Name: optimization of crystal growth for neutron macromolecular crystallography
Uploaded: 2021-03-13T14:00:00
Duration: 12 min 29 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Optimization of Crystal Growth for Neutron Macromolecular Crystallography at JoVE.com

تعترف شركة محمد بن سلمان بالدعم المقدم من شركة LABEX VALO GRAL بموجب العقد 2015. NJ يعترف CEA الدولي برنامج أبحاث الدكتوراه (Irtelis) للحصول على زمالة الدكتوراه. يعترف المؤلفون بالتمويل من برنامج البحث والابتكار في أفق الاتحاد الأوروبي 2020 تحت اتفاقية منحة ماري سكودودوسكا كوري رقم 722687. كما يعرب المؤلفون عن امتنانهم للدكتور إسكو أوكسانين (ESS، لوند) والدكتور جان لوك فيرير (IBS، Grenoble) لمحادثاتهما وأفكارهما المفيدة. يقر IBS بالاندماج في معهد أبحاث غرونوبل متعدد التخصصات (IRIG, CEA).

<ol>
	<li>Blakeley, M. P., Langan, P., Niimura, N., Podjarny, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutron+crystallography:+opportunities,+challenges,+and+limitations.">Neutron crystallography: opportunities, challenges, and limitations.</a> Current Opinion in Structural Biology. 18 (5), 593-600 (2008).</li><li>Snell, E. H., Van Der Woerd, M. J., Damon, M., Judge, R. A., Myles, D. A. A., Meilleur, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimizing+crystal+volume+for+neutron+diffraction:+D-xylose+isomerase.">Optimizing crystal volume for neutron diffraction: D-xylose isomerase.</a> European Biophysics Journal. 35 (7), 621-632 (2006).</li><li>Ng, J. D., Baird, J. K., Coates, L., Garcia-Ruiz, J. M., Hodge, T. A., Huang, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large-volume+protein+crystal+growth+for+neutron+macromolecular+crystallography.">Large-volume protein crystal growth for neutron macromolecular crystallography.</a> Acta Crystallographica Section F:Structural Biology Communications. 71, 358-370 (2015).</li><li>O'Dell, W. B., Bodenheimer, A. M., Meilleur, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutron+protein+crystallography:+A+complementary+tool+for+locating+hydrogens+in+proteins.">Neutron protein crystallography: A complementary tool for locating hydrogens in proteins.</a> Archives of Biochemistry and Biophysics. 602, 48-60 (2016).</li><li>Oksanen, E., Blakeley, M. P., Bonnet&#233;, F., Dauvergne, M. T., Dauvergne, F., Budayova-Spano, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large+crystal+growth+by+thermal+control+allows+combined+X-ray+and+neutron+crystallographic+studies+to+elucidate+the+protonation+states+in+Aspergillus+flavus+urate+oxidase.">Large crystal growth by thermal control allows combined X-ray and neutron crystallographic studies to elucidate the protonation states in Aspergillus flavus urate oxidase.</a> Journal of the Royal Society Interface. 6, (2009).</li><li>Krauss, I. R., Merlino, A., Vergara, A., Sica, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+overview+of+biological+macromolecule+crystallization.">An overview of biological macromolecule crystallization.</a> International Journal of Molecular Sciences. 14 (6), 11643-11691 (2013).</li><li>Chayen, N. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+Studies+of+Protein+Crystallization+by+Vapour-Diffusion+and+Microbatch+Techniques.">Comparative Studies of Protein Crystallization by Vapour-Diffusion and Microbatch Techniques.</a> REVIEW Acta Cryst. , (1998).</li><li>Junius, N., Oksanen, E., Terrien, M., Berzin, C., Ferrer, J. L., Budayova-Spano, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+crystallization+apparatus+for+temperaturecontrolled+flow-cell+dialysis+with+real-time+visualization.">A crystallization apparatus for temperaturecontrolled flow-cell dialysis with real-time visualization.</a> Journal of Applied Crystallography. 49, 806-813 (2016).</li><li>Salemme, F. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+free+interface+diffusion+technique+for+the+crystallization+of+proteins+for+X-ray+crystallography.">A free interface diffusion technique for the crystallization of proteins for X-ray crystallography.</a> Archives of Biochemistry and Biophysics. 151 (2), 533-539 (1972).</li><li>Chayen, N. E., Saridakis, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+crystallization:+From+purified+protein+to+diffraction-quality+crystal.">Protein crystallization: From purified protein to diffraction-quality crystal.</a> Nature Methods. 5 (2), 147-153 (2008).</li><li>Ot&#225;lora, F., Gavira, J. A., Ng, J. D., Garc&#237;a-Ruiz, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Counterdiffusion+methods+applied+to+protein+crystallization.">Counterdiffusion methods applied to protein crystallization.</a> Progress in Biophysics and Molecular Biology. 101 (1-3), 26-37 (2009).</li><li>Garci&#225;-Ruiz, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Counterdiffusion+Methods+for+Macromolecular+Crystallization.">Counterdiffusion Methods for Macromolecular Crystallization.</a> Methods in Enzymology. 368, 130-154 (2003).</li><li>Budayova-Spano, M., Koruza, K., Fisher, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large+crystal+growth+for+neutron+protein+crystallography.">Large crystal growth for neutron protein crystallography.</a> Methods in Enzymology. 634, 21-46 (2020).</li><li>Budayova-Spano, M., Dauvergne, F., Audiffren, M., Bactivelane, T., Cusack, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+methodology+and+an+instrument+for+the+temperature-controlled+optimization+of+crystal+growth.">A methodology and an instrument for the temperature-controlled optimization of crystal growth.</a> Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography. 63 (3), 339-347 (2007).</li><li>Asherie, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+crystallization+and+phase+diagrams.">Protein crystallization and phase diagrams.</a> Methods. 34 (3), 266-272 (2004).</li><li>Astier, J. P., Veesler, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+temperature+to+crystallize+proteins:+A+mini-review.">Using temperature to crystallize proteins: A mini-review.</a> Crystal Growth and Design. 8 (12), 4215-4219 (2008).</li><li>Budayova-Spano, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+preliminary+neutron+diffraction+study+of+rasburicase,+a+recombinant+urate+oxidase+enzyme,+complexed+with+8-azaxanthin.">A preliminary neutron diffraction study of rasburicase, a recombinant urate oxidase enzyme, complexed with 8-azaxanthin.</a> Acta Crystallographica Section F: Structural Biology and Crystallization Communications. 62 (3), 306-309 (2006).</li><li>Junius, N., Vahdatahar, E., Oksanen, E., Ferrer, J. L., Budayova-Spano, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+crystallization+of+biological+macromolecules+using+dialysis+combined+with+temperature+control.">Optimization of crystallization of biological macromolecules using dialysis combined with temperature control.</a> Journal of Applied Crystallography. 53 (3), (2020).</li><li>Grimsley, G. R., Pace, C. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spectrophotometric+Determination+of+Protein+Concentration.">Spectrophotometric Determination of Protein Concentration.</a> Current Protocols in Protein Science. 33 (1), 1-9 (2003).</li><li>McPherson, A., Gavira, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Introduction+to+protein+crystallization.">Introduction to protein crystallization.</a> Acta Crystallographica Section F:Structural Biology Communications. 70 (1), 2-20 (2014).</li><li>McPherson, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Introduction+to+protein+crystallization.">Introduction to protein crystallization.</a> Methods. 34 (3), 254-265 (2004).</li></ol>

