Name: optimization of crystal growth for neutron macromolecular crystallography
Uploaded: 2021-03-13T14:00:00
Duration: 12 min 29 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Optimization of Crystal Growth for Neutron Macromolecular Crystallography at JoVE.com

MBS anerkender støtten fra LABEX VALO GRAL i henhold til kontrakten 2015. NJ anerkender CEA's International Ph.d.-forskningsprogram (Irtelis) for ph.d.-stipendiet. Forfattere anerkender finansiering fra EU's Horizon 2020 Research and Innovation Program under Marie Skłodowska-Curie tilskudsaftale nummer 722687. Forfatterne er også taknemmelige for Dr. Esko Oksanen (ESS, Lund) og Dr. Jean-Luc Ferrer (IBS, Grenoble) for nyttige samtaler og indsigter. IBS anerkender integration i Grenobles tværfaglige forskningsinstitut (IRIG, CEA).

<ol>
	<li>Blakeley, M. P., Langan, P., Niimura, N., Podjarny, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutron+crystallography:+opportunities,+challenges,+and+limitations.">Neutron crystallography: opportunities, challenges, and limitations.</a> Current Opinion in Structural Biology. 18 (5), 593-600 (2008).</li><li>Snell, E. H., Van Der Woerd, M. J., Damon, M., Judge, R. A., Myles, D. A. A., Meilleur, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimizing+crystal+volume+for+neutron+diffraction:+D-xylose+isomerase.">Optimizing crystal volume for neutron diffraction: D-xylose isomerase.</a> European Biophysics Journal. 35 (7), 621-632 (2006).</li><li>Ng, J. D., Baird, J. K., Coates, L., Garcia-Ruiz, J. M., Hodge, T. A., Huang, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large-volume+protein+crystal+growth+for+neutron+macromolecular+crystallography.">Large-volume protein crystal growth for neutron macromolecular crystallography.</a> Acta Crystallographica Section F:Structural Biology Communications. 71, 358-370 (2015).</li><li>O'Dell, W. B., Bodenheimer, A. M., Meilleur, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutron+protein+crystallography:+A+complementary+tool+for+locating+hydrogens+in+proteins.">Neutron protein crystallography: A complementary tool for locating hydrogens in proteins.</a> Archives of Biochemistry and Biophysics. 602, 48-60 (2016).</li><li>Oksanen, E., Blakeley, M. P., Bonnet&#233;, F., Dauvergne, M. T., Dauvergne, F., Budayova-Spano, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large+crystal+growth+by+thermal+control+allows+combined+X-ray+and+neutron+crystallographic+studies+to+elucidate+the+protonation+states+in+Aspergillus+flavus+urate+oxidase.">Large crystal growth by thermal control allows combined X-ray and neutron crystallographic studies to elucidate the protonation states in Aspergillus flavus urate oxidase.</a> Journal of the Royal Society Interface. 6, (2009).</li><li>Krauss, I. R., Merlino, A., Vergara, A., Sica, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+overview+of+biological+macromolecule+crystallization.">An overview of biological macromolecule crystallization.</a> International Journal of Molecular Sciences. 14 (6), 11643-11691 (2013).</li><li>Chayen, N. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+Studies+of+Protein+Crystallization+by+Vapour-Diffusion+and+Microbatch+Techniques.">Comparative Studies of Protein Crystallization by Vapour-Diffusion and Microbatch Techniques.</a> REVIEW Acta Cryst. , (1998).</li><li>Junius, N., Oksanen, E., Terrien, M., Berzin, C., Ferrer, J. L., Budayova-Spano, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+crystallization+apparatus+for+temperaturecontrolled+flow-cell+dialysis+with+real-time+visualization.">A crystallization apparatus for temperaturecontrolled flow-cell dialysis with real-time visualization.</a> Journal of Applied Crystallography. 49, 806-813 (2016).</li><li>Salemme, F. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+free+interface+diffusion+technique+for+the+crystallization+of+proteins+for+X-ray+crystallography.">A free interface diffusion technique for the crystallization of proteins for X-ray crystallography.</a> Archives of Biochemistry and Biophysics. 151 (2), 533-539 (1972).</li><li>Chayen, N. E., Saridakis, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+crystallization:+From+purified+protein+to+diffraction-quality+crystal.">Protein crystallization: From purified protein to diffraction-quality crystal.</a> Nature Methods. 5 (2), 147-153 (2008).</li><li>Ot&#225;lora, F., Gavira, J. A., Ng, J. D., Garc&#237;a-Ruiz, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Counterdiffusion+methods+applied+to+protein+crystallization.">Counterdiffusion methods applied to protein crystallization.</a> Progress in Biophysics and Molecular Biology. 101 (1-3), 26-37 (2009).</li><li>Garci&#225;-Ruiz, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Counterdiffusion+Methods+for+Macromolecular+Crystallization.">Counterdiffusion Methods for Macromolecular Crystallization.</a> Methods in Enzymology. 368, 130-154 (2003).</li><li>Budayova-Spano, M., Koruza, K., Fisher, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large+crystal+growth+for+neutron+protein+crystallography.">Large crystal growth for neutron protein crystallography.</a> Methods in Enzymology. 634, 21-46 (2020).</li><li>Budayova-Spano, M., Dauvergne, F., Audiffren, M., Bactivelane, T., Cusack, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+methodology+and+an+instrument+for+the+temperature-controlled+optimization+of+crystal+growth.">A methodology and an instrument for the temperature-controlled optimization of crystal growth.</a> Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography. 63 (3), 339-347 (2007).</li><li>Asherie, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+crystallization+and+phase+diagrams.">Protein crystallization and phase diagrams.</a> Methods. 34 (3), 266-272 (2004).</li><li>Astier, J. P., Veesler, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+temperature+to+crystallize+proteins:+A+mini-review.">Using temperature to crystallize proteins: A mini-review.</a> Crystal Growth and Design. 8 (12), 4215-4219 (2008).</li><li>Budayova-Spano, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+preliminary+neutron+diffraction+study+of+rasburicase,+a+recombinant+urate+oxidase+enzyme,+complexed+with+8-azaxanthin.">A preliminary neutron diffraction study of rasburicase, a recombinant urate oxidase enzyme, complexed with 8-azaxanthin.</a> Acta Crystallographica Section F: Structural Biology and Crystallization Communications. 62 (3), 306-309 (2006).</li><li>Junius, N., Vahdatahar, E., Oksanen, E., Ferrer, J. L., Budayova-Spano, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+crystallization+of+biological+macromolecules+using+dialysis+combined+with+temperature+control.">Optimization of crystallization of biological macromolecules using dialysis combined with temperature control.</a> Journal of Applied Crystallography. 53 (3), (2020).</li><li>Grimsley, G. R., Pace, C. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spectrophotometric+Determination+of+Protein+Concentration.">Spectrophotometric Determination of Protein Concentration.</a> Current Protocols in Protein Science. 33 (1), 1-9 (2003).</li><li>McPherson, A., Gavira, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Introduction+to+protein+crystallization.">Introduction to protein crystallization.</a> Acta Crystallographica Section F:Structural Biology Communications. 70 (1), 2-20 (2014).</li><li>McPherson, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Introduction+to+protein+crystallization.">Introduction to protein crystallization.</a> Methods. 34 (3), 254-265 (2004).</li></ol>

Forfatterne har intet at afsløre.

