Name: optimization of crystal growth for neutron macromolecular crystallography
Uploaded: 2021-03-13T14:00:00
Duration: 12 min 29 s
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MBS 感谢 LABEX VALO GRAL 根据 2015 年合同提供的支持。新泽西州承认东航的国际博士研究计划（Irtelis）获得博士学位。作者承认，根据玛丽·斯克索多夫斯卡-居里赠款协议（编号722687），欧盟的"地平线2020"研究与创新计划提供了资金。作者还感谢埃斯科·奥克萨宁博士（ESS，隆德）和让-吕克·费雷尔博士（IBS，格勒诺布尔）的有益对话和见解。IBS承认与格勒诺布尔跨学科研究所（IRIG，东航）合并。

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作者没有什么可透露的。

不同的物理、化学和生物变量影响蛋白质结晶，影响蛋白质溶解性21。在这些变量中，结晶溶液的温度和化学成分与透析技术相结合，用于改进和培育大型优质生物分子晶体，用于中子衍射研究。通过使用相位图的知识，结晶变得更加可预测。虽然也可以以连续方法筛选不同的结晶条件，但使用所呈现的合理方法的主要目的是分离和控制晶体核和生长的动能。
与所有结晶研究类似，高质量的纯同质蛋白样品和无尘结晶溶液提高了实验的成功率。解决方案的过滤和离心是上述议定书中的重要步骤。了解所研究的蛋白质的物理化学特性，如分子量（选择适当的透析膜）、等电点和蛋白质溶解性，对于设计最佳晶体生长实验至关重要。此外，必须考虑在不同温度或不同化学品下的蛋白质稳定性，以防止样品流失并增加成功的可能性。考虑到 OptiCrys （233.0-353.0 ± 0.1 K） 的温度范围，可以使用它结晶多种蛋白质。但值得强调的是，在该仪器提供的温度控制的大体积晶体生长实验中，主要具有热稳定性的蛋白质（如来自热友源的蛋白质）将受益最大。
使用小容量透析室（使用 OptiCrys 时）或微透析按钮并筛选多个温度和结晶条件（例如沉淀浓度或 pH 值网格），可以获取有关可转移区域限制位置的信息（原子和可转移区域之间的动能平衡）。这是宝贵的，当设计一个成功的晶体生长实验，特别是为新的蛋白质候选在结晶。没有这些信息实验可以从具有高超饱和度的相位图区域开始，离可转移区域的极限太远，无法轻松控制晶体核。虽然可以尝试溶解蛋白质沉淀物，例如，在直接溶解的情况下提高温度，对于热不稳定性降低的蛋白质，将样品保持在高温下较长时间可能会使蛋白质沉淀不可逆转。因此，最佳策略包括使用位于元稳定极限附近的低超饱和度的初始条件，在那里可以控制核，避免蛋白质沉淀。与此相一致，结晶预筛选可降低透析室中蛋白质沉淀的几率，并提高实验的成功率。
在设计实验后，准备透析室（OptiCrys）或微透析按钮是另一个重要步骤。防止透析室/按钮中形成气泡会增加成功结晶的机会，尤其是在使用小体积时。透析室中气泡的存在也可能改变结晶过程的动能，减少实验的可重复性（因为蛋白质/溶液接触表面已被修改）。不仅蛋白质，而且结晶溶液也会影响实验的成功。每次使用新的50 mL管泵送系统，每次想开始一个新的实验和洗涤管后，每个实验减少污染的机会，并避免在仪器中产生盐晶体。
当 OptiCrys 不可用时，使用微透析按钮是另一种选择。优化结晶和监测晶体生长的战略必须手动执行。通常，这需要在热调节的孵化器之外，当温度调节是描述方法的关键一步时，这可能会有问题。这不利于改变结晶溶液的化学成分，也不利于通过成像监测晶体生长，因此晶体生长过程无法实时控制。
阶段图的知识是使用结晶台OptiCrys系统地以自动化方式种植大型高质量晶体的基础。在结晶过程中控制温度、沉淀浓度和pH值等物理化学参数，在整个相图中以明确定义的动能轨迹移动蛋白质溶液平衡。此外，还使用透析膜来调节质量传输，并在结晶室中创建一个受控的梯度，从而影响晶体的大小和质量。因此，使用热力学数据和动能轨迹对于控制结晶过程以生长高质量的晶体至关重要。得益于 OptiCrys，可以使用比以前少得多的材料的序列方法来研究多维空间中的系统相位图。为了证明这种方法，我们在这里提供了一个案例研究与模型蛋白质，鸡蛋清酶。通过使用和掌握这里提出的协议，人们可以适应它的真实蛋白质系统5，14，17，18。