ليس لدى أصحاب البلاغ ما يكشفون عنه.

المتغيرات الفيزيائية والكيميائية والبيولوجية المختلفة تؤثر على تبلور البروتين من خلال التأثير على ذوبان البروتين21. من بين هذه المتغيرات، يتم استخدام درجة الحرارة والتركيب الكيميائي لمحلول التبلور هنا في تركيبة مع تقنية غسيل الكلى لتحسين وزراعة بلورات كبيرة عالية الجودة من الجزيئات الحيوية لدراسات الحيود النيوتروني. باستخدام المعرفة من الرسوم البيانية المرحلة، يتم إجراء التبلور أكثر قابلية للتنبؤ. على الرغم من أن فحص ظروف التبلور المختلفة في نهج تسلسلي ممكن أيضًا ، فإن الهدف الرئيسي من استخدام النهج العقلانية المقدمة هو فصل والسيطرة على حركية النوى الكريستالية والنمو.
على غرار جميع دراسات التبلور ، فإن عينات البروتين النقي والمجانسة عالية الجودة ، وحلول التبلور الخالية من الغبار تزيد من معدل نجاح التجربة. الترشيح والطرد المركزي للحلول هي خطوات أساسية في البروتوكولات الموصوفة. معرفة الخصائص الفيزيائية الكيميائية للبروتينات درس مثل الوزن الجزيئي (لاختيار غشاء غسيل الكلى المناسب)، ونقطة isoelectric، والذوبان البروتين حاسمة لتصميم تجربة نمو البلورات الأمثل. أيضا، يجب النظر في استقرار البروتين في درجات حرارة مختلفة أو مع مواد كيميائية مختلفة لمنع فقدان العينة وزيادة احتمال النجاح. وبالنظر إلى مدى درجة حرارة OptiCrys (233.0-353.0 ± 0.1 K)، يمكن بلورة مجموعة واسعة من البروتينات باستخدامها. ولكن تجدر الإشارة إلى أن البروتينات التي هي في المقام الأول مستقرة حراريا، مثل البروتينات من مصادر ثيرموسية، سوف تستفيد أكثر في درجة الحرارة التي تسيطر عليها تجارب النمو البلورية كبيرة الحجم التي تقدمها هذه الأداة.
باستخدام غرفة غسيل الكلى منخفضة الحجم (عند استخدام OptiCrys) أو أزرار التحليل الدقيق وفحص العديد من درجات الحرارة وظروف التبلور (على سبيل المثال، شبكات التركيز السريع أو درجة الحرارة)، من الممكن الحصول على معلومات عن موقع الحد الأقصى للمنطقة الفوقية (التوازن الحركي بين النويات ومناطق metastable). هذا لا يقدر بثمن عند تصميم تجربة نمو البلورة الناجحة وخاصة بالنسبة للمرشحين البروتين الجديد في التبلور. بدون هذه المعلومات التجارب يمكن أن تبدأ من منطقة من الرسم البياني للمرحلة مع التشبع الفائق عالية، بعيدا جدا عن الحد من منطقة الفوقا للسيطرة بسهولة نوات الكريستال. على الرغم من أن حل الترسبات البروتينية قد يكون محاولة، على سبيل المثال عن طريق زيادة درجة الحرارة في حالة الذوبان المباشر، للبروتينات مع انخفاض الحرارة، والحفاظ على العينة في درجة حرارة عالية لفترة أطول من الزمن قد تجعل من البروتين هطول الأمطار لا رجعة فيه. وهكذا، فإن أفضل استراتيجية تتكون من استخدام شرط أولي مع انخفاض التشبع الفائق تقع بالقرب من الحد الأقصى للاشتعال، حيث يمكن السيطرة على النوى وتجنب هطول الأمطار البروتين. وتمشيا مع هذا، تبلور الفحص المسبق يقلل من فرصة وجود البروتين راسب في غرفة غسيل الكلى ويزيد من معدل نجاح التجربة.
بعد تصميم التجربة، يعد إعداد غرف غسيل الكلى (OptiCrys) أو أزرار غسيل الكلى الدقيقة خطوة مهمة أخرى. منع تشكيل فقاعة الهواء في غرفة غسيل الكلى / زر يزيد من فرصة تبلور ناجحة وخصوصا عندما يتم استخدام كميات صغيرة. وجود فقاعات الهواء في غرفة غسيل الكلى قد يغير أيضا حركية عملية التبلور والحد من استنساخ التجربة (لأن بروتين / حل سطح الاتصال قد تم تعديلها). ليس فقط البروتين ولكن أيضا حل التبلور يمكن أن تؤثر على نجاح التجربة. استخدام أنابيب جديدة 50 مل لنظام الضخ في كل مرة يريد المرء بدء تجربة جديدة وغسل الأنابيب بعد كل تجربة يقلل من فرصة التلوث ويتجنب إنشاء بلورات الملح في الجهاز.
استخدام أزرار غسيل المجهر هو بديل عندما لا يكون OptiCrys متوفرا. استراتيجيات لتحقيق أقصى قدر من التبلور ورصد نمو البلورات المذكورة أعلاه، يجب أن تنفذ يدويا. وعادة ما يتطلب هذا أن تكون خارج حاضنة حرارية، والتي يمكن أن تكون إشكالية عندما يكون تنظيم درجة الحرارة خطوة حاسمة في المنهجية الموصوفة. هذا لا يسهل تغيير التركيب الكيميائي لحلول التبلور ، أو مراقبة نمو البلورات عن طريق التصوير ، لذلك لا يمكن التحكم في عملية نمو البلورات في الوقت الحقيقي.
المعرفة من الرسم البياني المرحلة هو الأساس لاستخدام مقاعد البدلاء تبلور، OptiCrys، لتنمو بشكل منهجي كبيرة، بلورات عالية الجودة بطريقة آلية. التحكم في المعلمات الفيزيائية الكيميائية مثل درجة الحرارة، والتركيز المتعجل، ودرجة حِس حُسّ أثناء التبلور، ينقل توازن محلول البروتين في مسار حركي واضح المعالم عبر الرسم التخطيطي للمرحلة. ويكمل هذا باستخدام غشاء غسيل الكلى لضبط النقل الجماعي وخلق تدرج مسيطر عليه في غرفة التبلور التي تؤثر على حجم ونوعية البلورات. لذلك، استخدام كل من البيانات الديناميكا الحرارية والمسارات الحركية أمر ضروري للسيطرة على عملية التبلور من أجل زراعة بلورات عالية الجودة. بفضل OptiCrys ، يمكن دراسة الرسومات التخطيطية للطور المنهجي في مساحة متعددة الأبعاد باستخدام نهج تسلسلي باستخدام مواد أقل بكثير من ذي قبل. لإثبات هذه المنهجية، ونحن نقدم هنا دراسة حالة مع بروتين نموذجي، الدجاج البيض الأبيض lysozyme. باستخدام واتقان البروتوكول المقدم هنا يمكن للمرء أن تكييفه لنظم البروتين الحقيقي5،14،17،18.