Forskellige fysiske, kemiske og biologiske variabler påvirker proteinkrystallisering ved at påvirke proteinopløseligheden21. Blandt disse variabler anvendes temperatur og kemisk sammensætning af krystalliseringsopløsningen her i kombination med dialyseteknik til at forbedre og dyrke store højkvalitetskrystaller af biomacromolecules til neutron diffraktionsundersøgelser. Ved at bruge viden om fasediagrammer gøres krystallisering mere forudsigelig. Selv om screening af forskellige krystalliseringsforhold i en seriel tilgang også er mulig, er hovedformålet med at bruge de fremlagte rationelle tilgange at adskille og kontrollere kinetik af krystalkerner og vækst.
I lighed med alle krystalliseringsundersøgelser øger rene og homogene proteinprøver af høj kvalitet og støvfri krystalliseringsløsninger eksperimentets succesrate. Filtrering og centrifugering af løsninger er væsentlige trin i de beskrevne protokoller. Kendskab til de fysiskkemiske egenskaber af de undersøgte proteiner såsom den molekylære vægt (for at vælge den passende dialysemembran), det isoelektriske punkt og proteinopløseligheden er afgørende for udformningen af et optimalt krystalvæksteksperiment. Der skal også tages hensyn til proteinstabilitet ved forskellige temperaturer eller med forskellige kemikalier for at forhindre tab af prøver og øge sandsynligheden for succes. I betragtning af temperaturområdet OptiCrys (233,0-353,0 ± 0,1 K) kan en bred vifte af proteiner krystalliseres ved hjælp af det. Men det er værd at understrege, at proteiner, der primært er termostalde, såsom proteiner fra termofile kilder, ville gavne mest i temperaturstyrede store volumen krystalvæksteksperimenter, der tilbydes af dette instrument.
Ved hjælp af et lavvolumendialysekammer (ved brug af OptiCrys) eller mikroanalyseknapper og screening af flere temperaturer og krystalliseringsforhold (f.eks. gitter af præcipitantkoncentration eller pH) er det muligt at få oplysninger om placeringen af grænsen for den metastable zone (kinetisk ligevægt mellem nukleations- og metastable zoner). Dette er uvurderligt, når man designer et vellykket krystalvæksteksperiment specielt til nye proteinkandidater i krystallisering. Uden disse informationseksperimenter kan man starte fra et område i fasediagrammet med høj overmætning, for langt fra grænsen for den metastable zone til nemt at kontrollere krystalkerner. Selv om opløsning af proteinudfældning kan forsøges, kan det for eksempel ved at øge temperaturen i tilfælde af direkte opløselighed for proteiner med reduceret termostabilitet gøre prøven ved høj temperatur i længere tid gøre proteinudfældning irreversibel. Således består den bedste strategi i at bruge en indledende tilstand med lavere overmætning placeret nær grænsen for metastability, hvor nukleation kan kontrolleres og proteinudfældning undgås. I overensstemmelse med dette reducerer krystallisering prescreening chancen for at få et proteinudfældelse i dialysekammeret og øger eksperimentets succesrate.
Efter at have designet et eksperiment er forberedelse af dialysekamre (OptiCrys) eller mikrodialyseknapper et andet vigtigt skridt. Forebyggelse af dannelse af luftbobler i dialysekammeret/-knappen øger risikoen for vellykket krystallisering, især når der anvendes små mængder. Tilstedeværelsen af luftbobler i dialysekammeret kan også ændre krystalliseringsprocessens kinetik og reducere forsøgets reproducerbarhed (fordi protein/opløsningens kontaktflade er blevet ændret). Ikke kun protein, men også krystalliseringsløsning kan påvirke eksperimentets succes. Brug af nye 50 mL rør til pumpesystemet, hver gang man ønsker at starte et nyt eksperiment og vaskeslanger efter hvert eksperiment, mindsker risikoen for forurening og undgår at skabe saltkrystaller i apparatet.
Brugen af mikrodialyseknapper er et alternativ, når OptiCrys ikke er tilgængelig. Strategierne for optimering af krystallisering og overvågning af krystalvækst, der er nævnt ovenfor, skal udføres manuelt. Dette kræver typisk at være uden for en thermoregulated inkubator, hvilket kan være problematisk, når temperaturregulering er et kritisk skridt i den beskrevne metode. Dette letter ikke at ændre krystalliseringsopløsningernes kemiske sammensætning eller overvåge krystalvækst ved billeddannelse, så krystalvækstprocessen kan ikke styres i realtid.
Kendskab til fasediagrammet er grundlaget for at bruge krystalliseringsbænken, OptiCrys, til systematisk at dyrke store krystaller af høj kvalitet på en automatiseret måde. Kontrol af fysiskkemiske parametre som temperatur, præcipitantkoncentration og pH under krystallisering flytter proteinopløsningsligevægten i en veldefineret kinetisk bane på tværs af fasediagrammet. Dette suppleres af brugen af en dialysemembran til at justere massetransport og skabe en kontrolleret gradient i krystalliseringskammeret, der påvirker krystallernes størrelse og kvalitet. Derfor er det vigtigt at bruge både termodynamiske data og kinetiske baner for at kontrollere krystalliseringsprocessen for at vokse krystaller af høj kvalitet. Takket være OptiCrys kan systematiske fasediagrammer i et flerdimensionalt rum studeres med en seriel tilgang ved hjælp af betydeligt mindre materiale end før. For at demonstrere denne metode leverer vi her et casestudie med et modelprotein, kyllingæghvid lysozym. Ved at bruge og mestre den protokol, der præsenteres her, kan man tilpasse den til rigtige proteinsystemer5,14,17,18.

