen Sie den Assistenten einen leichten schnellen Druck auf den Spritzenkolben geben, um die Netzhautablösung zu starten, wobei der Injektionsdruck reduziert wird, um eine langsame Zunahme der Netzhautablösung zu ermöglichen, bis die gewünschte Größe erreicht ist. Verwenden Sie eine 41-Gauge-Kanüle des Injektors, um die Ablösung leicht zu vergrößern, bis die Netzhautschere eingeführt werden kann, und entfernen Sie den 10-Uhr-Skleraport.Verwenden Sie dann ein gerades 2,850-Millimeter-Schlitzmesser, das auf den Sehnerv ausgerichtet ist, um eine Berührung der Linse zu vermeiden und die Sklerotomie an dieser Stelle zu vergrößern. Führen Sie die Retinotomie an der Blase vom Sehnerv weg durch, um eine Schädigung der retinalen Nervenfasern aus der transplantierten Region zu vermeiden und zu vermeiden, dass wichtige Netzhautgefäße durchtrennt werden, um das Risiko einer Blutung zu verringern. Um die Organoide zu implantieren, führen Sie eine mit Organoiden beladene Glaskapillare durch die vergrößerte Sklerotomie in Richtung der Retinotomiestelle ein und verwenden Sie die Spitze der Kapillare, um die Retinotomie leicht zu öffnen, um den Zugang zur subretinalen Bläschenöffnung zu ermöglichen.Lassen Sie den Assistenten erneut langsam auf den Kolben des Injektors drücken, um die Organoide in die subretinale Blase zu injizieren. BSS sollte Organoide, die Organe und die Retinotomie aufspülen. Wenn alle Organoide abgegeben wurden, lassen Sie die Glaskapillare einige Sekunden an Ort und Stelle, bevor Sie die Kapillare langsam aus dem Auge entfernen, wobei Sie darauf achten sollten, dass keine plötzliche Flüssigkeit freigesetzt wird.Wenn die Kapillare entfernt wurde, verschließen Sie die Sklerotomie mit der vorplatzierten Naht im Kreuzmuster. Lassen Sie den Assistenten den Infusionsanschluss entfernen, binden Sie schnell die Sklerotomienaht und verschließen Sie die Peritomie mit den Polyglactinnähten in einem einfachen, durchgehenden Muster. Schließen Sie die laterale Kanthotomie mit einer 6-0-Polyglactin-Naht und Achter-Hautnähten, um den lateralen Canthus durchzuführen, und verwenden Sie einfache unterbrochene Hautnähte, um den Rest der Wunde zu schließen.Verabreichen Sie dann den entsprechenden postoperativen Steroid- und Antibiotika-Cocktail. Die Beladung mit retinalen Organoiden aus humanen pluripotenten Stammzellen kann in der Glaskanüle des Injektionsgeräts und während der Operation durch direkte Visualisierung bestätigt werden. Das Vorhandensein der Organoide im subretinalen Raum kann postoperativ durch ophthalmologische Untersuchung und Fundusbildgebung bestätigt werden.Vor der Euthanasie können auch eine konfokale Scanning-Laser-Ophthalmoskopie und eine optische Kohärenztomographie-Bildgebung im Spektralbereich durchgeführt werden, um die Position der Organoide zu beurteilen. Mit diesen Techniken kann die Persistenz von retinalen Organoiden im subretinalen Raum zwischen der neuralen Netzhaut und dem retinalen Pigmentepithel des Empfängerauges nachgewiesen werden. Histologische und immunhistochemische Analysen können verwendet werden, um das Überleben der xenogenen Graphen im subretinalen Raum eines großen Auges bei einem immunsupprimierten Tier zu veranschaulichen.Nur Fachkundige in der vitreoretinalen Chirurgie, wie z. B. ausgebildete Veterinäraugenärzte oder vitreoretinale Chirurgen, die mit den Artunterschieden des Katzenauges im Vergleich zum menschlichen Auge vertraut sind, sollten dieses Verfahren durchführen. Die in diesem Video vorgestellte Technik sollte auch auf andere Großtiermodelle anwendbar sein, die für die Übertragung vitreoretinaler Operationstechniken in die Kliniken verwendet werden.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Efficient Derivation of Human Neuronal Progenitors and Neurons from Pluripotent Human Embryonic Stem Cells with Small Molecule Induction

Effiziente Ableitung von humanen neuronalen Vorläuferzellen und Neuronen aus pluripotenten humanen embryonalen Stammzellen mit Small Molecule Induction

There is a large unfulfilled need for a clinically-suitable human neuronal cell source for repair or regeneration of the damaged central nervous system ...