فهم العلاقة بين الهيكل والوظائف من البروتينات وآلية المسارات الفسيولوجية غالبا ما يعتمد على معرفة مواقف ذرات الهيدروجين (H) وكيف يتم نقل شحنة داخل البروتين1،2. منذ ذرات الهيدروجين تشتت الأشعة السينية ضعيفة، لا يمكن تحديد مواقعها إلا مع بيانات الحيود الأشعة السينية عالية الدقة (> 1 Å)3،4. وعلى العكس من ذلك، يمكن استخدام البلورات النيوترونية للحصول على موضع دقيق لذرات الهيدروجين في الجزيئات الحيوية مثل الهيدروجين والديوتيريوم (H2، نظير الهيدروجين) ذرات لها أطوال متناثرة ذات حجم متساو تقريبا مثل الأكسجين والنيتروجين والكربون5. ومع ذلك، فإن تدفق النيوترونات من المصادر النيوترونية المتاحة أضعف من شعاع الأشعة السينية، لذلك يجب تعويض هذا في كثير من الأحيان عن2،3. ويمكن تحقيق ذلك عن طريق تبادل H مع H2 و / أو زيادة حجم البلورات للحد من التشتت غير المتماسك للهيدروجين وزيادة نسبة الإشارة إلى الضوضاء لصور الحيود.
هناك العديد من مقاربات التبلور (الرسم التخطيطي المقابل للمرحلة موضح في الشكل 1)للحصول على بلورات كبيرة وعالية الجودة لكل من الأشعة السينية والنيوترونات الحيوية الجزيئية البلورية6. في انتشار البخار ، يتم تعديل القطرات المعدة من خليط من البروتين وحل التبلور بمرور الوقت ، من خلال تبخر الماء أو الأنواع المتطايرة الأخرى ، مقابل خزان يحتوي على تركيز أعلى من الراسعة من نفس محلول التبلور. إن زيادة تركيز البروتينات والزلال في القطرات تؤدي إلى التشبع الزائد المطلوب للانوية العفوية يليه نمو البلورات في هذه النوى6،7. على الرغم من أن انتشار البخار هو الأسلوب الأكثر استخداما لزراعة البلورات4، لا يمكن أن تكون عملية التبلور تسيطر عليها بدقة8. في طريقة نشر الواجهة المجانية ، ينتشر حل التبلور في محلول بروتين مركز ، ويوجه النظام ببطء شديد نحو التشبع الفائق. ويمكن اعتبار هذا الأسلوب كطريقة دفعة مع معدل خلط بطيء6،9،10،11،12. في طريقة الدفعة ، يتم خلط البروتين بسرعة مع محلول تبلور يؤدي إلى التشبع السريع وينوية موحدة بدورها مع العديد من البلورات3،7. هذه الطريقة تمثل حوالي ثلث جميع الهياكل المودعة حاليا في بنك بيانات البروتين. كما تستخدم طريقة غسيل الكلى لزراعة بلورات البروتين عالية الجودة و والتفيش. في طريقة غسيل الكلى، جزيئات من منتشر من خزان من خلال غشاء شبه نفاذية في غرفة منفصلة مع محلول البروتين. حركية التوازن تعتمد على عوامل مختلفة، مثل درجة الحرارة، وحجم المسام الغشاء، وحجم وتركيز عينات البروتين وعوامل التبلور6.
يمكن استخدام مخططات مرحلة التبلور لوصف حالات مختلفة من البروتين كدالة لمتغير فيزيائي أو كيميائي مختلف3. كما هو موضح في الشكل 1، يمكن تصور كل تقنية تبلور على أنها تستخدم مسارًا حركيًا مختلفًا للوصول إلى مناطق التنو والفوقية لمثل هذا الرسم البياني6و10و13. وهذا يوفر معلومات حول ذوبان البروتين وتركيز البروتين الذي لوحظ فيه توازن دينامي حراري بين الكريستال والحل ، وبالتالي إيجاد الظروف المثلى للنيوية والنمو3،14. في مخطط المرحلة ثنائي الأبعاد، يتم رسم تركيز البروتين كدالة متغير واحد ويتم الاحتفاظ بالمتغيرات الأخرى ثابتة15. في مثل هذا الرسم التخطيطي للمرحلة، عندما يكون تركيز البروتين أقل من منحنى القابلية للذوبان، يكون الحل في المنطقة غير المشبعة ولا يحدث أي نواة أو نمو بلوري. فوق هذا المنحنى توجد منطقة التشبع الفائق حيث تركيز البروتين أعلى من حد الذوبان3،14. وتنقسم هذه المنطقة إلى ثلاث مناطق: منطقة الفوقية، ومنطقة النوى العفوية، ومنطقة هطول الأمطار. في منطقة الفوقابل، التشبع الزائد لا يكفي للنيوية أن تحدث في غضون فترة زمنية معقولة ولكن يمكن أن يحدث نمو بلورات بذر. ويفضل التجميع وهطول الأمطار في منطقة هطول الأمطار، حيث التشبع الزائد مرتفع جدا14،15.
عندما يتم تحقيق التشبع الزائد الكافي للنيوية التلقائية، ستظهر النواة الأولى10. يؤدي نمو البلورات إلى انخفاض في تركيز البروتين حتى يتم الوصول إلى حد الذوبان. طالما أن التشبع الفائق يبقى في المنطقة المجاورة لمنحنى القابلية للذوبان، لن يكون هناك تغيير كبير في حجم البلورات. ومع ذلك ، فقد تبين أن الاختلافات في درجة الحرارة والتركيب الكيميائي لمحلول التبلور (على سبيل المثال ، تركيز الزلال) ستؤثر على قابلية الذوبان في البروتين وقد تؤدي إلى بدء المزيد من النمو البلوري8و13و16.
كما غسيل الكلى هو مفيد لنمو الكريستال ذات نوعية جيدة، و OptiCrys تبلور مقاعد البدلاء يتضح في الشكل 2، تم تصميمها وتطويرها في مختبرنا لمراقبة تبلور بطريقة مؤتمتة بالكامل8. لهذا الغرض، تم كتابة برنامج مع LabVIEW التي تسمح لمراقبة ورصد درجة حرارة إعداد غسيل الكلى الخزان المتدفقة في اتصال مع عناصر بلتيير، عن طريق وحدة تحكم إلكترونية ومبرد. نفس البرنامج أيضا ينظم تلقائيا التركيب الكيميائي لمحلول التبلور (على سبيل المثال تبادل عوامل التبلور) باستخدام نظام متعدد القنوات fluidic. بالإضافة إلى ذلك، يتم استخدام كاميرا رقمية ومجهر مقلوب لتصور وتسجيل عملية التبلور. تتوفر غرفتان للتبلور مع 15 ميكرولتر و 250 ميكرولتر لزراعة البلورات لأغراض مختلفة. كما عملية التبلور هو عكسها، والفرز لظروف مختلفة من الممكن مع عدد قليل من ميكرولترات من محلول البروتين طالما لم يتم تلف العينة8. ونتيجة لذلك، فإن استخدام هذه الطريقة يقلل من كمية المواد البروتينية المستخدمة.
من العمل السابق8، من الواضح أنه خلال عملية النمو البلوري ، يجب إجراء عمليات المراقبة في الموقع على فترات زمنية منتظمة. ويمكن أن تتراوح هذه من بضع ثوان إلى عدة أيام، اعتمادا على الحدث تحت الملاحظة (هطول الأمطار، nucleation، أو نمو البلورات).
