Name: optimization of crystal growth for neutron macromolecular crystallography
Uploaded: 2021-03-13T14:00:00
Duration: 12 min 29 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Optimization of Crystal Growth for Neutron Macromolecular Crystallography at JoVE.com

MBS erkent de steun van de LABEX VALO GRAL in het kader van het contract 2015. NJ erkent CEA's International Doctoral Research Program (Irtelis) voor de PhD Fellowship. Auteurs erkennen financiering uit het Horizon 2020 Research and Innovation Program van de Europese Unie in het kader van Marie Skłodowska-Curie-subsidieovereenkomst nummer 722687. Auteurs zijn dr. Esko Oksanen (ESS, Lund) en dr. Jean-Luc Ferrer (PDS, Grenoble) ook dankbaar voor nuttige gesprekken en inzichten. IBS erkent integratie in het Interdisciplinair Onderzoeksinstituut van Grenoble (IRIG, CEA).

<ol>
	<li>Blakeley, M. P., Langan, P., Niimura, N., Podjarny, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutron+crystallography:+opportunities,+challenges,+and+limitations.">Neutron crystallography: opportunities, challenges, and limitations.</a> Current Opinion in Structural Biology. 18 (5), 593-600 (2008).</li><li>Snell, E. H., Van Der Woerd, M. J., Damon, M., Judge, R. A., Myles, D. A. A., Meilleur, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimizing+crystal+volume+for+neutron+diffraction:+D-xylose+isomerase.">Optimizing crystal volume for neutron diffraction: D-xylose isomerase.</a> European Biophysics Journal. 35 (7), 621-632 (2006).</li><li>Ng, J. D., Baird, J. K., Coates, L., Garcia-Ruiz, J. M., Hodge, T. A., Huang, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large-volume+protein+crystal+growth+for+neutron+macromolecular+crystallography.">Large-volume protein crystal growth for neutron macromolecular crystallography.</a> Acta Crystallographica Section F:Structural Biology Communications. 71, 358-370 (2015).</li><li>O'Dell, W. B., Bodenheimer, A. M., Meilleur, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutron+protein+crystallography:+A+complementary+tool+for+locating+hydrogens+in+proteins.">Neutron protein crystallography: A complementary tool for locating hydrogens in proteins.</a> Archives of Biochemistry and Biophysics. 602, 48-60 (2016).</li><li>Oksanen, E., Blakeley, M. P., Bonnet&#233;, F., Dauvergne, M. T., Dauvergne, F., Budayova-Spano, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large+crystal+growth+by+thermal+control+allows+combined+X-ray+and+neutron+crystallographic+studies+to+elucidate+the+protonation+states+in+Aspergillus+flavus+urate+oxidase.">Large crystal growth by thermal control allows combined X-ray and neutron crystallographic studies to elucidate the protonation states in Aspergillus flavus urate oxidase.</a> Journal of the Royal Society Interface. 6, (2009).</li><li>Krauss, I. R., Merlino, A., Vergara, A., Sica, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+overview+of+biological+macromolecule+crystallization.">An overview of biological macromolecule crystallization.</a> International Journal of Molecular Sciences. 14 (6), 11643-11691 (2013).</li><li>Chayen, N. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+Studies+of+Protein+Crystallization+by+Vapour-Diffusion+and+Microbatch+Techniques.">Comparative Studies of Protein Crystallization by Vapour-Diffusion and Microbatch Techniques.</a> REVIEW Acta Cryst. , (1998).</li><li>Junius, N., Oksanen, E., Terrien, M., Berzin, C., Ferrer, J. L., Budayova-Spano, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+crystallization+apparatus+for+temperaturecontrolled+flow-cell+dialysis+with+real-time+visualization.">A crystallization apparatus for temperaturecontrolled flow-cell dialysis with real-time visualization.</a> Journal of Applied Crystallography. 49, 806-813 (2016).</li><li>Salemme, F. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+free+interface+diffusion+technique+for+the+crystallization+of+proteins+for+X-ray+crystallography.">A free interface diffusion technique for the crystallization of proteins for X-ray crystallography.</a> Archives of Biochemistry and Biophysics. 151 (2), 533-539 (1972).</li><li>Chayen, N. E., Saridakis, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+crystallization:+From+purified+protein+to+diffraction-quality+crystal.">Protein crystallization: From purified protein to diffraction-quality crystal.</a> Nature Methods. 5 (2), 147-153 (2008).</li><li>Ot&#225;lora, F., Gavira, J. A., Ng, J. D., Garc&#237;a-Ruiz, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Counterdiffusion+methods+applied+to+protein+crystallization.">Counterdiffusion methods applied to protein crystallization.</a> Progress in Biophysics and Molecular Biology. 101 (1-3), 26-37 (2009).