了解蛋白质的结构-功能关系和生理通路的机制往往取决于了解氢原子（H）的位置以及电荷在蛋白质1、2中的转移方式。由于氢原子散射X射线微弱，它们的位置只能用非常高分辨率的X射线衍射数据（+>1+）3，4来确定。相反，中子晶体学可以用来获得氢原子在生物大分子中的准确位置，因为氢原子和铀（H2，氢同位素）原子的散射长度与氧、氮和碳5的散射长度大致相当。然而，来自可用中子源的中子通量比X射线束弱，因此这通常必须补偿2，3。这可以通过与 H2和/或增加晶体体积交换来实现，以减少氢气的不连贯散射，并提高衍射图像的信号与噪声比。
有各种结晶方法（相应的示意图显示在图1）为X射线和中子生物巨分子晶体学6获得大和高质量的晶体。在蒸汽扩散中，通过蒸发水或其他挥发性物种，从蛋白质和结晶溶液混合物中制备的液滴随着时间的推移而平衡在含有相同结晶溶液沉淀物浓度较高的储液层上。蛋白质和沉淀物在液滴中的浓度增加，导致自发核所需的超饱和，随后这些核6，7的晶体生长。虽然蒸汽扩散是生长晶体4最常用的技术，但结晶过程不能精确控制8。在自由接口扩散法中，结晶溶液扩散成浓缩蛋白溶液，非常缓慢地引导系统走向超饱和。此方法可视为具有慢速混合率6、9、10、11、12的批处理方法。在批量方法中，蛋白质与结晶溶液快速混合，导致快速超饱和，进而与许多晶体3、7统一核。此方法约占目前存放在蛋白质数据库中的所有结构的三分之一。透析方法还用于生长高质量和高差异的蛋白质晶体。在透析方法中，沉淀物分子通过半透膜从储层扩散到与蛋白质溶液的单独腔室中。平衡的动力学取决于各种因素，如温度、膜孔径、蛋白质样品和结晶剂的体积和浓度等。
结晶相图可用于描述蛋白质的不同状态作为不同物理或化学变量3的函数。如图1所示，每个结晶技术都可以被形象化为使用不同的动能轨迹到达这样一个图6，10，13的原子核和可转移区域。这提供了有关蛋白质溶解度和蛋白质浓度的信息，其中观察到晶体和溶液之间的热力学平衡，从而找到细胞核和生长的最佳条件3，14。在二维相图中，蛋白质浓度被绘制为一个变量的函数，其他变量保持不变15。在这样的相位图中，当蛋白质浓度低于溶解曲线时，溶液处于饱和区域，并且不发生核或晶体生长。这条曲线上方是蛋白质浓度高于溶解限值3，14的超饱和区。这进一步分为三个区域：可转移区、自发核区和降水区。在可转移区域，超饱和度不足以使核在合理时间内发生，但种子晶体的生长可能发生。在降水区，超饱和量过高的14、15日，降水量和降水量比较多。
当实现足够的超饱和自体核时，第一个核将出现10个。晶体的生长导致蛋白质浓度的降低，直到达到溶解性的极限。只要超饱和度停留在溶解曲线附近，晶体的大小不会有显著变化。然而，已经表明，结晶溶液的温度和化学成分的变化（例如沉淀物的浓度）会影响蛋白质溶解性，并可能导致进一步晶体生长8，13，16。
由于透析有利于优质晶体生长， 图2所示的OptiCrys结晶台在我们的实验室中设计和开发，以全自动的方式控制结晶8。为此目的，使用 LabVIEW 编写了软件，允许通过电子控制器和冷水机组控制和监控与 Peltier 元素接触的流动储层透析设置的温度。同一软件还使用多通道流体系统自动调节结晶溶液的化学成分（例如结晶剂的交换）。此外，数码相机和倒置显微镜用于可视化和记录结晶过程。两个具有 15 μL 和 250 μL 体积的结晶室可用于用于不同用途的生长晶体。由于结晶过程是可逆的，只要样品不损坏8，只需用蛋白质溶液的几微升就可以对不同情况进行筛选。因此，使用这种方法可以最大限度地减少使用蛋白质材料的数量。
从以往的工作8，很明显，在晶体生长过程中， 现场 观测需要定期进行。这些范围从几秒钟到几天不等，具体取决于观测到的事件（沉淀、核或晶体生长）。
OptiCrys晶体生长的优化基于温度沉淀浓度相图。在含有溶解性作为温度直接功能的蛋白质的情况下，可以利用盐化机制18。这是增加溶液的离子强度，可以使用蛋白质沉淀相图可视化，降低蛋白质的溶解性。同样，具有反溶解性的蛋白质可以利用盐化机制18。核发生于可转移区域附近的核区，然后晶体生长在相图的可转移区域，直到蛋白质浓度达到溶解极限。如图3A所示，在恒定的化学成分温度下，可以降低结晶溶液在可转移区域，以防止新的核化。晶体生长，直到达到第二个晶体/溶液平衡，之后，没有观察到晶体大小的进一步增加。温度降低数倍，直到晶体达到所需的大小。在图 3B中，在恒定温度下，增加沉淀浓度可使溶液保持在可转移区域。然后，这个过程可以重复几次，以获得大晶体。改变温度和操纵结晶溶液条件，通过控制超饱和水平，是两个强大的工具，分离晶体的核化和生长，由OptiCrys5，8，14精确和自动控制。
文献和PDB中提供了由温度控制或温度和沉淀浓度控制结晶生长的蛋白质晶体的例子，以及获得的相对衍射数据。其中有人类γ晶蛋白E、PA-IIL叶酸、酵母无机热磷酸酶、尿酸氧化酶、人碳水合物II、YchB激酶和乳酸脱氢酶5、14、17、18。
虽然 OptiCrys 由 NatX 射线商业化，但有许多实验室无法访问此仪器或它提供的序列方法。该技术的替代方案是使用具有不同体积的市售塑料微透析按钮。使用这些，温度和化学成分可以手动调整和变化。微透析按钮的检查不能就地进行，而必须用光学显微镜手动完成。通过将样品保存在无振动温度控制的孵化器中，可以实现温度控制。必须保持温度恒定，以确保结晶实验是可重复的。温度的显著变化也可能导致晶体的损坏或破坏。
在这里，我们提供了一个详细的协议，描述样品准备和控制软件的使用，用于生长大型，高品质的晶体适合中子蛋白晶体学。此分步过程旨在利用结晶相图来选择起始位置和动能路径，以控制生成的晶体的大小和质量。此外，还介绍了使用微透析按钮种植晶体的详细协议，该方案使用相同的原理来获取大型高质量晶体。