ويستند تحسين النمو البلورية مع OptiCrys على الرسم البياني مرحلة تركيز درجة الحرارة. في حالة البروتينات مع الذوبان كدالة مباشرة لدرجة الحرارة، فمن الممكن الاستفادة من نظام التملاحالتدريجي 18. هذا هو المكان الذي يزيد من قوة أيونية من الحل، والتي يمكن تصورها باستخدام رسومات تخطيطية مرحلة البروتين- الانتهابي، يقلل من ذوبان البروتين. وبالمثل، يمكن للبروتينات مع الذوبان العكسي الاستفادة من التململ في النظام18. تحدث النوى في منطقة التنو، في محيط المنطقة الفوقية، ثم يحدث نمو البلورات في المنطقة الفوقية من الرسم التخطيطي للمرحلة حتى يصل تركيز البروتين إلى حد الذوبان. كما هو مبين في الشكل 3A، مع درجة حرارة التركيب الكيميائي الثابتة يمكن أن تنخفض للحفاظ على حل التبلور في منطقة ميتاستابل لمنع نوية جديدة. بلورات تنمو حتى يتحقق التوازن الثاني الكريستال / حل وبعد ذلك، لا توجد زيادة أخرى في حجم بلورات لوحظ. يتم تقليل درجة الحرارة عدة مرات حتى تصل البلورات إلى الحجم المطلوب. في الشكل 3B، في درجة حرارة ثابتة ، يزيد التركيز المائل يحافظ على المحلل في منطقة metastable. ويمكن بعد ذلك تكرار هذه العملية عدة مرات للحصول على بلورات كبيرة. تغيير درجة الحرارة والتلاعب في ظروف حل التبلور ، من خلال التحكم في مستويات التشبع الفائق ، هما أداتان قويتان لفصل نوات ونمو البلورات التي يتم التحكم فيها بدقة وتلقائيا من قبل OptiCrys5،8،14.
أمثلة من بلورات البروتين التي نمت من قبل درجة الحرارة التي تسيطر عليها، أو درجة الحرارة وتبلور التركيز التي تسيطر عليها، فضلا عن البيانات الحيود النسبية التي تم الحصول عليها هي متوفرة في الأدب وPDB. من بينها الإنسان γ-crystallin E, PA-IIL lectin, الخميرة غير العضوية بيروفوسفاتاز, أوسترات أوكسيديز, الإنسان الكربوني anhydrase الثاني, YchB kinase, و لاكتات ديهيدروجيناز5,14,17,18.
على الرغم من أن OptiCrys تم تسويقها من قبل NatX-ray ، هناك العديد من المختبرات التي لا يمكن الوصول إلى هذا الصك أو إلى النهج التسلسلي الذي تقدمه. البديل لهذه التقنية هو استخدام أزرار غسيل الكلى البلاستيك المتاحة تجاريا مع وحدات التخزين المختلفة. باستخدام هذه، يمكن تعديل درجة الحرارة والتركيب الكيميائي وتنوعها يدويا. لا يمكن فحص أزرار التحليل المجهري في الموقع ويجب بدلا من ذلك أن يتم يدويا مع المجهر البصري. ويمكن تحقيق التحكم في درجة الحرارة عن طريق الحفاظ على العينة في حاضنة خالية من الاهتزاز درجة الحرارة التي تسيطر عليها. من الضروري الحفاظ على ثبات درجة الحرارة لضمان أن تكون تجارب التبلور قابلة للتكرار. قد يؤدي اختلاف كبير في درجة الحرارة أيضا إلى تلف أو تدمير بلورات5.
هنا نقدم بروتوكول مفصل يصف إعداد العينة واستخدام برامج التحكم لنمو بلورات كبيرة وعالية الجودة مناسبة لبلورات البروتين النيوترونية. تم تصميم هذا الإجراء خطوة بخطوة للاستفادة من الرسم التخطيطي لمرحلة التبلور من أجل تحديد موضع البداية والمسار الحركي للتحكم في حجم ونوعية البلورات التي تم إنشاؤها. بالإضافة إلى ذلك، يتم تقديم بروتوكول مفصل لزراعة البلورات مع أزرار غسيل المجهر الذي يستخدم نفس الأساس المنطقي للحصول على بلورات كبيرة وعالية الجودة.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>200 &#181;l Dialysis Button</td>
			<td>Hampton Research</td>
			<td>HR3-330</td>
			<td>Dialysis button</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24 well plates</td>
			<td>Jena Bioscience</td>
			<td>CPL-132</td>
			<td>Crystallization plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Switch</td>
			<td>FLUIGENT</td>
			<td>2SW001</td>
			<td>Switch</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>30 &#956;l Dialysis Button</td>
			<td>Hampton Research</td>
			<td>HR3-324</td>
			<td>Dialysis button</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL Corning Centrifuge tubes</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>CLS430828-500EA</td>
			<td>Centrifuge tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S2889</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chicken Egg White Lysozyme</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L6876</td>
			<td>Lyophilized protein powder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dialysis Membrane Discs 6-8 kDa MWCO</td>
			<td>Spectrum</td>
			<td>132478</td>
			<td>Dialysis membrane</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dialysis Membrane Tubing 6-8 kDa MWCO</td>
			<td>Spectrum</td>
			<td>132650T</td>
			<td>Dialysis membrane</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>Minispin</td>
			<td>Bench-top centrifuge</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow Unit</td>
			<td>FLUIGENT</td>
			<td>FLU-XL</td>
			<td>Flow meter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flowboard</td>
			<td>FLUIGENT</td>
			<td>FLB</td>
			<td>Flowboard</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microfluidic Flow Control System EZ</td>
			<td>FLUIGENT</td>
			<td>EZ-01000002</td>
			<td>Pressure/vacuum controller</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MilliporeSigma 0.22 &#181;m syringe Filters</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>GSWP04700</td>
			<td>0.22 &#956;m pore size filter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M-Switch</td>
			<td>FLUIGENT</td>
			<td>MSW002</td>
			<td>Rotary valve</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opticrys</td>
			<td>NatX-ray</td>
			<td>PRT008</td>
			<td>Crystallization bench</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Siliconized circle cover slides</td>
			<td>Hampton Research</td>
			<td>HR3-231</td>
			<td>Glass slides</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride &#8805; 99%</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>746398</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Switchboard</td>
			<td>FLUIGENT</td>
			<td>SWB002</td>
			<td>Switchboard</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermoregulated incubator</td>
			<td>Memmert</td>
			<td>IPP30</td>
			<td>Thermoregulated incubator</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