</li><li>Garci&#225;-Ruiz, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Counterdiffusion+Methods+for+Macromolecular+Crystallization.">Counterdiffusion Methods for Macromolecular Crystallization.</a> Methods in Enzymology. 368, 130-154 (2003).</li><li>Budayova-Spano, M., Koruza, K., Fisher, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large+crystal+growth+for+neutron+protein+crystallography.">Large crystal growth for neutron protein crystallography.</a> Methods in Enzymology. 634, 21-46 (2020).</li><li>Budayova-Spano, M., Dauvergne, F., Audiffren, M., Bactivelane, T., Cusack, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+methodology+and+an+instrument+for+the+temperature-controlled+optimization+of+crystal+growth.">A methodology and an instrument for the temperature-controlled optimization of crystal growth.</a> Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography. 63 (3), 339-347 (2007).</li><li>Asherie, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+crystallization+and+phase+diagrams.">Protein crystallization and phase diagrams.</a> Methods. 34 (3), 266-272 (2004).</li><li>Astier, J. P., Veesler, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+temperature+to+crystallize+proteins:+A+mini-review.">Using temperature to crystallize proteins: A mini-review.</a> Crystal Growth and Design. 8 (12), 4215-4219 (2008).</li><li>Budayova-Spano, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+preliminary+neutron+diffraction+study+of+rasburicase,+a+recombinant+urate+oxidase+enzyme,+complexed+with+8-azaxanthin.">A preliminary neutron diffraction study of rasburicase, a recombinant urate oxidase enzyme, complexed with 8-azaxanthin.</a> Acta Crystallographica Section F: Structural Biology and Crystallization Communications. 62 (3), 306-309 (2006).</li><li>Junius, N., Vahdatahar, E., Oksanen, E., Ferrer, J. L., Budayova-Spano, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+crystallization+of+biological+macromolecules+using+dialysis+combined+with+temperature+control.">Optimization of crystallization of biological macromolecules using dialysis combined with temperature control.</a> Journal of Applied Crystallography. 53 (3), (2020).</li><li>Grimsley, G. R., Pace, C. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spectrophotometric+Determination+of+Protein+Concentration.">Spectrophotometric Determination of Protein Concentration.</a> Current Protocols in Protein Science. 33 (1), 1-9 (2003).</li><li>McPherson, A., Gavira, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Introduction+to+protein+crystallization.">Introduction to protein crystallization.</a> Acta Crystallographica Section F:Structural Biology Communications. 70 (1), 2-20 (2014).</li><li>McPherson, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Introduction+to+protein+crystallization.">Introduction to protein crystallization.</a> Methods. 34 (3), 254-265 (2004).</li></ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Verschillende fysische, chemische en biologische variabelen beïnvloeden de kristallisatie van eiwitten door de oplosbaarheid van eiwitten te beïnvloeden21. Onder deze variabelen worden hier temperatuur en chemische samenstelling van de kristallisatieoplossing gebruikt in combinatie met dialysetechniek om grote hoogwaardige kristallen van biomacromolecules te verbeteren en te kweken voor neutronendiffractiestudies. Door gebruik te maken van kennis van fasediagrammen wordt kristallisatie voorspelbaarder gemaakt. Hoewel screening van verschillende kristallisatieomstandigheden in een seriële benadering ook mogelijk is, is het belangrijkste doel van het gebruik van de gepresenteerde rationele benaderingen het scheiden en beheersen van de kinetiek van kristalkernatie en groei.
Net als bij alle kristallisatiestudies verhogen pure en homogene eiwitmonsters van hoge kwaliteit en stofvrije kristallisatieoplossingen het slagingspercentage van het experiment. Filtratie en centrifugeren van oplossingen zijn essentiële stappen in de beschreven protocollen. Het kennen van de fysisch-chemische eigenschappen van de bestudeerde eiwitten, zoals het molecuulgewicht (om het juiste dialysemembraan te kiezen), het iso-elektrische punt en de oplosbaarheid van eiwitten zijn cruciaal voor het ontwerp van een optimaal kristalgroeiexperiment. Ook moet rekening worden gehouden met eiwitstabiliteit bij verschillende temperaturen of met verschillende chemicaliën om monsterverlies te voorkomen en de kans op succes te vergroten. Gezien het temperatuurbereik van OptiCrys (233,0-353,0 ± 0,1 K), kan een breed scala aan eiwitten ermee worden gekristalliseerd. Maar het is de moeite waard om te benadrukken dat eiwitten die voornamelijk thermostabieel zijn, zoals eiwitten uit thermofiele bronnen, het meest zouden profiteren van temperatuurgecontroleerde kristalgroeiexperimenten met een groot volume die door dit instrument worden aangeboden.