Forståelse af proteiners strukturfunktionsforhold og mekanismen for fysiologiske veje afhænger ofte af at kende placeringen af hydrogenatomer (H), og hvordan ladning overføres inden for et protein1,2. Da brintatomer spreder røntgenstråler svagt, kan deres positioner kun bestemmes med røntgendiffraktionsdata med meget høj opløsning (>1 Å)3,4. Omvendt kan neutronkrystallografi bruges til at opnå en nøjagtig position af hydrogenatomer i biologiske makromolekyler, da brint og deuteriumatomer (H2, hydrogenisotop) har spredningslængder af nogenlunde samme størrelsesorden som ilt, nitrogen og kulstof5. Neutronflux fra tilgængelige neutronkilder er imidlertid svagere end røntgenstråler, så dette skal ofte kompenseres for2,3. Dette kan opnås ved at udskifte H med H2 og/eller øge mængden af krystaller for at reducere den usammenhængende spredning af brinter og øge signal-til-støj-forholdet for diffraktionsbilleder.
Der er forskellige krystalliseringsmetoder (det tilsvarende skematiske fasediagram er vist i figur 1) til opnåelse af store krystaller af høj kvalitet til både røntgen og neutronbiomakromolekylær krystallografi6. Ved dampspredning udslibres en dråbe fremstillet af en blanding af et protein og en krystalliseringsopløsning over tid gennem fordampning af vand eller andre flygtige arter mod et reservoir, der indeholder en højere koncentration af præcipitant af samme krystalliseringsopløsning. Stigningen i koncentrationen af protein og præcipitant i dråben fører til den overmætning, der kræves til spontan nukleation efterfulgt af krystalvækst ved disse kerner6,7. Selvom dampdiffusion er den hyppigst anvendte teknik til dyrkning afkrystaller 4, kan krystalliseringsprocessen ikke styres præcist8. I den frie grænseflade diffusion metode, krystallisering løsning diffunderer i en koncentreret proteinopløsning, meget langsomt lede systemet i retning af overmætning. Denne metode kan betragtes som en batchmetode med en langsom blandingshastighedpå 6,9,10,11,12. I batchmetoden blandes proteinet hurtigt med en krystalliseringsopløsning, der fører til hurtig overmætning og til gengæld ensartet kernedannelse med mangekrystaller 3,7. Denne metode tegner sig for ca. en tredjedel af alle strukturer, der i øjeblikket deponeres i Protein Data Bank. Dialysemetoden bruges også til dyrkning af højkvalitets og godt spredende proteinkrystaller. I dialysemetoden spredes molekyler af præcipitant fra et reservoir gennem en semipermeabel membran ind i et separat kammer med proteinopløsningen. Ækvilibreringens kinetik afhænger af forskellige faktorer, såsom temperatur, membranporestørrelse og volumen og koncentration af proteinprøver og krystalliseringsmidler6.
Krystalliseringsfasediagrammer kan bruges til at beskrive forskellige tilstande af et protein som en funktion af forskellige fysiske eller kemiskevariabler 3. Som illustreret i figur 1kan hver krystalliseringsteknik visualiseres ved hjælp af en anden kinetisk bane for at nå nukleations - og metastablezonerne i et sådant diagram6,10,13. Dette giver information om proteinopløselighed og proteinkoncentrationen, hvor en termodynamisk ligevægt mellem krystal og opløsning observeres, og derved finder de optimale betingelser for kernedannelse og vækst3,14. I et todimensionelt fasediagram afbildes proteinkoncentrationen som en funktion af en variabel, og de andre variabler holdes konstante15. I et sådant fasediagram, når proteinkoncentrationen er under opløselighedskurven, er opløsningen i det undersættede område, og der opstår ingen kerne- eller krystalvækst. Over denne kurve er overmætningszonen , hvor proteinkoncentrationen er højere end opløselighedsgrænsen3,14. Dette er yderligere opdelt i tre regioner: den metastable zone, den spontane kernezone og nedbørszonen. I den metastable zone er overmætning ikke tilstrækkelig til, at nukleation kan forekomme inden for en rimelig tid, men vækst af seedede krystaller kan finde sted. Sammenlægning og nedbør er begunstiget i nedbørszonen, hvor overmætning er for høj14,15.
Når der opnås tilstrækkelig overmætning til spontan kernedannelse, vises de første kerner10. Væksten af krystaller fører til en reduktion i proteinkoncentrationen, indtil grænsen for opløselighed er nået. Så længe overmætning forbliver i nærheden af opløselighedskurven, vil der ikke være nogen væsentlig ændring i størrelsen af krystaller. Det har dog vist sig, at variationer i temperaturen og den kemiske sammensætning af krystalliseringsopløsning (for eksempel koncentrationen af præcipitant) vil påvirke proteinopløseligheden og kan føre til indledning af yderligere krystalvækst8,13,16.
Da dialyse er fordelagtig for krystalvækst af god kvalitet, blev OptiCrys krystalliseringsbænken illustreret i figur 2designet og udviklet i vores laboratorium til at kontrollere krystallisering på en fuldt automatiseret måde8. Til dette formål blev software skrevet med LabVIEW, der gør det muligt at kontrollere og overvåge temperaturen i en flydende reservoir dialyse setup i kontakt med Peltier elementer, via en elektronisk controller og en chiller. Den samme software regulerer også automatisk den kemiske sammensætning af krystalliseringsopløsningen (for eksempel udveksling af krystalliseringsmidler) ved hjælp af et multikanalvæskesystem. Derudover bruges et digitalt kamera og et omvendt mikroskop til at visualisere og optage krystalliseringsprocessen. To krystalliseringskamre med 15 μL- og 250 μL-mængder er tilgængelige til dyrkning af krystaller til forskellige formål. Da krystalliseringsprocessen er reversibel, er screening for forskellige forhold mulig med blot et par mikroliter af proteinopløsningen, så længe prøven ikke er beskadiget8. Som følge heraf minimerer brugen af denne metode mængden af proteinmateriale, der anvendes.
Fra tidligere arbejde8er det tydeligt, at in situ-observationer skal udføres med jævne mellemrum under krystalvækstprocessen. Disse kan variere fra et par sekunder til flere dage, afhængigt af hændelsen under observation (nedbør, kernedannelse eller krystalvækst).
Optimeringen af krystalvækst med OptiCrys er baseret på temperatur-precipitant koncentrationsfasediagrammer. I tilfælde af proteiner med opløselighed som en direkte funktion af temperaturen er det muligt at gøre brug af saltningsregimet18. Det er her at øge opløsningens ioniske styrke, som kan visualiseres ved hjælp af protein-precipitant fasediagrammer, reducerer proteinets opløselighed. Ligeledes kan proteiner med omvendt opløselighed gøre brug af saltning-in regime18. Nukleation forekommer i nukleationszonen, i nærheden af den metastable zone, og krystalvækst finder derefter sted i fasediagrammets metastable zone, indtil proteinkoncentrationen når opløselighedsgrænsen. Som vist i figur 3Akan med konstant kemisk sammensætningstemperatur reduceres for at holde krystalliseringsopløsningen i den metastable zone for at forhindre ny kernedannelse. Krystaller vokser, indtil den anden krystal / opløsning ligevægt er opnået, og derefter observeres ingen yderligere stigning i størrelsen af krystaller. Temperaturen reduceres flere gange, indtil krystallerne når den ønskede størrelse. I figur 3Bholder en forøgelse af præcipitantkoncentrationen opløsningen i den metastable zone ved konstant temperatur. Denne proces kan derefter gentages flere gange for at opnå store krystaller. Ændring af temperaturen og manipulere krystallisering løsning betingelser, ved at kontrollere overmætning niveauer, er to kraftfulde værktøjer til at adskille kernedannelse og vækst af krystaller, der styres præcist og automatisk af OptiCrys5,8,14.
Eksempler på proteinkrystaller, der dyrkes ved temperaturkontrolleret eller temperatur- og præcipitant koncentrationskontrolleret krystallisering, samt relative diffraktionsdata, der er opnået, er tilgængelige i litteraturen og FBF. Blandt dem er menneskelig γ-krystallin E, PA-IIL lectin, gær uorganisk pyrophosphatase, urate oxidase, human carbonic anhydrase II, YchB kinase og laktat dehydrogenase5,14,17,18.
Selvom OptiCrys blev kommercialiseret af NatX-ray, er der mange laboratorier, der ikke har adgang til dette instrument eller til den serielle tilgang, det tilbyder. Alternativet til denne teknik er at bruge kommercielt tilgængelige plast mikrodialyse knapper med forskellige mængder. Ved hjælp af disse kan temperatur og kemisk sammensætning justeres og varieres manuelt. Inspektion af mikrodialyseknapper kan ikke udføres på stedet og skal i stedet udføres manuelt med et optisk mikroskop. Temperaturregulering kan opnås ved at holde prøven i en vibrationsfri temperaturstyret inkubator. Det er vigtigt at holde temperaturen konstant for at sikre, at krystalliseringseksperimenter kan reproduceres. Betydelig temperaturvariation kan også føre til beskadigelse eller ødelæggelse afkrystaller 5.
Her leverer vi en detaljeret protokol, der beskriver prøveforberedelse og brugen af kontrolsoftware til vækst af store krystaller af høj kvalitet, der er egnet til neutronproteinkrystallografi. Denne trinvise procedure er designet til at drage fordel af krystalliseringsfasediagrammet for at vælge en startposition og kinetisk sti til at styre størrelsen og kvaliteten af de genererede krystaller. Derudover præsenteres en detaljeret protokol til dyrkning af krystaller med mikrodialyseknapper, som bruger det samme rationale til at opnå store krystaller af høj kvalitet.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>200 &#181;l Dialysis Button</td>
			<td>Hampton Research</td>
			<td>HR3-330</td>
			<td>Dialysis button</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24 well plates</td>
			<td>Jena Bioscience</td>
			<td>CPL-132</td>
			<td>Crystallization plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Switch</td>
			<td>FLUIGENT</td>
			<td>2SW001</td>
			<td>Switch</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>30 &#956;l Dialysis Button</td>
			<td>Hampton Research</td>
			<td>HR3-324</td>
			<td>Dialysis button</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL Corning Centrifuge tubes</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>CLS430828-500EA</td>
			<td>Centrifuge tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S2889</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chicken Egg White Lysozyme</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L6876</td>
			<td>Lyophilized protein powder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dialysis Membrane Discs 6-8 kDa MWCO</td>
			<td>Spectrum</td>
			<td>132478</td>
			<td>Dialysis membrane</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dialysis Membrane Tubing 6-8 kDa MWCO</td>
			<td>Spectrum</td>
			<td>132650T</td>
			<td>Dialysis membrane</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>Minispin</td>
			<td>Bench-top centrifuge</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow Unit</td>
			<td>FLUIGENT</td>
			<td>FLU-XL</td>
			<td>Flow meter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flowboard</td>
			<td>FLUIGENT</td>
			<td>FLB</td>
			<td>Flowboard</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microfluidic Flow Control System EZ</td>
			<td>FLUIGENT</td>
			<td>EZ-01000002</td>
			<td>Pressure/vacuum controller</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MilliporeSigma 0.22 &#181;m syringe Filters</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>GSWP04700</td>
			<td>0.22 &#956;m pore size filter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M-Switch</td>
			<td>FLUIGENT</td>
			<td>MSW002</td>
			<td>Rotary valve</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opticrys</td>
			<td>NatX-ray</td>
			<td>PRT008</td>
			<td>Crystallization bench</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Siliconized circle cover slides</td>
			<td>Hampton Research</td>
			<td>HR3-231</td>
			<td>Glass slides</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride &#8805; 99%</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>746398</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Switchboard</td>
			<td>FLUIGENT</td>
			<td>SWB002</td>
			<td>Switchboard</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermoregulated incubator</td>
			<td>Memmert</td>
			<td>IPP30</td>
			<td>Thermoregulated incubator</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