optimization of crystal growth for neutron macromolecular crystallography

إن استخدام البلورات الجزيئية النيوترونية (NMX) يتوسع بسرعة مع تحديد معظم الهياكل في العقد الماضي بفضل خطوط شعاع NMX الجديدة التي تم بناؤها وزيادة توافر برامج صقل الهيكل. ومع ذلك، فإن مصادر النيوترونات المتاحة حالياً لمي إم إكس أضعف بكثير من المصادر المكافئة للتصوير البلوري بالأشعة السينية. وعلى الرغم من التقدم في هذا المجال، فإن البلورات الكبيرة ستكون مطلوبة دائماً لدراسات الحيود النيوتروني، لا سيما مع الميل إلى دراسة الجزيئات الكبيرة والمجمعات الأكبر من أي وقت مضى. ولذلك فإن إدخال المزيد من التحسينات على الأساليب والأجهزة المناسبة لزراعة بلورات أكبر ضرورية لتوسيع نطاق استخدام NMX.
في هذا العمل، نقدم استراتيجيات عقلانية ومقاعد البلورات (OptiCrys) التي وضعت في مختبرنا الذي يجمع بين المراقبة في الوقت الحقيقي من خلال كاميرا فيديو محمولة على المجهر مع التحكم الآلي الدقيق من حلول التبلور (على سبيل المثال، تركيز حاد، درجة ح/ ، المضافة، درجة الحرارة). ثم نبين كيف أن هذا التحكم في درجة الحرارة والتركيب الكيميائي يسهل البحث عن ظروف التبلور المثلى باستخدام البروتينات القابلة للذوبان في النموذج. المعرفة الدقيقة لمخطط مرحلة التبلور أمر حاسم في اختيار موضع البداية والمسار الحركي لأي تجربة تبلور. نُظهر كيف يمكن لنهج عقلاني أن يتحكم في حجم وعدد البلورات التي يتم إنشاؤها استنادًا إلى معرفة الرسوم البيانية متعددة الأبعاد للمرحلة.

Watch this Scientific Journal Video about Optimization of Crystal Growth for Neutron Macromolecular Crystallography at JoVE.com

Optimization of Crystal Growth for Neutron Macromolecular Crystallography

تتطلب الدراسات الهيكلية للجزيئات الحيوية بواسطة البلورات بلورات عالية الجودة. هنا نبرهن على بروتوكول يمكن استخدامه من قبل OptiCrys (أداة مؤتمتة بالكامل تم تطويرها في مختبرنا) و / أو أزرار التحليل الدقيق لزراعة بلورات كبيرة عالية الجودة استنادًا إلى معرفة الرسم التخطيطي لمرحلة التبلور.

تحسين النمو البلوري للبلورات النيوترونية الجزيئية

The use of neutron macromolecular crystallography (NMX) is expanding rapidly with most structures determined in the last decade thanks to new NMX ...