Met behulp van een dialysekamer met een laag volume (bij gebruik van OptiCrys) of microdialyseknoppen en het screenen van verschillende temperaturen en kristallisatieomstandigheden (bijv. rasters van neerslagconcentratie of pH), is het mogelijk om informatie te verkrijgen over de locatie van de grenswaarde van de uitzaaibare zone (kinetisch evenwicht tussen nucleatie en uitzaaibare zones). Dit is van onschatbare waarde bij het ontwerpen van een succesvol kristalgroeiexperiment, vooral voor nieuwe eiwitkandidaten in kristallisatie. Zonder deze informatie kunnen experimenten beginnen vanuit een gebied van het fasediagram met een hoge oververzadiging, te ver van de grens van de uitzaaibare zone om kristalkernatie gemakkelijk te beheersen. Hoewel de ontbinding van het eiwitprecipitaat kan worden geprobeerd, bijvoorbeeld door de temperatuur te verhogen in het geval van directe oplosbaarheid, voor eiwitten met verminderde thermostabiliteit, kan het langer op hoge temperatuur houden van het monster de eiwitprecipitatie onomkeerbaar maken. De beste strategie bestaat dus uit het gebruik van een eerste voorwaarde met lagere oververzadiging in de buurt van de grens van metastabiliteit, waar nucleatie kan worden gecontroleerd en eiwitneerslag kan worden vermeden. In lijn hiermee vermindert kristallisatievoorscreening de kans op een eiwitprecipitaat in de dialysekamer en verhoogt het de slagingssnelheid van het experiment.
Na het ontwerpen van een experiment is het voorbereiden van dialysekamers (OptiCrys) of microdialyseknoppen een andere belangrijke stap. Het voorkomen van luchtbelvorming in de dialysekamer/knop verhoogt de kans op succesvolle kristallisatie, vooral wanneer kleine volumes worden gebruikt. De aanwezigheid van luchtbellen in de dialysekamer kan ook de kinetiek van het kristallisatieproces veranderen en de reproduceerbaarheid van het experiment verminderen (omdat het contactoppervlak tussen eiwitten en oplossingen is gewijzigd). Niet alleen eiwit, maar ook kristallisatieoplossing kan het succes van het experiment beïnvloeden. Het gebruik van nieuwe buizen van 50 ml voor het pompsysteem telkens wanneer men na elk experiment een nieuw experiment wil starten en wasslangen na elk experiment vermindert de kans op besmetting en vermijdt de creatie van zoutkristallen in het apparaat.
Het gebruik van microdialyseknoppen is een alternatief wanneer OptiCrys niet beschikbaar is. De hierboven genoemde strategieën voor het optimaliseren van kristallisatie en het monitoren van kristalgroei moeten handmatig worden uitgevoerd. Meestal vereist dit dat u zich buiten een thermogereguleerde incubator bevindt, wat problematisch kan zijn wanneer temperatuurregulatie een kritieke stap is in de beschreven methodologie. Dit vergemakkelijkt niet het veranderen van de chemische samenstelling van de kristallisatieoplossingen, of het monitoren van kristalgroei door beeldvorming, zodat het kristalgroeiproces niet in realtime kan worden gecontroleerd.
Kennis van het fasediagram is de basis van het gebruik van de kristallisatiebank, OptiCrys, om systematisch grote, hoogwaardige kristallen op een geautomatiseerde manier te laten groeien. Controle van fysisch-chemische parameters zoals temperatuur, neerslagconcentratie en pH tijdens kristallisatie verplaatst het eiwit-oplossingsevenwicht in een goed gedefinieerd kinetisch traject over het fasediagram. Dit wordt aangevuld met het gebruik van een dialysemembraan om het massatransport aan te passen en een gecontroleerde gradiënt in de kristallisatiekamer te creëren die de grootte en kwaliteit van de kristallen beïnvloedt. Daarom is het gebruik van zowel thermodynamische gegevens als kinetische trajecten essentieel om het kristallisatieproces te beheersen om kristallen van hoge kwaliteit te laten groeien. Dankzij OptiCrys kunnen systematische fasediagrammen in een multidimensionale ruimte worden bestudeerd met een seriële benadering met aanzienlijk minder materiaal dan voorheen. Om deze methodologie aan te tonen, bieden we hier een casestudy met een modeleiwit, kippeneiwit lysozym. Door het hier gepresenteerde protocol te gebruiken en onder de knie te krijgen, kan men het aanpassen voor echte eiwitsystemen5,14,17,18.

Het begrijpen van de structuurfunctierelatie van eiwitten en het mechanisme van fysiologische paden is vaak afhankelijk van het kennen van de posities van waterstofatomen (H) en hoe lading wordt overgedragen binnen een eiwit1,2. Aangezien waterstofatomen röntgenstralen zwak verspreiden, kunnen hun posities alleen worden bepaald met röntgendiffractiegegevens met een zeer hoge resolutie (>1 Å)3,4. Omgekeerd kan neutronenkristallografie worden gebruikt om een nauwkeurige positie van waterstofatomen in biologische macromoleculen te verkrijgen, aangezien waterstof en deuterium (H2, isotoop van waterstof) atomen verstrooiingslengten van ongeveer gelijke grootte hebben als zuurstof, stikstof en koolstof5. Neutronenflux uit beschikbare neutronenbronnen is echter zwakker dan die van röntgenstralen, dus dit moet vaak worden gecompenseerd voor2,3. Dit kan worden bereikt door H uit te wisselen met H2 en/of het volume van kristallen te verhogen om de onsamenhangende verstrooiing van waterstof te verminderen en de signaal-ruisverhouding van diffractiebeelden te verhogen.