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>200 &#181;l Dialysis Button</td>
			<td>Hampton Research</td>
			<td>HR3-330</td>
			<td>Dialysis button</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24 well plates</td>
			<td>Jena Bioscience</td>
			<td>CPL-132</td>
			<td>Crystallization plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Switch</td>
			<td>FLUIGENT</td>
			<td>2SW001</td>
			<td>Switch</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>30 &#956;l Dialysis Button</td>
			<td>Hampton Research</td>
			<td>HR3-324</td>
			<td>Dialysis button</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL Corning Centrifuge tubes</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>CLS430828-500EA</td>
			<td>Centrifuge tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S2889</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chicken Egg White Lysozyme</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L6876</td>
			<td>Lyophilized protein powder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dialysis Membrane Discs 6-8 kDa MWCO</td>
			<td>Spectrum</td>
			<td>132478</td>
			<td>Dialysis membrane</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dialysis Membrane Tubing 6-8 kDa MWCO</td>
			<td>Spectrum</td>
			<td>132650T</td>
			<td>Dialysis membrane</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>Minispin</td>
			<td>Bench-top centrifuge</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow Unit</td>
			<td>FLUIGENT</td>
			<td>FLU-XL</td>
			<td>Flow meter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flowboard</td>
			<td>FLUIGENT</td>
			<td>FLB</td>
			<td>Flowboard</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microfluidic Flow Control System EZ</td>
			<td>FLUIGENT</td>
			<td>EZ-01000002</td>
			<td>Pressure/vacuum controller</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MilliporeSigma 0.22 &#181;m syringe Filters</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>GSWP04700</td>
			<td>0.22 &#956;m pore size filter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M-Switch</td>
			<td>FLUIGENT</td>
			<td>MSW002</td>
			<td>Rotary valve</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opticrys</td>
			<td>NatX-ray</td>
			<td>PRT008</td>
			<td>Crystallization bench</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Siliconized circle cover slides</td>
			<td>Hampton Research</td>
			<td>HR3-231</td>
			<td>Glass slides</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride &#8805; 99%</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>746398</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Switchboard</td>
			<td>FLUIGENT</td>
			<td>SWB002</td>
			<td>Switchboard</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermoregulated incubator</td>
			<td>Memmert</td>
			<td>IPP30</td>
			<td>Thermoregulated incubator</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