هناك مقاربات مختلفة للتبلور للحصول على بلورات كبيرة وعالية الجودة لكل من الأشعة السينية والبلورات النيوترونية. واحدة من هذه الطرق هو استخدام طريقة غسيل الكلى. في هذه التقنية ، يتم فصل محلول البروتين عن محلول متهور بواسطة غشاء شبه نفاذي.الجزيئات المتعجلة تنتشر عبر الغشاء في غرفة البروتين. عندما يتم تحقيق التشبع الفائق الصحيح للنية العفوية ، ستظهر النواة الأولى. هنا، سوف نبرهن على بروتوكول يمكن استخدامه من قبل OptiCrys أداة مؤتمتة بالكامل تم تطويرها في مختبرنا تستخدم تبلور غسيل الكلى الخاضع للرقابة في درجة الحرارة، وأزرار غسيل الكلى الجزئي الخاصة بنا لزراعة بلورات عالية الجودة كبيرة لبلورات الجزيئات الجزئية الطبيعية استنادًا إلى معرفة الرسم التخطيطي لمرحلة التبلور.لزر غسيل الكلى الكلي مع بعض الماصات حجم ميكروليت 35 ميكرولترات من حل lysozyme في غرفة غسيل الكلى. هذا الحجم الإضافي يخلق شكل قبة قليلا على رأس غرفة غسيل الكلى ويمنع تشكيل فقاعة الهواء. تأخذ قضيب ووضع مرونة أو حلقة في أقصى منه.ضع الغشاء فوق الغرفة واصلحه عن طريق نقل المرونة أو الخاتم من قضيب إلى أخدود زر غسيل الكلى. نقل الزر إلى البئر الذي يحتوي على حل التبلور. غطي البئر بزلة غلاف زجاجي أو قطعة من الشريط.احتفظ بالعينة عند 293 كلفن في حاضنة تنظيمية حرارية مجانية للاهتزاز. مع العلم أن تبلور غسيل الكلى يوفر مزايا من وجهة نظر النمو البلورية تم تصميم مقاعد التبلور ما يسمى OptiCrys وتطويرها في مختبرنا لتقديم التحكم المدمجة بالكامل من درجة الحرارة والتركيب الكيميائي للتبلور الجزيئي الحيوي التجربة. ويستند تحسين النمو البلورية من قبل OptiCrys على الرسم البياني مرحلة تركيز درجة الحرارة.تحدث النوى في منطقة التنو في المنطقة المجاورة للمنطقة الفوقية ونمو البلورات ثم تحدث في منطقة الفوقا بعد الرسم التخطيطي للمرحلة، حتى يصل تركيز البروتين إلى منحنى القابلية للذوبان الذي يمثل التوازن الديناميكي الحراري بين الحل والبلورات. عن طريق خفض درجة الحرارة في حالة وجود البروتين مع الذوبان المباشر أو عن طريق زيادة تركيز حاد في حالة من التململ الوصول، ويبقى حل التبلور في منطقة ميتاسيبل ولا تحدث نوات. بلورات تنمو حتى تحقيق التوازن حل الكريستال الثاني وبعد ذلك، لا توجد زيادة أخرى في حجم بلورات لوحظ.يتم تكرار خفض درجة الحرارة أو زيادة التركيز المتعجل عدة مرات حتى تصل البلورات إلى الحجم المطلوب. إضافة محلول البروتين إلى غرفة غسيل الكلى من درجة الحرارة التي تسيطر عليها تتدفق اقامة، وتغطية أكثر من غرفة مع غشاء غسيل الكلى وإصلاح الغشاء مع مرونة أو حلقة. اقلب الغرفة فوق وضعه على أعلى غرفة غسيل الكلى.اضغط عليه بلطف وببطء لإزالة كل الهواء المحاصرين بين قطعتين، وإصلاح الخزان في وضع انها عن طريق الشد بلطف على رأس الغرفة أكثر. إضافة محلول التبلور إلى غرفة الخزان وتغطيته بغطاء محكم. نقل هذه الجمعية وإدراجها في دعم الثدي من تبلور OptiCrys كريستال النمو هو برنامج الإشراف على OptiCrys تبلور مقاعد البدلاء.وهو يتضمن أربعة واجهات رسومية مختلفة أو طرق العرض. تحتوي طريقة العرض الرئيسية على أزرار للانتقال إلى طرق العرض الأخرى. الغرض من واجهة الإعداد هو تعريف سيناريو تجربة يمكن تشغيلها تلقائياً في طريقة عرض الاختبار.آخر طريقة عرض هي طريقة العرض الصيانة. لإعادة تشغيل تجربة، يجب أن تكون طريقة العرض الصيانة مفتوحة حيث يتم العثور على كافة المعلمات الأساسية لتشغيل السلس قبالة تجارب التبلور. زيادة اللمعان من قسم الضوء، يمكن للضوء زيادة من الصفر، لا ضوء إلى 100 الحد الأقصى للسطوع.للتحكم في درجة الحرارة ومراقبتها، يتم استخدام قسم تنظيم درجة الحرارة. انقر على الزر لتشغيله. تعيين درجة الحرارة على قسم نقطة مجموعة واضغط على إدخال.أسفل هذا الزر، هناك رسمان بيانيان. ويظهر الأحمر النهائي ودرجة الحرارة في النظام والرسم البياني الأصفر درجة الحرارة الحالية. خلط حلول المخزون، يتم التحكم في حقن محلول التبلور لغرفة الخزان من قبل قسم النخيل.إضافة تركيز من حل الأسهم في المرحلة الأولى. ثم العثور على التركيز النهائي لكل حل جديد grouper وإضافتها إلى قسم التركيز النهائي. بعد الضغط على زر حساب، ومعرفة حجم الأسهم حل سيتم حساب وسوف تضيف في لوحة حجم أمام كل لوحة تركيز.اضغط على زر إعداد التشغيل وانتظر حتى يصبح الحل الجديد جاهزًا. لتبادل حل التبلور، انقر على زر إدخال الحل. لإيقاف العملية، اضغط الزر إيقاف التوزيع.