Forschung

Neurowissenschaften

Dissection, Culture, and Analysis of Xenopus laevis Embryonic Retinal Tissue

Dissection, Culture, and Analysis of Xenopus laevis Embryonic Retinal Tissue

Dissection, Kultur und Analyse der<em&gt; Xenopus laevis</em&gt; Embryonic Netzhautgewebe

The process by which  the anterior region of the neural plate gives rise to the vertebrate retina  continues to be a major focus of both clinical and ...

Limbal Approach-Subretinal Injection of Viral Vectors for Gene Therapy in Mice Retinal Pigment Epithelium

Limbus-Ansatz-Subretinale Injektion von viralen Vektoren für die Gentherapie bei Mäusen Retinapigmentepithel

The eye is a small and enclosed organ which makes it an ideal target for gene therapy. Recently various strategies have been applied to gene therapy in ...

Development of a Refined Protocol for Trans-scleral Subretinal Transplantation of Human Retinal Pigment Epithelial Cells into Rat Eyes

Entwicklung eines raffinierten Protokolls für Trans-skleralen subretinalen Transplantation von menschlichen retinalen Pigment Epithelzellen in Ratte Augen

Degenerative retinal diseases such as age-related macular degeneration (AMD) are the leading cause of irreversible vision loss worldwide. AMD is ...

Modelling Zika Virus Infection of the Developing Human Brain In Vitro Using Stem Cell Derived Cerebral Organoids

Modelling Zika Virus Infection of the Developing Human Brain In Vitro Using Stem Cell Derived Cerebral Organoids

Modellierung der Zika-Virus-Infektion des entwickelnden menschlichen Gehirns In Vitro mit Stammzellen abgeleitet zerebrale Organellen

The recent emergence of Zika virus (ZIKV) in susceptible populations has led to an abrupt increase in microcephaly and other neurodevelopmental conditions ...

Method for High Speed Stretch Injury of Human Induced Pluripotent Stem Cell-derived Neurons in a 96-well Format

Methode für High-Speed Strecke Verletzungen der menschlichen induzierten pluripotenten Stammzellen abgeleitet Neuronen in einem 96-Well-Format

Traumatic brain injury (TBI) is a major clinical challenge with high morbidity and mortality. Despite decades of pre-clinical research, no proven ...

Transplantation of Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Microglia in Immunocompetent Mice Brain via Non-Invasive Transnasal Route

Transplantation von humaninduzierten pluripotenten Stammzell-abgeleiteten Mikroglia im immunkompetenten Mäusegehirn über nicht-invasiven transnasalen Weg

Microglia are the specialized population of macrophage-like cells of the brain. They play essential roles in both physiological and pathological brain ...

Transplantation of Human Stem Cell-Derived GABAergic Neurons into the Early Postnatal Mouse Hippocampus to Mitigate Neurodevelopmental Disorders

Transplantation von GABAergen Neuronen aus humanen Stammzellen in den frühen postnatalen Maushippocampus zur Linderung neurologischer Entwicklungsstörungen

A reduced number or dysfunction of inhibitory interneurons is a common contributor to neurodevelopmental disorders. Therefore, cell therapy using ...

Organotypic Cultures of Adult Human Cortex as an Ex vivo Model for Human Stem Cell Transplantation and Validation

Organotypic Cultures of Adult Human Cortex as an Ex vivo Model for Human Stem Cell Transplantation and Validation

Organotypische Kulturen des adulten humanen Kortex als Ex-vivo-Modell für die Transplantation und Validierung humaner Stammzellen

Neurodegenerative disorders are common and heterogeneous in terms of their symptoms and cellular affectation, making their study complicated due to the ...

Culturing Human Midbrain Dopaminergic Neurons for Phenotypic Profiling

Phenotypic Profiling of Human Stem Cell-Derived Midbrain Dopaminergic Neurons

Generating Neuronal Phenotypic Profiles - A Protocol to Culture and Image Human Midbrain Dopaminergic Neurons (Video) | JoVE

Phänotypisches Profiling von aus menschlichen Stammzellen gewonnenen dopaminergen Neuronen im Mittelhirn

Parkinson&#39;s disease (PD) is linked to a range of cell biological processes that cause midbrain dopaminergic (mDA) neuron loss. Many current in vitro ...