optimization of crystal growth for neutron macromolecular crystallography

中子大分子晶体学 （NMX） 的使用正在迅速扩大，由于新建了 NMX 光束线并增加了结构优化软件的可用性，大多数结构在过去十年中已确定。然而，目前可用于NMX的中子源明显弱于X射线晶体学的等效源。尽管这一领域取得了进展，但中子衍射研究始终需要更大的晶体，特别是研究更大的大分子和复合物的倾向。因此，为了扩大使用NMX，有必要进一步改进适合种植大型晶体的方法和仪器。
在这项工作中，我们引入了合理的策略和在实验室中开发的晶体生长台（OptiCrys），通过显微镜安装的摄像机将实时观测与晶体溶液的精确自动控制（例如沉淀物浓度、pH、添加剂、温度）相结合。然后，我们演示了这种对温度和化学成分的控制如何促进使用模型可溶性蛋白质寻找最佳结晶条件。对结晶相图的透彻了解对于选择任何结晶实验的起点和动能路径至关重要。我们展示了一种理性的方法如何控制基于多维相位图知识生成的晶体的大小和数量。

在第 2.3 节和第 2.4 节中，介绍了优化晶体生长的三个示例，显示了仪器的使用和种植大型晶体的实验设计。对于这个演示，我们已经使用酶作为模型蛋白质，虽然晶体生长实验已经成功地与许多其他蛋白质系统使用这种方法（见上文）。通过使用和掌握此处提出的协议，可以针对其他蛋白质候选者进行调整。
在第2.3节中，我们证明，建立合理的结晶策略可以有利于培育具有足够散射体积的中子蛋白晶体的晶体。在这里，我们表明，建议的合理优化战略也允许产生一个统一的晶体种群，任何特定大小所需的下游结构确定方法。
这两个实验旨在强调相位图在控制晶体核化和生长方面的重要性。在这里，控制结晶溶液的温度和化学成分，结合实时监测结晶过程，用于研究定性相图。使用这种方法，可以以可逆的方式合理优化核和晶体生长。使用这种连续方法还可以减少蛋白质的数量和控制晶体大小和质量所需的时间。
在透析方法中，蛋白质溶液通过半透膜6（图5）从结晶溶液中分离出来。这种透析膜允许小分子，如添加剂，缓冲液和离子通过膜，但不是大分子，如蛋白质6，20。此功能允许在实验6过程中修改结晶溶液。交换解决方案可以手动完成，例如在微透析按钮中，或使用为此目的开发的仪器 OptiCrys8以自动方式进行。
在第一组实验中，微透析按钮用于鸡蛋清溶酶的结晶。微透析按钮浸入不同盐浓度的结晶溶液中。在这个简单的结晶网格实验中，唯一的变量是沉淀浓度，而温度保持不变（293 K）。如 图4所示，盐浓度的微小变化导致观察到的晶体大小和数量发生变化，从而可以研究结晶相图。在 图 4中，面板 1 中，结晶溶液包含 0.7 M NaCl，按钮中出现了数量有限的较大晶体。通过将盐浓度从0.7米提高到1.2米，超饱和度增加，核区的溶液从可转移区域移开（图4，面板1至6）。因此，晶体的数量增加，其大小减少。
在第一个全自动仪器的实验，使温度控制透析结晶，OptiCrys（图9），晶体生长实验是量身定做的，以产生较大的晶体生长。实验在295K的初始温度下启动，结晶溶液含有0.75M NaCl和0.1M纳醋酸盐缓冲液pH4。在这些实验条件下，结晶溶液到达相图可转移区域附近的核区（图9，箭头1）。因此，在实验的第一阶段只生成了几个核。为了进一步培育选定的晶体（ 如图9所示），晶体生长优化工作流程在达到晶体溶液平衡后，通过不同的温度向可转移区域驱动。
每次达到晶体和溶液之间的平衡时，温度都会降低，首先降至291K，然后降至288K，最后降至275K，以将结晶溶液保持在可转移区域。本实验的结果是单个大型晶体，适用于大分子X射线和中子晶体学。
对于大多数蛋白质来说，由于在结晶实验18中缺乏能够准确测量蛋白质浓度（或只是实时观察/检测结晶过程）的实验设备，因此尚未获得精确的定量相图（或只是一个定性图）。因此，通常无法设计实验的方式，使结晶从相图的最佳区域开始，在可转移区域附近。
因此，在进行大体积晶体生长实验之前，必须进行结晶优化研究。在这项研究中，一方面使用温度变化（以恒定的化学成分）和化学成分的变化（在恒定的温度下），确定可转移区域并确定启动大型晶体生长实验的最佳条件。
为此，还进行了另外两项实验，这些实验是经过量身定做的，以证明利用 OptiCrys 进行温度控制透析结晶实验的可逆性，用于核化、晶体生长、溶解和再生长。控制晶体生长优化工作流程，利用温度变化或沉淀浓度，培育出数量较少、较大的淋酶晶体。
在 OptiCrys 的第二次实验中，结晶溶液的化学成分在整个实验中保持不变（0.9 M NaCl 在 0.1 M CH3COONa pH 4 中），温度变化。初始温度设定为 291 K。这个实验的结果总结在 图10中。由于超饱和性高，结晶室中出现了大量小晶体（图10、面板1和2）。按照直接蛋白质溶解的概念，通过逐渐将温度提高到313K，所有的晶体都溶解了（图10，面板3，4和5）。最后，通过将温度降低到295K，第二个核在可转移区域附近启动，并允许控制形成数量较低的核。进一步的晶体生长导致大晶体的均匀生成（图10，面板7）。