على الجانب الأيمن من قسم المجهر، وهناك العديد من الألواح لتسجيل المعلومات الهامة من كل تجربة نمو البلورات. إضافة اسم البروتينات المقابلة، الوزن الجزيئي وحالة التبلور في هذا القسم. حدد اسمًا للتجارب عن طريق كتابته على اسم المجلد.من قسم الصور NB، حدد عدد الصور التي يجب التقاطها أثناء التجربة. إضافة عدد من الصور ومن لوحة على اليمين، واختيار مقياس الموقت. انقر على زر المجلد لفتح المجلد.يوجد في هذا المجلد ملف نصي يحتوي على كافة المعلومات التي قمت بتعريفها مسبقًا للتجربة. يتم حفظ الصور الجاهزة لأي علاج آخر في هذا المجلد. يمكن أيضا أن تتنوع التكبير قبالة المجهر تلقائيا.تغيير التكبير باستخدام زائد وناقص الزر في الجزء العلوي من قسم المجهر لزيادة أو إنقاص التكبير على التوالي. هناك ثلاث طرق مختلفة لقياس حجم الكريستال. لقياس الطول أو العرض استخدام ناقلات العرض.اعتمادا على شكل الكريستال، يمكن اختيار أدوات محددة من الجزء الأيسر من قسم المجهر. مثل مستطيلة أو مضلعة. ستظهر القيم في قسم القياس.في المجموعة الأولى من التجارب، كانت أزرار التحليل الدقيق مغمورة في حلول التبلور مع تركيزات ملح مختلفة. في هذه التجربة شبكة التبلور بسيطة، المتغير الوحيد هو التركيز المتعجل. بينما تبقى درجة الحرارة ثابتة.تسمح التغيرات الطفيفة في تركيز الملح بالتحري في مخطط مرحلة التبلور عن طريق زيادة تركيز الملح من 0.7 إلى 1.2 زيادة التشبع البير اللابر والعث، ويبتعد الحل في منطقة النوى عن منطقة الفوقا. وبالتالي ، لوحظ اختلاف في حجم وعدد البلورات مع زيادة عدد البلورات وتتناقص حجمها. في التجربة الأولى مع OptiCrys تحت شرط تجريبي معين، مرة واحدة في التوازن في غرفة غسيل الكلى تصل، حل التبلور هو في منطقة نوات في محيط المنطقة metastable من الرسم البياني مرحلة التبلور.ونتيجة لذلك، يتم توليد عدد قليل من النوى خلال المرحلة الأولى من التجربة. من أجل الحفاظ على نمو البلورات في منطقة ميتاستابل والسيطرة على عملية نمو البلورات، تم تغيير درجة الحرارة في فترات زمنية مختلفة. في كل مرة تم الانتهاء من توازن حل الكريستال، كانت درجة الحرارة متنوعة.لذلك انخفضت درجة الحرارة إلى 291 كلفن، 288 كلفن وأخيرا 275 كلفن للحفاظ على نمو البلورة المحددة في منطقة metastable. نتيجة هذه التجربة هي بلورة كبيرة واحدة، مع الحجم المطلوب للبلورات الجزيئية الطبيعية. وتبين تجربتان تاليتان عكسية تجارب غسيل الكلى التي تسيطر عليها درجة الحرارة من أجل النوى ونمو البلورات والذوبان وإعادة النمو.في التجربة الثانية مع OptiCrys تم الحفاظ على التركيب الكيميائي لمحلول التبلور ثابتًا من خلال التجربة وتباينت درجة الحرارة. تم تعيين درجة الحرارة الأولية في 291 كلفن. بسبب ارتفاع التشبع الفائق ، ظهر عدد كبير من البلورات الصغيرة في غرفة التبلور.وفقا لمفهوم من بروتين مباشرة ذوبانية, بزّاوج تدريجيّا الدرجة حرارة إلى 313 [كلفنّلّكلّسّيّوّلّو]. وأخيرا، من خلال خفض درجة الحرارة إلى 295 كلفن، بدأت نوات الثاني في محيط المنطقة الفوقية وسمح للسيطرة على عملية النوى مما أدى إلى تشكيل عدد أقل من النوى. سمح المزيد من النمو الكريستال توليد السكان موحدة من بلورات أكبر.في هذه التجربة، يؤدي تغيير التركيب الكيميائي لمحلول التبلور في درجة حرارة ثابتة إلى الحصول على عدد موحد من البلورات الأكبر. كانت حالة التبلور مشابهة للتجربة السابقة. تم تحقيق حل البلورات عن طريق خفض تركيز NaCl تدريجيا من 0.9 اضحة إلى صفر.يقلل من تركيز الملح يحافظ على الحل في المنطقة غير المشبعة من الرسم البياني للمرحلة مما يؤدي إلى ذوبان البلورات. ثم تم حقن محلول التبلور الجديد بقوة أيونية أقل من السابق في غرفة الخزان. في هذا التركيز المتعجل يظهر عدد أقل من البلورات وتصل البلورات إلى حجم أكبر من ذي قبل.هنا قدمنا بروتوكول مفصل يصف إعداد العينة وضبط برامج التحكم لزراعة بلورات كبيرة وعالية الجودة للبلورات الجزيئية الطبيعية باستخدام أداة مؤتمتة بالكامل تم تطويرها في مختبرنا. تم تصميم هذا الإجراء خطوة بخطوة والاستفادة من معرفة الرسم البياني مرحلة التبلور من أجل فصل نوات ونمو البلورات. وعلاوة على ذلك، يتم تقديم بروتوكول لزراعة البلورات مع أنماط ميكروسيتسيس أيضا باستخدام أزرار macrocytosis كبديل عندما OptiCrys غير متوفر.بالإضافة إلى الاستراتيجيات التي ذكرتها ل OptiCrys تغيير التركيب الكيميائي لمحلول التبلور ودرجة الحرارة وأخذ الصور يجب أن يتم يدويا. استخدام الاهتزاز الحراري المنظم حاضنة للحفاظ على درجة الحرارة ثابتة مطلوب، وهو خطوة حاسمة في المنهجية أظهرت.