optimization of crystal growth for neutron macromolecular crystallography

Brugen af neutron makromolekylær krystallografi (NMX) er i hastig vækst med de fleste strukturer bestemmes i det sidste årti takket være nye NMX strålelinjer er blevet bygget og øget tilgængelighed af struktur raffinement software. De neutronkilder, der i øjeblikket er tilgængelige for NMX, er imidlertid betydeligt svagere end tilsvarende kilder til røntgenkrystallografi. På trods af fremskridt på dette område vil der altid være behov for betydeligt større krystaller til neutrondiffraktionsundersøgelser, især med tendensen til at studere stadig større makromolekyler og komplekser. Yderligere forbedringer i metoder og instrumentering, der er egnet til dyrkning af større krystaller, er derfor nødvendige for brugen af NMX til at udvide.
I dette arbejde introducerer vi rationelle strategier og en krystalvækstbænk (OptiCrys), der er udviklet i vores laboratorium, der kombinerer realtidsobservation gennem et mikroskopmonteret videokamera med præcis automatiseret kontrol af krystalliseringsløsninger (f.eks. foregribende koncentration, pH, additiv, temperatur). Derefter demonstrerer vi, hvordan denne kontrol af temperatur og kemisk sammensætning letter søgningen efter optimale krystalliseringsforhold ved hjælp af modelopløselige proteiner. Indgående kendskab til krystalliseringsfasediagrammet er afgørende for at vælge udgangspositionen og den kinetiske vej til ethvert krystalliseringseksperiment. Vi viser, hvordan en rationel tilgang kan styre størrelsen og antallet af krystaller genereret baseret på viden om flerdimensionale fasediagrammer.