Er zijn verschillende kristallisatiebenaderingen (het bijbehorende schematische fasediagram wordt weergegeven in figuur 1) voor het verkrijgen van grote en hoogwaardige kristallen voor zowel röntgen- als neutronenbio-macromoleculaire kristallografie6. Bij dampdiffusie wordt een druppel bereid uit een mengsel van een eiwit en een kristallisatieoplossing in de loop van de tijd, door verdamping van water of andere vluchtige soorten, in evenwicht gehouden met een reservoir met een hogere concentratie neerslag van dezelfde kristallisatieoplossing. De toename van de concentratie van eiwitten en neerslag in de druppel leidt tot de oververzadiging die nodig is voor spontane nucleatie , gevolgd door kristalgroei in deze kernen6,7. Hoewel dampdiffusie de meest gebruikte techniek is voor het kweken van kristallen4, kan het kristallisatieproces niet nauwkeurig worden gecontroleerd8. In de vrije interface diffusiemethode verspreidt de kristallisatieoplossing zich in een geconcentreerde eiwitoplossing, waardoor het systeem heel langzaam wordt gericht op oververzadiging. Deze methode kan worden beschouwd als een batchmethode met een langzame mengsnelheid6,9,10,11,12. In de batchmethode wordt het eiwit snel gemengd met een kristallisatieoplossing die leidt tot snelle oververzadiging en op zijn beurt uniforme nucleatie met veel kristallen3,7. Deze methode is goed voor ongeveer een derde van alle structuren die momenteel in de Protein Data Bank worden gedeponeerd. De dialysemethode wordt ook gebruikt voor het kweken van hoogwaardige en goed diffracerende eiwitkristallen. In de dialysemethode verspreiden moleculen van neerslag zich vanuit een reservoir via een semi-doorlatend membraan in een aparte kamer met de eiwitoplossing. De kinetiek van equilibratie is afhankelijk van verschillende factoren, zoals temperatuur, membraanporiëngrootte en het volume en de concentratie van eiwitmonsters en kristallisatiemiddelen6.
Kristallisatiefasediagrammen kunnen worden gebruikt om verschillende toestanden van een eiwit te beschrijven als functie van verschillende fysische of chemische variabele3. Zoals geïllustreerd in figuur 1, kan elke kristallisatietechniek worden gevisualiseerd als het gebruik van een andere kinetische baan om de nucleatie en uitzaaibare zones van een dergelijk diagram6,10,13te bereiken . Dit geeft informatie over de oplosbaarheid van eiwitten en de eiwitconcentratie waarbij een thermodynamisch evenwicht tussen kristal en oplossing wordt waargenomen, waardoor de optimale omstandigheden voor nucleatie en groei worden gevonden3,14. In een tweedimensionaal fasediagram wordt de eiwitconcentratie geplot als functie van de ene variabele en de andere variabelen constant15. In een dergelijk fasediagram, wanneer de eiwitconcentratie onder de oplosbaarheidscurve ligt, bevindt de oplossing zich in het onderverzadigde gebied en treedt er geen nucleatie of kristalgroei op. Boven deze curve bevindt zich de oververzadigingszone waar de eiwitconcentratie hoger is dan de oplosbaarheidsgrens3,14. Dit is verder verdeeld in drie regio's: de uitzaaibare zone, de spontane nucleatiezone en de neerslagzone. In de uitzaaibare zone is oververzadiging niet voldoende om nucleatie binnen een redelijke tijd te laten plaatsvinden, maar de groei van gezaaide kristallen kan plaatsvinden. Aggregatie en neerslag zijn favoriet in de neerslagzone, waar de oververzadiging te hoog is14,15.
Wanneer voldoende oververzadiging voor spontane nucleatie wordt bereikt, verschijnen de eerste kernen10. De groei van kristallen leidt tot een verlaging van de eiwitconcentratie totdat de oplosbaarheidsgrens is bereikt. Zolang de oververzadiging in de buurt van de oplosbaarheidscurve blijft, zal er geen significante verandering in de grootte van kristallen zijn. Er is echter aangetoond dat variaties in de temperatuur en chemische samenstelling van kristallisatieoplossing (bijvoorbeeld de concentratie neerslag) de oplosbaarheid van eiwitten zullen beïnvloeden en kunnen leiden tot het initiëren van verdere kristalgroei8,13,16.
Aangezien dialyse voordelig is voor kristalgroei van goede kwaliteit, werd de OptiCrys kristallisatiebank geïllustreerd in figuur 2,ontworpen en ontwikkeld in ons laboratorium om kristallisatie op een volledig geautomatiseerde manier te beheersen8. Hiervoor is software geschreven met LabVIEW die de controle en bewaking van de temperatuur van een stromende reservoirdialyse-opstelling in contact met Peltier-elementen mogelijk maakt, via een elektronische controller en een koelmachine. Dezelfde software reguleert ook automatisch de chemische samenstelling van de kristallisatieoplossing (bijvoorbeeld de uitwisseling van kristallisatiemiddelen) met behulp van een multichannel vloeibaar systeem. Daarnaast worden een digitale camera en een omgekeerde microscoop gebruikt om het kristallisatieproces te visualiseren en vast te leggen. Twee kristallisatiekamers met volumes van 15 μL en 250 μL zijn beschikbaar voor het kweken van kristallen voor verschillende doeleinden. Omdat het kristallisatieproces omkeerbaar is, is screening op verschillende omstandigheden mogelijk met slechts een paar microliters van de eiwitoplossing zolang het monster niet wordt beschadigd8. Als gevolg hiervan minimaliseert het gebruik van deze methode de hoeveelheid eiwitmateriaal die wordt gebruikt.