如 图11所示，结晶溶液的化学成分变化，在291K的恒温下，同样可用于获得更大的晶体的均匀种群。与之前的实验类似，初始条件为 0.9 M NaCl 在 0.1 M CH3COONa pH 4 中。然后，NaCl浓度从0.9米逐渐降低到零，以溶解晶体（图11，面板4和5）。此时，NaCl 完全被 0.1 M CH3COONa pH 4 的缓冲液所取代。降低盐浓度使溶液保持在相图的饱和区，导致晶体溶解。然后，在0.1 M CH3COONa pH 4中注入了离子强度较低的新型结晶溶液，在0.75 M NaCl下注入储层室。在这个沉淀的浓度下，第一个核在90分钟后出现（图11，面板6）。生成的晶体数量比以前更低，晶体体积更大（图11，面板7）。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61685/61685fig1v3.jpg"> 图1：示意图相图。三种结晶技术的动能轨迹表现在盐化机制中。每种方法都以不同的方式实现核和结晶，通过相图通过不同的动能通路进行可视化，以到达原子核和可转移区域。溶解曲线将饱和度和超饱和区域分开。超饱和分为三个区域：可转移、核和降水。在核区，自发核发生，而在可转移区域晶体生长发生。此图改编自朱纽斯 等人。8<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61685/61685fig1v3large.jpg" target="_blank">请点击这里查看此数字的较大版本。</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61685/61685fig02.jpg"> 图2：结晶台（OptiCrys）的示意图表示。LED光源位于温度控制透析流体的顶部。倒置显微镜和数码相机用红色箭头显示在图像的右上角。红色圆圈表示冷水机组管的位置。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61685/61685fig02large.jpg" target="_blank">请点击这里查看此数字的较大版本。</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61685/61685fig03.jpg"> 图3：示意图二维蛋白质结晶相图作为温度 （A） 和沉淀浓度 （B） 的函数。（A） 如果蛋白质具有直接溶解性，降低温度可使结晶溶液保持在可转移区域。温度变化可以重复几次，以控制晶体的生长过程，直到获得具有所需体积的晶体。（B） 改变沉淀溶液的浓度也可用于将结晶溶液保存在可转移区域，用于种植晶体。此图改编自朱纽斯 等人。8<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61685/61685fig03large.jpg" target="_blank">请点击这里查看此数字的较大版本。</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61685/61685fig04.jpg"> 图4：利用透析方法获得的溶酶晶体。此实验是在 0.1 M 醋酸钠缓冲 pH4 中恒温 293 K 进行的。将NaCl浓度从0.7M提高到1.2M会提高核率，并导致更多的晶体。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61685/61685fig04large.jpg" target="_blank">请点击这里查看此数字的较大版本。</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61685/61685fig05.jpg"> 图5：透析方法对蛋白质结晶过程的概述。（A） 通过将蛋白质添加到透析按钮的腔室中，（B） 在腔室顶部创建一个圆顶形状。（C） 使用施用器将 O 环转移到透析按钮的凹槽中，以便修复透析膜的位置。（D） 透析按钮已准备好浸入储层溶液中。（E） 结晶溶液穿过半透膜，晶体开始在腔内形成。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61685/61685fig05large.jpg" target="_blank">请点击这里查看此数字的较大版本。