Research

JoVE Journal

Biology

Protein Crystallization for X-ray Crystallography

البلورة البروتين لالبلورات بالأشعة السينية

Using the three-dimensional structure of biological macromolecules to infer how they function is one of the most important fields of modern biology. The ...

Isolation and Biophysical Study of Fruit Cuticles

العزلة ودراسة البيوفيزيائية البشرة من الفاكهة

The cuticle, a hydrophobic protective layer on the aerial parts of terrestrial plants, functions as a versatile defensive barrier to various biotic and ...

Harvesting and Cryo-cooling Crystals of Membrane Proteins Grown in Lipidic Mesophases for Structure Determination by Macromolecular Crystallography

الحصاد والبرد تبريد بلورات من بروتينات الغشاء يزرع في Mesophases شحمي لتحديد هيكل للعلم البلورات ضخم الجزيئات

An important route to understanding how proteins function at a mechanistic level is to have the structure of the target protein available, ideally at ...

In Vitro Analysis of PDZ-dependent CFTR Macromolecular Signaling Complexes

In Vitro Analysis of PDZ-dependent CFTR Macromolecular Signaling Complexes

في تحليل المختبر من PDZ التي تعتمد على المجمعات ضخم الجزيئات CFTR اشارة

Cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR), a chloride channel located primarily at the apical membranes of epithelial cells, plays a ...

Iterative Optimization of DNA Duplexes for Crystallization of SeqA-DNA Complexes

تكرارية الأمثل من دوبلكسات DNA لبلورة-DNA من SeqA مجمعات

Escherichia coli SeqA is a negative regulator of DNA replication that prevents premature reinitiation events by sequestering hemimethylated GATC clusters ...

Optimization and Utilization of Agrobacterium-mediated Transient Protein Production in Nicotiana

Optimization and Utilization of Agrobacterium-mediated Transient Protein Production in Nicotiana

الأمثل والاستفادة من<em&gt; الأجرعية</em&gt; بوساطة إنتاج بروتين عابر في<em&gt; نيكوتيانا</em

Agrobacterium-mediated transient protein production in plants is a promising approach to produce vaccine antigens and therapeutic proteins within a short ...

Production of Human Norovirus Protruding Domains in E. coli for X-ray Crystallography

Production of Human Norovirus Protruding Domains in E. coli for X-ray Crystallography

إنتاج نوروفيروس الإبراز المجالات الإنسان في<em&gt; E. القولونية</em&gt; لأشعة البلورات

The norovirus capsid is composed of a single major structural protein, termed VP1. VP1 is subdivided into a shell (S) domain and a protruding (P) domain. ...

Medium-throughput Screening Assays for Assessment of Effects on Ca2+-Signaling and Acrosome Reaction in Human Sperm

Medium-throughput Screening Assays for Assessment of Effects on Ca2+-Signaling and Acrosome Reaction in Human Sperm

الإنتاجية المتوسطة فحص فحوصات لتقييم الآثار على Ca2 +-إشارات ورد فعل أكروسومي في الحيوانات المنوية البشرية

Ca2+-signaling is essential to normal sperm cell function and male fertility. Similarly, the acrosome reaction is vital for the ability of a human sperm ...