I afsnit 2.3 og 2.4 præsenteres tre eksempler på optimeret krystalvækst, der viser brugen af instrumentet og et eksperimentelt design til dyrkning af store krystaller. Til denne demonstration har vi brugt lysozym som modelprotein, selvom krystalvæksteksperimenter med succes er blevet udført med mange andre proteinsystemer ved hjælp af denne metode (se ovenfor). Ved at bruge og mestre den protokol, der præsenteres her, kan man tilpasse den til andre proteinkandidater.
I afsnit 2.3 påviste vi, at etablerede rationelle krystalliseringsstrategier kunne være gavnlige i dyrkning af krystaller med tilstrækkelige spredningsvolumener til neutronproteinkrystallografi. Her viser vi, at de foreslåede rationelle optimeringsstrategier også gør det muligt at få en ensartet population af krystaller af enhver specifik størrelse, der kræves til downstream-strukturbestemmelsesmetoder.
Disse to eksperimenter er designet til at understrege vigtigheden af fasediagrammer i styringen af krystalkerner og vækst. Her bruges kontrol af temperaturen og den kemiske sammensætning af krystalliseringsløsninger i kombination med overvågning af krystalliseringsprocessen i realtid til at studere det kvalitative fasediagram. Ved hjælp af denne metode kan nukleation og krystalvækst optimeres rationelt på en reversibel måde. Brug af en sådan seriel tilgang reducerer også mængden af protein og den tid, der kræves for at kontrollere krystallernes størrelse og kvalitet.
I dialysemetoden adskilles en proteinopløsning fra en krystalliseringsopløsning af en semipermeabel membran6 (Figur 5). Denne dialysemembran gør det muligt for små molekyler som tilsætningsstoffer, buffer og ioner at passere gennem membranen, men ikke makromolekyler som proteiner6,20. Denne funktion gør det muligt at ændre krystalliseringsopløsningen i løbet af eksperimentet6. Udveksling af løsningen kan udføres manuelt, for eksempel i mikrodialyseknapper, eller på en automatiseret måde ved hjælp af et instrument udviklet til dette formål, OptiCrys8.
I det første sæt eksperimenter blev mikrodialyseknapper brugt til krystallisering af kyllingæghvid lysozym. Mikrodialyseknapper blev nedsænket i krystalliseringsopløsninger med forskellige saltkoncentrationer. I dette enkle krystalliseringsgittereksperiment er den eneste variabel præcipitantkoncentration, mens temperaturen holdes konstant (293 K). Som vist i figur 4medfører små variationer i saltkoncentrationen en ændring i størrelsen og antallet af observerede krystaller, hvilket gør det muligt at undersøge krystalliseringsfasediagrammet. I figur 4, panel 1, indeholder krystalliseringsopløsningen 0,7 M NaCl, og et begrænset antal større krystaller er dukket op i knapperne. Ved at øge saltkoncentrationen fra 0,7 til 1,2 M øges overmætningen, og opløsningen i nukleationszonen bevæger sig væk fra den metastable zone (Figur 4, panel 1 til 6). Som følge heraf øges antallet af krystaller, og deres størrelse falder.
I det første eksperiment med et fuldautomatisk instrument, der muliggør temperaturstyret dialysekrysekrystallisering, OptiCrys (Figur 9), blev krystalvæksteksperimentet skræddersyet til at generere stor krystalvækst. Eksperimentet blev lanceret ved en indledende temperatur på 295 K med en krystalliseringsopløsning indeholdende 0,75 M NaCl og 0,1 M Na acetat buffer pH 4. Under disse forsøgsbetingelser nåede krystalliseringsopløsningen nukleationszonen i nærheden af fasediagrammets metastable zone (Figur 9, pil 1). Som følge heraf blev der kun genereret nogle få kerner i løbet af eksperimentets første fase. For at dyrke udvalgte krystaller yderligere (vist i figur 9) blev krystalvækstoptimeringsarbejdsgangen drevet mod den metastable zone ved varierende temperatur, så snart krystalopløsningsligevægten blev nået.
Hver gang ligevægten mellem krystal og opløsning blev nået, blev temperaturen sænket, først til 291 K, derefter til 288 K og endelig til 275 K, for at holde krystalliseringsopløsningen i den metastable zone. Resultatet af dette eksperiment er en enkelt stor krystal egnet til både makromolekylær røntgen og neutronkrystallografi.
For de fleste proteiners vedkommende er det præcise kvantitative fasediagram (eller blot et kvalitativt diagram) endnu ikke opnået på grund af manglen på eksperimentelle anordninger, der er i stand til nøjagtigt at måle proteinkoncentrationen (eller blot observere/detektere krystalliseringsprocessen i realtid) under krystalliseringsforsøg18. Som følge heraf er det ofte ikke muligt at designe eksperimentet på en sådan måde, at krystallisering begynder i det optimale område af fasediagrammet i nærheden af den metastable zone.
Derfor skal en krystalliseringsoptimeringsundersøgelse finde sted, før eksperimentet dedikeret til væksten af en stor volumenkrystal udføres. I denne undersøgelse er det ved hjælp af temperaturvariationer (ved konstant kemisk sammensætning) på den ene side og variationer i kemisk sammensætning (ved konstant temperatur) på den anden side nødvendigt at identificere den metastable zone og afgrænse de optimale betingelser for at starte et stort krystalvæksteksperiment.
Til dette formål præsenteres to andre eksperimenter, som blev skræddersyet til at demonstrere reversibiliteten af de temperaturstyrede dialysekrystalliseringseksperimenter med OptiCrys til kernedannelse, krystalvækst, opløsning og genvækst. Krystalvækstoptimeringsarbejdsgangen blev kontrolleret, så der blev dyrket en ensartet population af færre, større lysozymkrystaller ved hjælp af temperaturvariation eller begyndende koncentration.
I det andet eksperiment med OptiCrys blev krystalliseringsopløsningens kemiske sammensætning holdt konstant under hele forsøget (0,9 M NaCl i 0,1 M CH3COONa pH 4) med variabel temperatur. Den oprindelige temperatur blev sat til 291 K. Resultaterne af dette eksperiment er sammenfattet i figur 10. På grund af høj overmætning dukkede et stort antal små krystaller op i krystalliseringskammeret (Figur 10, paneler 1 og 2). I overensstemmelse med begrebet direkte proteinopløselighed blev alle krystallerne opløst ved gradvist at øge temperaturen til 313 K (Figur 10, panel 3, 4 og 5). Endelig blev den anden kerne ved at sænke temperaturen til 295 K indledt i nærheden af den metastable zone og tilladt kontrolleret dannelse af et lavere antal kerner. Yderligere krystalvækst resulterede i en ensartet generation af en bestand af større krystaller (Figur 10, panel 7).