</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61685/61685fig06.jpg"> 图6：温度控制流动透析设置的示意图视图。（A） 蛋白质样本添加到透析室。（B） 透析膜使用施用器固定在带 O 形环的过腔器上。（C） 过度的隔膜被打开并固定在透析室的顶部。白色箭头指示螺钉放置在过仓上的位置。（D） 储层室顺时针转动 （E），并固定在过蓄水池的顶部。（F） 储层腔室被密闭的盖子覆盖，与抽水系统的连接器相连，（G） 流动电池放置在黄铜支架中。此图改编自朱纽斯 等人。8<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61685/61685fig06large.jpg" target="_blank">请点击这里查看此数字的较大版本。</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61685/61685fig07.jpg"> 图7：由流体系统（A）在储层中制备和注入结晶溶液。含有盐和水的管子连接到压力/真空控制器 （B） 和旋转阀 （C）。通过使用压力，压力/真空控制器创建液体从管子到旋转阀的恒定流动。每个液体通过流量计 （D） 和开关被注入混合管 （F）。一旦所有液体都添加到搅拌管中，通过一些修改的开关将最终溶液从搅拌管注入储层 （G）。液体以按升序标记的图表中箭头的方向流过系统（从 1 到 6）。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61685/61685fig07large.jpg" target="_blank">请点击这里查看此数字的较大版本。</a>
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61685/61685fig8v2.jpg"> 图8：监督软件的维护视图。此视图用于控制不同的参数，如温度、光线、结晶溶液和变焦。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61685/61685fig8v2large.jpg" target="_blank">请点击这里查看此数字的较大版本。</a>
<img alt="Figure 9" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61685/61685fig09.jpg"> 图9：相位图作为温度函数（选定的图像将按上升顺序进行跟踪）。单个大型酶晶体通过系统地将温度从295K变为275K而获得。在每一步，晶体生长在到达溶解曲线时停止。通过将溶液保持在可转移区域来降低温度，可重新启动晶体生长。图像具有不同程度的放大倍率。此图改编自朱纽斯 等人。8，18<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61685/61685fig09large.jpg" target="_blank">请点击这里查看此图的较大版本。</a>
<img alt="Figure 10" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61685/61685fig10.jpg"> 图10：使用温度控制在恒定的化学成分下优化晶体生长（选定的图像将按上升顺序进行跟踪）。在距离可转移区域较远的291K核区启动核过程，导致许多晶体的形成。将温度提高到313K，然后溶解晶体，直到透析室中看不到可见的核。最后，将温度降低到295K会第二次重启核过程，导致数量有限的大型晶体。此图改编自朱纽斯 等人。8，18<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61685/61685fig10large.jpg" target="_blank">请点击这里查看此图的较大版本。</a>
<img alt="Figure 11" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61685/61685fig11.jpg"> 图11：利用沉淀浓度的变化，在恒定温度下优化晶体生长（选定的图像将按上升顺序进行跟踪）。将沉淀浓度从0.9M降低到0M会溶解在第一次核事件中获得的晶体。结晶过程通过注射相同的沉淀物重新启动，但离子强度较低，0.75 M，导致形成几个较大的晶体。此图改编自朱纽斯 等人。8，18<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61685/61685fig11large.jpg" target="_blank">请点击这里查看此图的较大版本。</a>