Uit eerder werk8blijkt dat tijdens het kristalgroeiproces in situ observaties met regelmatige tijdsintervallen moeten worden uitgevoerd. Deze kunnen variëren van enkele seconden tot meerdere dagen, afhankelijk van de gebeurtenis onder observatie (neerslag, nucleatie of kristalgroei).
De optimalisatie van kristalgroei met OptiCrys is gebaseerd op temperatuurprecipitante concentratiefasediagrammen. In het geval van eiwitten met oplosbaarheid als directe functie van de temperatuur, is het mogelijk om gebruik te maken van het zoute regime18. Dit is waar het verhogen van de ionische sterkte van de oplossing, die kan worden gevisualiseerd met behulp van eiwitprecipitante fasediagrammen, de oplosbaarheid van het eiwit vermindert. Evenzo kunnen eiwitten met omgekeerde oplosbaarheid gebruik maken van het zoute regime18. Nucleatie vindt plaats in de nucleatiezone, in de buurt van de uitzaaibare zone, en kristalgroei vindt dan plaats in de uitzaaibare zone van het fasediagram totdat de eiwitconcentratie de oplosbaarheidsgrens bereikt. Zoals weergegeven in figuur 3A,kan met een constante chemische samenstellingstemperatuur worden verlaagd om de kristallisatieoplossing in de uitzaaibare zone te houden om nieuwe nucleatie te voorkomen. Kristallen groeien tot het tweede kristal/oplossingsevenwicht is bereikt en daarna wordt geen verdere toename van de grootte van kristallen waargenomen. De temperatuur wordt meerdere keren verlaagd totdat de kristallen de gewenste grootte hebben bereikt. In figuur 3Bhoudt het verhogen van de neerslagconcentratie bij constante temperatuur de oplossing in de uitzaaibare zone. Dit proces kan vervolgens meerdere keren worden herhaald om grote kristallen te verkrijgen. Het veranderen van de temperatuur en het manipuleren van de kristallisatieoplossingsomstandigheden, door de oververzadigingsniveaus te regelen, zijn twee krachtige hulpmiddelen voor het scheiden van nucleatie en groei van kristallen die nauwkeurig en automatisch worden gecontroleerd door OptiCrys5,8,14.
Voorbeelden van eiwitkristallen die worden gekweekt door temperatuurgecontroleerde, of temperatuur- en neerslagconcentratiegestuurde kristallisatie, evenals relatieve diffractiegegevens die zijn verkregen, zijn beschikbaar in de literatuur en PDB. Onder hen zijn menselijke γ-kristallijne E, PA-IIL lectine, gist anorganische pyrofosfatase, uraatoxidase, humaan koolzuuranhydrase II, YchB kinase en lactaatdehydrogenase5,14,17,18.
Hoewel OptiCrys werd gecommercialiseerd door NatX-ray, zijn er veel laboratoria die geen toegang hebben tot dit instrument of tot de seriële aanpak die het biedt. Het alternatief voor deze techniek is het gebruik van in de handel verkrijgbare plastic microdialyseknoppen met verschillende volumes. Hiermee kunnen temperatuur en chemische samenstelling handmatig worden aangepast en gevarieerd. Inspectie van microdialyseknoppen kan niet ter plaatse worden uitgevoerd en moet in plaats daarvan handmatig worden uitgevoerd met een optische microscoop. Temperatuurregeling kan worden bereikt door het monster in een trillingsvrije temperatuurgecontroleerde incubator te bewaren. Het is essentieel om de temperatuur constant te houden om ervoor te zorgen dat kristallisatie-experimenten reproduceerbaar zijn. Aanzienlijke temperatuurschommelingen kunnen ook leiden tot beschadiging of vernietiging van kristallen5.