Som vist i figur 11kan variation af krystalliseringsopløsningens kemiske sammensætning ved en konstant temperatur på 291 K ligeledes bruges til at opnå en ensartet population af større krystaller. I lighed med det foregående eksperiment var den oprindelige tilstand 0,9 M NaCl i 0,1 M CH3COONa pH 4. NaCl-koncentrationen blev derefter gradvist sænket fra 0,9 M til nul for at opløse krystallerne (Figur 11, panel 4 og 5). På dette tidspunkt blev NaCl fuldstændig erstattet af en bufferopløsning på 0,1 M CH3COONa pH 4. Reduktion af saltkoncentrationen holder opløsningen i den undersættede zone i fasediagrammet, hvilket fører til opløsning af krystallerne. Derefter blev en ny krystalliseringsopløsning med lavere ionisk styrke ved 0,75 M NaCl i 0,1 M CH3COONa pH 4 sprøjtet ind i reservoirkammeret. Ved denne begyndende koncentration dukkede de første kerner op (Figur 11, panel 6) efter 90 minutter. Antallet af genererede krystaller var lavere, og krystallerne når et større volumen (Figur 11, panel 7) end før.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61685/61685fig1v3.jpg"> Figur 1: Skematisk fasediagram. Kinetiske baner for tre krystalliseringsteknikker er repræsenteret i et saltningsregime. Hver metode opnår nukleation og krystallisering forskelligt, visualiseret af en anden kinetisk vej gennem fasediagrammet for at nå nukleations- og metastablezonerne. Opløselighedskurven adskiller undersætnings- og overmætningsområder. Overmætning er opdelt i tre zoner: metastable, nukleation og nedbør. I nukleationszonen opstår spontan kernedannelse, mens krystalvæksten i den metastable zone finder sted. Dette tal er tilpasset fra Junius et al. 8<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61685/61685fig1v3large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61685/61685fig02.jpg"> Figur 2: Skematisk repræsentation af krystalliseringsbænken (OptiCrys). LED-lyskilden er placeret oven på den temperaturstyrede dialysestrømcelle. Et omvendt mikroskop og det digitale kamera vises øverst til højre på billedet med den røde pil. Den røde cirkel repræsenterer placeringen af chillerrøret. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61685/61685fig02large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61685/61685fig03.jpg"> Figur 3: Skematisk todimensionalt proteinkrystalliseringsfasediagram som funktion af temperatur (A) og præcipitantkoncentration (B). (A) I tilfælde af et protein med direkte opløselighed holder en reduktion af temperaturen krystalliseringsopløsningen i den metastable zone. Temperaturvariation kan gentages flere gange for at kontrollere krystalvækstprocessen, indtil krystaller med det ønskede volumen er opnået. (B) Ændring af koncentrationen af den præcipitantopløsning kan også bruges til at holde krystalliseringsopløsningen i metastabelzonen til dyrkning af krystaller. Dette tal er tilpasset fra Junius et al. 8<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61685/61685fig03large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61685/61685fig04.jpg"> Figur 4: Krystaller af lysozym opnået ved hjælp af dialysemetoden. Dette eksperiment blev udført ved en konstant temperatur på 293 K i 0,1 M natriumacetat buffer pH 4. Stigende NaCl koncentration fra 0,7 M til 1,2 M øger nukleationshastigheden og resulterer i et større antal krystaller. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61685/61685fig04large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61685/61685fig05.jpg"> Figur 5: Oversigt over proteinkrystalliseringsprocessen ved dialysemetoden. (A) Ved at tilføje proteinet til dialyseknappens kammer, (B) skabes en kuppelform øverst i kammeret. (C) En applikator anvendes til at overføre O-ringen til dialyseknappens rille for at rette dialysemembranen på plads. (D) Dialyseknappen er klar til nedsænkning i reservoiropløsningen. (E) Krystalliseringsopløsningen passerer gennem den semipermeable membran, og der begynder at danne sig krystaller inde i kammeret. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61685/61685fig05large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61685/61685fig06.jpg"> Figur 6: Skematisk visning af den temperaturstyrede flydende dialyseopsætning. (A) Proteinprøven tilsættes dialysekammeret. (B) Dialysemembranen fastgøres på overchamberen med en O-ring ved hjælp af en applikator. (C) Overchamberen drejes og fastgøres på toppen af dialysekammeret. Hvide pile angiver, hvor skruer er placeret på overchamber. (D) Reservoirkammeret drejes med uret (E) og fastgøres oven på overchamberen. (F) Reservoirkammeret er dækket af en lufttæt hætte med stik til et pumpesystem, og (G) flowcellen placeres i messingstøtten. Dette tal er tilpasset fra Junius et al. 8<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61685/61685fig06large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61685/61685fig07.jpg"> Figur 7: Forberedelse og injektion af krystalliseringsopløsningen i reservoiret af det fluidiske system (A). Rør, der indeholder salt og vand, tilsluttes tryk-/vakuumregulatoren (B) og rotationsventilen (C). Ved at bruge trykket skaber tryk-/vakuumregulatoren en konstant strøm af væsker fra rørene til rotationsventilen. Hver væske, der passerer gennem flowmåleren (D), og kontakten injiceres i blandingsrøret (F). Når alle væskerne er tilsat blanderøret, injicerer kontakten ved nogle modifikationer den endelige opløsning fra blanderøret i reservoiret (G). Væsken strømmer gennem systemet i retning af pilene i diagrammet markeret i stigende rækkefølge (fra 1 til 6). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61685/61685fig07large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61685/61685fig8v2.jpg"> Figur 8: Vedligeholdelsesvisning af overvågningssoftwaren. Denne visning bruges til at styre forskellige parametre som temperatur, lys, krystalliseringsløsning og zoom. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61685/61685fig8v2large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Figure 9" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61685/61685fig09.jpg"> Figur 9: Fasediagrammet som en funktion af temperaturen (udvalgte billeder skal spores i stigende rækkefølge). En enkelt stor lysozym krystal opnås ved systematisk at ændre temperaturen fra 295 K til 275 K. Ved hvert trin stoppes krystalvæksten, når du når opløselighedskurven. Reduktion af temperaturen ved at holde opløsningen i metastable zone genstarter krystal vækst. Billederne har forskellige niveauer af forstørrelse. Dette tal er tilpasset fra Junius et al. 8,18<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61685/61685fig09large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Figure 10" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61685/61685fig10.jpg"> Figur 10: Optimering af krystalvækst ved konstant kemisk sammensætning ved hjælp af temperaturregulering (udvalgte billeder skal spores i stigende rækkefølge). Start af nukleationsprocessen i nukleationszonen ved 291 K, langt fra den metastable zone, resulterer i dannelsen af mange krystaller. Ved at øge temperaturen til 313 K opløses krystallerne, indtil der ikke ses synlige kerner i dialysekammeret. Endelig, faldende temperaturen til 295 K genstarter nukleationsprocessen for anden gang, hvilket fører til et begrænset antal større krystaller. Dette tal er tilpasset fra Junius et al. 8,18<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61685/61685fig10large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Figure 11" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61685/61685fig11.jpg"> Figur 11: Optimering af krystalvækst ved konstant temperatur ved hjælp af variationer i præcipitantkoncentrationen (udvalgte billeder skal spores i stigende rækkefølge). Reduktion af præcipitantkoncentrationen fra 0,9 M til 0 M opløser de krystaller, der opnås under den første kernebegivenhed. Krystalliseringsprocessen genstartes ved injektion af den samme precipitant, men ved lavere ionisk styrke, 0,75 M, hvilket fører til dannelsen af et par større krystaller. Dette tal er tilpasset fra Junius et al. 8,18<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61685/61685fig11large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af dette tal.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Optimization of Crystal Growth for Neutron Macromolecular Crystallography at JoVE.com