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Optimization of Crystal Growth for Neutron Macromolecular Crystallography

通过晶体学对生物分子进行结构研究需要高质量的晶体。在这里，我们演示了 OptiCrys（在我们的实验室中开发的全自动仪器）和/或微透析按钮可用于基于结晶相图知识种植大型高质量晶体的协议。

中子大分子晶体学晶体生长优化

The use of neutron macromolecular crystallography (NMX) is expanding rapidly with most structures determined in the last decade thanks to new NMX ...

获得X射线和中子晶体学的大而高质量的晶体有不同的结晶方法。其中一种方法是使用透析方法。在这项技术中，蛋白质溶液通过半透膜与沉淀溶液分离。沉淀分子在膜上扩散到蛋白质室。当实现自发核的正确超饱和时，将出现第一个核。在这里，我们将演示 OptiCrys 在我们的实验室中开发的全自动仪器，该仪器使用温度控制透析结晶，以及我们的微透析按钮，用于根据结晶相图的知识为自然大分子晶体学培养大型高质量晶体。用于微透析按钮与某些微升体积移液器35微升溶酶溶液进入透析室。这种额外的体积在透析室顶部创建一个略带圆顶的形状，并防止气泡的形成。拿一个施用器，把弹性或环放在它的四肢。将膜放在腔室顶部，然后通过将弹性或环从施用器转移到透析按钮的凹槽来修复它。将按钮转移到包含结晶溶液的井中。用玻璃盖滑或胶带盖住井。将样品保持在 293 开尔文无振动热调节器中。知道透析结晶从晶体生长的角度提供了优势，我们实验室设计开发了所谓的OptiCrys结晶台，为生物分子结晶实验的温度和化学成分提供全自动的综合控制。OptiCrys 对晶体生长的优化基于温度沉淀浓度相图。核发生于可转移区域附近的核区，然后晶体生长在相后图的可转移区域发生，直到蛋白质浓度达到代表溶液和晶体之间热力平衡的溶解曲线。通过降低具有直接溶解性的蛋白质的温度，或在盐渍到达时增加沉淀浓度，结晶溶液保持在可转移区域，并且不发生核化。晶体生长，直到第二个晶体溶液平衡达到，之后，没有进一步增加晶体的大小。降低温度或增加沉淀浓度重复几次，直到晶体达到所需的大小。将蛋白质溶液添加到温度控制流动设置的透析室中，用透析膜覆盖透析室，用弹性或环固定膜。翻转过室，放在透析室的顶部。轻轻而缓慢地按压它，以清除夹在两块之间的所有空气，通过轻轻地拧在过腔室的顶部来修复储层的位置。将结晶溶液添加到储层腔室中，并通过密封盖盖住它。转移此组件并将其插入结晶台 OptiCrys 晶体生长的乳房支撑中，是结晶台 OptiCrys 的监控软件。它包括四个不同的图形界面或视图。主视图包含导航到其他视图的按钮。设置界面的目的是定义可以在测试视图中自动运行的实验场景。最后一个视图是维护视图。要重新启动实验，必须打开维护视图，找到晶体实验平滑运行的所有基本参数。增加光段的亮度，光可以从零、无光增加到100最大亮度。用于控制和监测温度，使用温度调节器部分。单击按钮将其打开。设置设定点部分的温度并按下输入。在此按钮下方有两个图形。红色表示最终温度，顺序温度和黄色图形显示当前温度。混合库存溶液后，向储层腔室注入结晶溶液由棕榈部分控制。在第一阶段添加库存解决方案的集中度。然后找到每个新的分组解决方案的最终浓度，并将它们添加到最终浓度部分。