Hier bieden we een gedetailleerd protocol met een beschrijving van de monstervoorbereiding en het gebruik van besturingssoftware voor de groei van grote, hoogwaardige kristallen die geschikt zijn voor neutroneneiwitkristallografie. Deze stapsgewijze procedure is ontworpen om te profiteren van het kristallisatiefasediagram om een uitgangspositie en kinetisch pad te selecteren om de grootte en de kwaliteit van de gegenereerde kristallen te bepalen. Bovendien wordt een gedetailleerd protocol gepresenteerd voor het kweken van kristallen met microdialyseknoppen, dat dezelfde redenering gebruikt om grote kristallen van hoge kwaliteit te verkrijgen.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>200 &#181;l Dialysis Button</td>
			<td>Hampton Research</td>
			<td>HR3-330</td>
			<td>Dialysis button</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24 well plates</td>
			<td>Jena Bioscience</td>
			<td>CPL-132</td>
			<td>Crystallization plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Switch</td>
			<td>FLUIGENT</td>
			<td>2SW001</td>
			<td>Switch</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>30 &#956;l Dialysis Button</td>
			<td>Hampton Research</td>
			<td>HR3-324</td>
			<td>Dialysis button</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL Corning Centrifuge tubes</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>CLS430828-500EA</td>
			<td>Centrifuge tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S2889</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chicken Egg White Lysozyme</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L6876</td>
			<td>Lyophilized protein powder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dialysis Membrane Discs 6-8 kDa MWCO</td>
			<td>Spectrum</td>
			<td>132478</td>
			<td>Dialysis membrane</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dialysis Membrane Tubing 6-8 kDa MWCO</td>
			<td>Spectrum</td>
			<td>132650T</td>
			<td>Dialysis membrane</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>Minispin</td>
			<td>Bench-top centrifuge</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow Unit</td>
			<td>FLUIGENT</td>
			<td>FLU-XL</td>
			<td>Flow meter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flowboard</td>
			<td>FLUIGENT</td>
			<td>FLB</td>
			<td>Flowboard</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microfluidic Flow Control System EZ</td>
			<td>FLUIGENT</td>
			<td>EZ-01000002</td>
			<td>Pressure/vacuum controller</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MilliporeSigma 0.22 &#181;m syringe Filters</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>GSWP04700</td>
			<td>0.22 &#956;m pore size filter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M-Switch</td>
			<td>FLUIGENT</td>
			<td>MSW002</td>
			<td>Rotary valve</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opticrys</td>
			<td>NatX-ray</td>
			<td>PRT008</td>
			<td>Crystallization bench</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Siliconized circle cover slides</td>
			<td>Hampton Research</td>
			<td>HR3-231</td>
			<td>Glass slides</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride &#8805; 99%</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>746398</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Switchboard</td>
			<td>FLUIGENT</td>
			<td>SWB002</td>
			<td>Switchboard</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermoregulated incubator</td>
			<td>Memmert</td>
			<td>IPP30</td>
			<td>Thermoregulated incubator</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

optimization of crystal growth for neutron macromolecular crystallography

Het gebruik van neutronen macromoleculaire kristallografie (NMX) breidt zich snel uit met de meeste structuren die in het afgelopen decennium zijn bepaald dankzij de bouw van nieuwe NMX-bundellijnen en de toegenomen beschikbaarheid van structuurraffinaderingssoftware. De neutronenbronnen die momenteel beschikbaar zijn voor NMX zijn echter aanzienlijk zwakker dan gelijkwaardige bronnen voor röntgenkristallografie. Ondanks de vooruitgang op dit gebied zullen er altijd aanzienlijk grotere kristallen nodig zijn voor neutronendiffractiestudies, met name met de neiging om steeds grotere macromoleculen en complexen te bestuderen. Verdere verbeteringen in methoden en instrumentatie die geschikt zijn voor het kweken van grotere kristallen zijn daarom nodig om het gebruik van NMX uit te breiden.
In dit werk introduceren we rationele strategieën en een kristalgroeibank (OptiCrys) ontwikkeld in ons laboratorium die realtime observatie combineert door middel van een op microscoop gemonteerde videocamera met nauwkeurige geautomatiseerde controle van kristallisatieoplossingen (bijv. neerslagconcentratie, pH, additief, temperatuur). Vervolgens laten we zien hoe deze controle van temperatuur en chemische samenstelling het zoeken naar optimale kristallisatieomstandigheden vergemakkelijkt met behulp van modeloplosbare eiwitten. Grondige kennis van het kristallisatiefasediagram is cruciaal voor het selecteren van de uitgangspositie en het kinetische pad voor elk kristallisatie-experiment. We laten zien hoe een rationele aanpak de grootte en het aantal gegenereerde kristallen kan bepalen op basis van kennis van multidimensionale fasediagrammen.

In de paragrafen 2.3 en 2.4 worden drie voorbeelden van geoptimaliseerde kristalgroei gepresenteerd, die het gebruik van het instrument en een experimenteel ontwerp voor de teelt van grote kristallen laten zien. Voor deze demonstratie hebben we lysozym gebruikt als modeleiwit, hoewel kristalgroeiexperimenten met succes zijn uitgevoerd met veel andere eiwitsystemen met behulp van deze methode (zie hierboven). Door het hier gepresenteerde protocol te gebruiken en onder de knie te krijgen, kan men het aanpassen voor andere eiwitkandidaten.
In paragraaf 2.3 hebben we aangetoond dat gevestigde rationele kristallisatiestrategieën gunstig kunnen zijn bij het kweken van kristallen met voldoende verstrooiingsvolumes voor neutroneneiwitkristallografie. Hier tonen we aan dat de voorgestelde rationele optimalisatiestrategieën ook het mogelijk maken om een uniforme populatie kristallen van elke specifieke grootte te genereren die nodig is voor downstreamstructuurbepalingsbenaderingen.