Optimization of Crystal Growth for Neutron Macromolecular Crystallography

Strukturelle undersøgelser af biomacromolecules ved krystallografi kræver krystaller af høj kvalitet. Her demonstrerer vi en protokol, der kan bruges af OptiCrys (et fuldautomatisk instrument udviklet i vores laboratorium) og/ eller mikrodialyseknapper til dyrkning af store krystaller af høj kvalitet baseret på viden om krystalliseringsfasediagrammet.

Optimering af krystalvækst for neutronkromolekylær krystallografi

The use of neutron macromolecular crystallography (NMX) is expanding rapidly with most structures determined in the last decade thanks to new NMX ...

Der er forskellige krystalliseringsmetoder til opnåelse af store krystaller af høj kvalitet til både røntgen- og neutronkrystallografi. En af disse tilgange er ved hjælp af dialyse metode. I denne teknik adskilles proteinopløsningen fra en foregribende opløsning af en semigennemtrængelig membran.De stejle molekyler spredes over membranen ind i proteinkammeret. Når den korrekte overmætning for en spontan kerne er opnået, vises den første kerne. Her vil vi demonstrere en protokol, der kan bruges af OptiCrys et fuldt automatiseret instrument udviklet i vores laboratorium, der bruger temperaturstyret dialysekrystallisering, og vores mikrodialyseknapper til dyrkning af store krystaller af høj kvalitet til naturlig makromolekylær krystallografi baseret på viden om krystalliseringsfasediagrammet.Til en mikrodialyseknap med visse mikrolitervolumen pipetter 35 mikroliter lysozymopløsning ind i dialysekammeret. Dette ekstra volumen skaber en lidt kuppelform oven på dialysekammeret og forhindrer luftbobledannelse. Tag en applikator og læg elastikken eller ringen i ekstremiteten af den.Placer membranen oven på kammeret og fastgør den ved at overføre elastisk eller ringen fra applikatoren til dialyseknappens rille. Overfør knappen til brønden, der indeholder krystalliseringsopløsningen. Dæk brønden med et glasdæksel slip eller et stykke tape.Prøven opbevares ved 293 Kelvin i en vibrationsfri inkubator til termisk regulator. Vel vidende, at dialysekrystallisering giver fordele med hensyn til krystalvækst, blev krystalliseringsbænken såkaldte OptiCrys designet og udviklet i vores laboratorium for at tilbyde en fuldt automatiseret kombineret kontrol af temperatur og kemisk sammensætning af det biomolekylære krystalliseringseksperiment. Optimeringen af krystalvæksten af OptiCrys er baseret på temperaturforudløsende koncentrationsfasediagrammer.Nukleation forekommer i nukleationszonen i nærheden af den metastable zone, og krystalvæksten finder derefter sted i det metastable zone efter fasediagram, indtil proteinkoncentrationen når opløselighedskurven, der repræsenterer den termodynamiske ligevægt mellem opløsning og krystaller. Ved at sænke temperaturen i tilfælde af proteinet med direkte opløselighed eller ved at øge præcipitantkoncentrationen i tilfælde af saltning ud nå, krystalliseringsopløsningen forbliver i den metastable zone, og der opstår ingen kernedannelse. Krystaller vokser, indtil den anden krystalopløsningsligevægt opnår, og derefter observeres ingen yderligere stigning i størrelsen af krystaller.Reduktion af temperaturen eller forøgelse af præcipitantkoncentrationen gentages flere gange, indtil krystallerne når den ønskede størrelse. Tilsæt proteinopløsningen til dialysekammeret i den temperaturstyrede flydende opsætning, dæk overkammeret med dialysemembranen og fastgør membranen med elastik eller ring. Vend overkammeret og læg det oven på dialysekammeret.Tryk forsigtigt og langsomt for at fjerne al den luft, der er fanget mellem to stykker, fastgør reservoiret i dets position ved forsigtigt at skrue det oven på overkammeret. Tilsæt krystalliseringsopløsningen til reservoirkammeret og dæk den ved den lufttætte hætte. Overfør denne samling og indsat det i bryststøtten af krystallisering bænk OptiCrys Crystal vækst er et tilsyn software af Crystallization Bench OptiCrys.Det omfatter fire forskellige grafiske grænseflader eller visninger. Hjemmevisningen indeholder knapper til at navigere til de andre visninger. Formålet med installationsgrænsefladen er at definere et eksperimentscenarie, der kan køres automatisk i testvisningen.Den sidste visning er vedligeholdelsesvisningen. For at genstarte et eksperiment skal vedligeholdelsesvisningen være åben, hvor alle de væsentlige parametre for en problemfri afvikling af krystalliseringseksperimenterne findes. Forøg lysstyrken fra lyssektionen, lys kan stige fra nul, intet lys til 100 maksimal lysstyrke.Til styring og overvågning af temperaturen anvendes temperaturregulatorsektionen. Klik på knappen for at tænde den. Indstil temperaturen på den indstillede punktsektion, og tryk på enter.Under denne knap er der to grafer. Den røde viser den endelige, ordretemperaturen og den gule graf viser den aktuelle temperatur. Blanding af en stamopløsning, en injektion af krystalliseringsopløsningen til reservoirkammeret styres af Palm-sektionen.Tilsæt koncentrationen af stamopløsningen i første fase. Find derefter den endelige koncentration af hver ny grouperopløsning og tilsæt dem til det endelige koncentrationsafsnit. Når du har trykket på beregningsknappen, skal du finde ud af, hvor stor en stamopløsning der beregnes, og vil tilføje volumenpanelet foran hvert koncentrationspanel.Tryk på startforberedelsesknappen, og vent, indtil den nye premier-løsning er klar. Klik på knappen Løsningspost for at udveksle krystalliseringsløsningen. Tryk på knappen Stop distribution for at stoppe processen.På højre side af mikroskopsektionen er der flere paneler til registrering af vigtige oplysninger fra hvert krystalvæksteksperiment. Tilføj tilsvarende proteiner navn, molekylvægt og krystallisering tilstand i dette afsnit. Definer et navn til dine eksperimenter ved blot at skrive det på mappenavnet.Vælg det antal billeder, der skal tages under eksperimentet, i afsnittet nb billeder. Tilføj antallet af billederne, og vælg timerskalaen fra panelet til højre. Klik på mappeknappen for at åbne mappen.I denne mappe er der en tekstfil, der indeholder alle de oplysninger, du tidligere har defineret for eksperimentet. Billeder, der er klar til yderligere behandling, gemmes også i denne mappe. Zoom ud mikroskopet kan også varieres automatisk.Ændrer zoom ved hjælp af plus- og minusknappen oven på mikroskopsektionen for at øge eller mindske forstørrelsen. Der er tre forskellige måder at måle krystalstørrelsen på. Til måling af længde eller bredde skal du bruge breddevektoren.Afhængigt af krystalformen kan de specifikke værktøjer fra venstre del af mikroskopsektionen vælges. Såsom en rektangulær eller polygon. Værdierne vises i målesektionen.I det første sæt eksperimenter blev mikrodialyseknapper nedsænket i krystalliseringsopløsningerne med forskellige saltkoncentrationer. I dette enkle krystalliseringsgittereksperiment er den eneste variabel præcipitantkoncentration. mens temperaturen holdes konstant.Små variationer i saltkoncentrationen gør det muligt at undersøge krystalliseringsfasediagrammet ved at øge saltkoncentrationen fra 0,7 til 1,2 molarovermætningsstigninger, og opløsningen i nukleationszonen bevæger sig væk fra den metastable zone. Derfor observeres en variation i størrelse og antal krystaller, hvor antallet af krystaller stiger, og deres størrelse falder. I det første eksperiment med OptiCrys under den givne eksperimentelle tilstand, når ligevægten i dialysekammeret når, er krystalliseringsopløsningen i nukleationszonen i nærheden af det metastable zone af krystalliseringsfasediagram.Som følge heraf genereres kun få kerner i løbet af eksperimentets første fase. For at holde væksten af krystaller i den metastable zone og styre krystalvækstprocessen blev temperaturen ændret med forskellige tidsintervaller. Hver gang krystalopløsningsligevægten blev afsluttet, var temperaturen varieret.Derfor faldt temperaturen til 291 Kelvin, 288 Kelvin og endelig 275 Kelvin for at opretholde væksten af udvalgte krystal i metastable zone. Resultatet af dette eksperiment er en enkelt stor krystal, med det volumen, der kræves til naturlig makromolekylær krystallografi. De næste to forsøg viser reversibiliteten af de temperaturstyrede dialyseeksperimenter for kernedannelse, krystalvækst, opløsning og genvækst.I det andet eksperiment med OptiCrys blev krystalliseringsopløsningens kemiske sammensætning holdt konstant gennem eksperimentet, og temperaturen varierede. Den oprindelige temperatur blev sat til 291 Kelvin. På grund af høj overmætning dukkede et stort antal små krystaller op i krystalliseringskammeret.I overensstemmelse med begrebet direkte protein opløselighed, ved gradvist at øge temperaturen til 313 Kelvin alle krystaller skulle opløses. Endelig, ved at sænke temperaturen til 295 Kelvin, den anden kerne indledt i nærheden af metastable zone og lov til at kontrollere nukleationsprocessen resulterer i dannelse af lavere antal kerner. Yderligere krystalvækst gjorde det muligt at generere den ensartede befolkning af større krystaller.I dette eksperiment fører en ændring af krystalliseringsopløsningens kemiske sammensætning ved konstant temperatur til at opnå en ensartet population af større krystaller. Krystalliseringstilstanden svarede til det foregående eksperiment. Opløsning af krystallerne blev opnået ved gradvist at sænke NaCl-koncentrationen fra 0,9 molar til nul.Reduktion af saltkoncentrationen holder opløsningen i den undersættede zone i fasediagrammet, hvilket fører til opløsning af krystallerne. Derefter blev den nye krystalliseringsopløsning med lavere ionisk styrke end tidligere injiceret i reservoirkammeret. Ved denne precipitant koncentration vises det lavere antal krystaller, og krystallerne når et større volumen end før.Her leverede vi en detaljeret protokol, der beskriver prøveforberedelse og justering af kontrolsoftwaren til dyrkning af store krystaller af høj kvalitet til naturlig makromolekylær krystallografi ved hjælp af et fuldt automatiseret instrument udviklet i vores laboratorium. Denne trinvise procedure blev designet og drage fordel af kendskabet til krystalliseringsfasediagrammet med henblik på at adskille kernedannelse og krystalvækst. Desuden præsenteres en protokol for dyrkning af krystaller med mikrocytosemønstre ved hjælp af makrocytoseknapper som et alternativ, når OptiCrys ikke er tilgængelig.Ud over de strategier, som jeg nævnte for OptiCrys ændre den kemiske sammensætning af krystallisering løsning og temperatur og tage billeder skal gøres manuelt. Det er nødvendigt at bruge de termisk regulerede vibrationer til inkubatoren til at holde temperaturen konstant, hvilket er et kritisk skridt i den påviste metode.