按下计算按钮后，将计算库存解决方案的体积，并在每个集中面板前的音量面板中添加。按下启动准备按钮，等待新的首要解决方案准备好。要交换结晶解决方案，请单击"解决方案输入"按钮。要停止此过程，请按"停止分发"按钮。在显微镜部分的右侧，有几个面板用于记录每个晶体生长实验的重要信息。在此部分添加相应的蛋白质名称、分子重量和结晶条件。只需在文件夹名称上键入实验名称，即可定义其名称。从 nb 图像部分，选择在实验期间应拍摄的图像数量。添加图像的数量，并从右侧的面板中选择时间器刻度。单击文件夹按钮以打开文件夹。在此文件夹中，有一个文本文件，包含您以前为实验定义的所有信息。此文件夹中还保存了准备进行进一步治疗的图像。缩小显微镜也可以自动改变。使用显微镜部分顶部的正负按钮分别增加或减少放大倍数来更改缩放。测量晶体大小有三种不同的方法。用于测量长度或宽度，请使用宽度向量。根据晶体形状，可以选择显微镜部分左侧的特定工具。如矩形或多边形。值将显示在测量部分。在第一组实验中，微透析按钮浸入不同盐浓度的结晶溶液中。在这个简单的结晶网格实验中，唯一的变量是沉淀浓度。而温度保持不变。盐浓度的微小变化允许通过将盐浓度从0.7提高到1.2摩尔超饱和度增加来研究结晶相图，核区的溶液正在远离可转移区域。因此，观察到晶体的大小和数量随着晶体数量的增加及其大小的减少而变化。在给定实验条件下的OptiCrys实验中，一旦透析室的平衡达到，结晶溶液就位于结晶相图可转移区域附近的核区。因此，在实验的第一阶段只生成几个原子核。为了保持晶体在可转移区域的生长，控制晶体的生长过程，温度在不同的时间间隔变化。每次完成晶体溶液平衡时，温度都会变化。因此，温度下降到291开尔文，288开尔文，最后275开尔文，以保持选定的晶体生长在可转移区。这个实验的结果是一个单一的大晶体，与自然大分子晶体所需的体积。接下来的两项实验演示了温度控制透析实验的可逆性，用于核化、晶体生长、溶解和再生。在第二次OptiCrys实验中，结晶溶液的化学成分通过实验保持恒定，温度也随之变化。最初的温度定在291开尔文。由于超饱和性高，结晶室中出现了大量的小晶体。按照直接蛋白质溶解的概念，通过逐渐将温度提高到313开尔文，所有的晶体都溶解了。最后，通过将温度降低到295开尔文，第二个核在可转移区域附近启动，并允许控制核过程，从而形成较低的核数量。进一步的晶体生长允许产生更大的晶体的均匀种群。在这个实验中，在恒定温度下改变结晶溶液的化学成分，从而获得更大的晶体的均匀种群。结晶条件与以前的实验相似。溶解晶体是通过逐渐将NaCl浓度从0.9摩尔降低到零来实现的。降低盐浓度使溶液保持在相图的饱和区，导致晶体溶解。然后，新的结晶溶液与以前的离子强度较低被注入储层室。在此沉淀浓度下，出现的晶体数量较低，晶体体积也比以前更大。在这里，我们提供了一个详细的协议，描述样品准备和调整控制软件种植大和高品质的晶体自然大分子晶体学使用全自动仪器在我们的实验室开发。这个分步过程的设计和受益于结晶相图的知识，以分离核和晶体生长。此外，在 OptiCrys 不可用时，还使用大细胞按钮作为替代方法，提出了一个具有微细胞病模式的生长晶体的协议。除了我提到的 OptiCrys 改变结晶溶液的化学成分和温度以及拍摄图像的策略外，还应手动完成。需要利用热调节振动使孵化器保持温度恒定，这是所证明的方法的关键一步。

Research

JoVE Journal

Biology

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