Deze twee experimenten zijn ontworpen om het belang van fasediagrammen bij het beheersen van kristalkernatie en groei te benadrukken. Hier worden controle van de temperatuur en chemische samenstelling van kristallisatieoplossingen in combinatie met het monitoren van het kristallisatieproces in realtime gebruikt om het kwalitatieve fasediagram te bestuderen. Met behulp van deze methode kunnen nucleatie en kristalgroei rationeel worden geoptimaliseerd op een omkeerbare manier. Het gebruik van een dergelijke seriële benadering vermindert ook de hoeveelheid eiwit en de tijd die nodig is om de grootte en kwaliteit van de kristallen te controleren.
Bij de dialysemethode wordt een eiwitoplossing gescheiden van een kristallisatieoplossing door een halfdoorlatendmembraan 6 (figuur 5). Met dit dialysemembraan kunnen kleine moleculen zoals additieven, buffers en ionen door het membraan gaan, maar geen macromoleculen zoals eiwitten6,20. Met deze functie kan de kristallisatieoplossing tijdens het experiment worden gewijzigd6. Uitwisseling van de oplossing kan handmatig worden gedaan, bijvoorbeeld in microdialyseknoppen, of op een geautomatiseerde manier met behulp van een instrument dat voor dit doel is ontwikkeld, OptiCrys8.
In de eerste reeks experimenten werden microdialyseknoppen gebruikt voor de kristallisatie van kippeneiwit lysozym. Microdialyseknoppen werden ondergedompeld in kristallisatieoplossingen met verschillende zoutconcentraties. In dit eenvoudige kristallisatierasterexperiment is de enige variabele de neerslagconcentratie terwijl de temperatuur constant wordt gehouden (293 K). Zoals weergegeven in figuur 4,veroorzaken kleine variaties in de zoutconcentratie een verandering in de grootte en het aantal waargenomen kristallen, waardoor het kristallisatiefasediagram kan worden onderzocht. In figuur 4,deelvenster 1, bevat de kristallisatieoplossing 0,7 M NaCl en een beperkt aantal grotere kristallen in de knoppen. Door de zoutconcentratie te verhogen van 0,7 naar 1,2 M neemt de oververzadiging toe en beweegt de oplossing in de nucleatiezone weg van de uitzaaibare zone (figuur 4, panelen 1 t/m 6). Als gevolg hiervan neemt het aantal kristallen toe en neemt hun grootte af.
In het eerste experiment met een volledig geautomatiseerd instrument dat temperatuurgecontroleerde dialysekristallisatie mogelijk maakt, OptiCrys (figuur 9), werd het kristalgroeiexperiment op maat gemaakt om grote kristalgroei te genereren. Het experiment werd gelanceerd bij een begintemperatuur van 295 K met een kristallisatieoplossing met 0,75 M NaCl en 0,1 M Na acetaatbuffer pH 4. Onder deze experimentele omstandigheden bereikte de kristallisatieoplossing de nucleatiezone in de buurt van de uitzaaibare zone van het fasediagram (figuur 9, pijl 1). Als gevolg hiervan werden slechts enkele kernen gegenereerd tijdens de eerste fase van het experiment. Om geselecteerde kristallen verder te laten groeien (zie figuur 9)werd de kristalgroeioptimalisatieworkflow door wisselende temperatuur naar de uitzaaibare zone gedreven zodra het kristaloplossingsevenwicht was bereikt.
Telkens wanneer het evenwicht tussen kristal en oplossing werd bereikt, werd de temperatuur verlaagd, eerst tot 291 K, vervolgens tot 288 K en uiteindelijk tot 275 K, om de kristallisatieoplossing in de uitzaaibare zone te houden. Het resultaat van dit experiment is een enkel groot kristal dat geschikt is voor zowel macromoleculaire röntgenstraling als neutronenkristallografie.
Voor de meeste eiwitten is het precieze kwantitatieve fasediagram (of gewoon een kwalitatief diagram) nog niet verkregen vanwege het gebrek aan experimentele apparaten die de eiwitconcentratie nauwkeurig kunnen meten (of gewoon het kristallisatieproces in realtime kunnen observeren/detecteren) tijdens kristallisatie-experimenten18. Als gevolg hiervan is het vaak niet mogelijk om het experiment zo te ontwerpen dat kristallisatie begint in het optimale gebied van het fasediagram, in de buurt van de uitzaaibare zone.
Daarom moet een kristallisatieoptimalisatiestudie plaatsvinden voordat het experiment dat is gewijd aan de groei van een kristal met een groot volume wordt uitgevoerd. In deze studie zijn enerzijds temperatuurschommelingen (bij constante chemische samenstelling) en anderzijds variaties in chemische samenstelling (bij constante temperatuur) nodig om de uitzaaibare zone te identificeren en de optimale omstandigheden af te baken voor het starten van een groot kristalgroeiexperiment.
Hiertoe worden twee andere experimenten gepresenteerd die zijn afgestemd om de reversibiliteit aan te tonen van de temperatuurgecontroleerde dialysekristallisatie-experimenten met OptiCrys voor nucleatie, kristalgroei, ontbinding en hergroei. De kristalgroeioptimalisatieworkflow werd gecontroleerd zodat een uniforme populatie van minder, grotere lysozymekristallen werd gekweekt, met behulp van variatie in temperatuur of neerslagconcentratie.