Research

JoVE Journal

Biology

Protein Crystallization for X-ray Crystallography

Using the three-dimensional structure of biological macromolecules to infer how they function is one of the most important fields of modern biology. The ...

Isolation and Biophysical Study of Fruit Cuticles

Isolering og Biofysisk Undersøgelse af Frugt neglebånd

The cuticle, a hydrophobic protective layer on the aerial parts of terrestrial plants, functions as a versatile defensive barrier to various biotic and ...

Harvesting and Cryo-cooling Crystals of Membrane Proteins Grown in Lipidic Mesophases for Structure Determination by Macromolecular Crystallography

Høst og Cryo-køling Krystaller af membranproteiner dyrket i Lipidiske mesofaser for Structure Bestemmelse ved makromolekylær krystallografi

An important route to understanding how proteins function at a mechanistic level is to have the structure of the target protein available, ideally at ...

In Vitro Analysis of PDZ-dependent CFTR Macromolecular Signaling Complexes

In Vitro Analysis of PDZ-dependent CFTR Macromolecular Signaling Complexes

In vitro-analyse af PDZ-afhængige CFTR Makromolekylære signalering Komplekser

Cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR), a chloride channel located primarily at the apical membranes of epithelial cells, plays a ...

Iterative Optimization of DNA Duplexes for Crystallization of SeqA-DNA Complexes

Iterative Optimering af DNA-duplekser for Krystallisation af SeqA-DNA-komplekser

Escherichia coli SeqA is a negative regulator of DNA replication that prevents premature reinitiation events by sequestering hemimethylated GATC clusters ...

Optimization and Utilization of Agrobacterium-mediated Transient Protein Production in Nicotiana

Optimization and Utilization of Agrobacterium-mediated Transient Protein Production in Nicotiana

Optimering og udnyttelse af<em&gt; Agrobacterium</em&gt;-Medieret Forbigående Protein Produktion i<em&gt; Nicotiana</em

Agrobacterium-mediated transient protein production in plants is a promising approach to produce vaccine antigens and therapeutic proteins within a short ...

Production of Human Norovirus Protruding Domains in E. coli for X-ray Crystallography

Production of Human Norovirus Protruding Domains in E. coli for X-ray Crystallography

Produktion af Menneskelige Norovirus fremspringende domæner i<em&gt; E. coli</em&gt; Til røntgenkrystallografi

The norovirus capsid is composed of a single major structural protein, termed VP1. VP1 is subdivided into a shell (S) domain and a protruding (P) domain. ...

Medium-throughput Screening Assays for Assessment of Effects on Ca2+-Signaling and Acrosome Reaction in Human Sperm

Medium-throughput Screening Assays for Assessment of Effects on Ca2+-Signaling and Acrosome Reaction in Human Sperm

Medium-throughput Screening Assays til vurdering af virkninger på Ca2 +-signalering og Acrosome reaktion i menneskelige sædceller

Ca2+-signaling is essential to normal sperm cell function and male fertility. Similarly, the acrosome reaction is vital for the ability of a human sperm ...