In het tweede experiment met OptiCrys werd de chemische samenstelling van de kristallisatieoplossing gedurende het hele experiment constant gehouden (0,9 M NaCl in 0,1 M CH3COONa pH 4) met variabele temperatuur. De begintemperatuur werd ingesteld op 291 K. De resultaten van dit experiment zijn samengevat in figuur 10. Door hoge oververzadiging verschenen een groot aantal kleine kristallen in de kristallisatiekamer (figuur 10, panelen 1 en 2). In overeenstemming met het concept van directe oplosbaarheid van eiwitten, door de temperatuur geleidelijk te verhogen tot 313 K, werden alle kristallen opgelost (figuur 10,panelen 3, 4 en 5). Ten slotte, door de temperatuur te verlagen tot 295 K, werd de tweede nucleatie gestart in de buurt van de uitzaaibare zone en maakte gecontroleerde vorming van een lager aantal kernen mogelijk. Verdere kristalgroei resulteerde in de uniforme opwekking van een populatie grotere kristallen (figuur 10, deelvenster 7).
Zoals getoond in figuur 11, kan variatie van de chemische samenstelling van de kristallisatieoplossing, bij een constante temperatuur van 291 K, ook worden gebruikt om een uniforme populatie van grotere kristallen te verkrijgen. Net als bij het vorige experiment was de oorspronkelijke toestand 0,9 M NaCl in 0,1 M CH3COONa pH 4. De NaCl-concentratie werd vervolgens geleidelijk verlaagd van 0,9 M naar nul om de kristallen op te lossen (figuur 11, panelen 4 en 5). Op dit moment werd NaCl volledig vervangen door een bufferoplossing van 0,1 M CH3COONa pH 4. Het verlagen van de zoutconcentratie houdt de oplossing in de onderverzadigde zone van het fasediagram, wat leidt tot de ontbinding van de kristallen. Vervolgens werd een nieuwe kristallisatieoplossing met een lagere ionische sterkte, bij 0,75 M NaCl in 0,1 M CH3COONa pH 4, in de reservoirkamer geïnjecteerd. Bij deze neerslagconcentratie verschenen de eerste kernen (figuur 11, paneel 6) na 90 minuten. Het aantal gegenereerde kristallen was lager en de kristallen bereiken een groter volume (figuur 11, paneel 7) dan voorheen.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61685/61685fig1v3.jpg"> Figuur 1: Schematisch fasediagram. Kinetische trajecten voor drie kristallisatietechnieken zijn vertegenwoordigd in een zoute regime. Elke methode bereikt nucleatie en kristallisatie anders, gevisualiseerd door een andere kinetische route door het fasediagram om de nucleatie en uitzaaibare zones te bereiken. De oplosbaarheidscurve scheidt onderverzadigings- en oververzadigingsgebieden. Oververzadiging is verdeeld in drie zones: uitzaaibaar, nucleatie en neerslag. In de nucleatiezone vindt spontane nucleatie plaats terwijl in de uitzaaibare zone kristalgroei plaatsvindt. Deze figuur is aangepast van Junius et al. 8<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61685/61685fig1v3large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61685/61685fig02.jpg"> Figuur 2: Schematische weergave van de kristallisatiebank (OptiCrys). De LED-lichtbron bevindt zich bovenop de temperatuurgecontroleerde dialysestroomcel. Een omgekeerde microscoop en de digitale camera worden rechtsboven op de afbeelding weergegeven met de rode pijl. De rode cirkel vertegenwoordigt de locatie van de koelslang. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61685/61685fig02large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61685/61685fig03.jpg"> Figuur 3: Schematisch tweedimensionaal fasediagram voor eiwitkristallisatie als functie van temperatuur (A) en neerslagconcentratie (B). (A) In het geval van een eiwit met directe oplosbaarheid houdt het verlagen van de temperatuur de kristallisatieoplossing in de uitzaaibare zone. Temperatuurvariatie kan meerdere keren worden herhaald om het kristalgroeiproces te regelen totdat kristallen met het gewenste volume worden verkregen. (B) Het wijzigen van de concentratie van de neerslagoplossing kan ook worden gebruikt om de kristallisatieoplossing in de uitzaaibare zone voor het kweken van kristallen te houden. Deze figuur is aangepast van Junius et al. 8<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61685/61685fig03large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61685/61685fig04.jpg"> Figuur 4: Kristallen van lysozym verkregen met behulp van de dialysemethode. Dit experiment werd uitgevoerd bij een constante temperatuur van 293 K in 0,1 M natriumacetaatbuffer pH 4. Het verhogen van de NaCl-concentratie van 0,7 M naar 1,2 M verhoogt de nucleatiesnelheid en resulteert in een groter aantal kristallen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61685/61685fig04large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61685/61685fig05.jpg"> Figuur 5: Overzicht van het eiwitkristallisatieproces volgens de dialysemethode. (A) Door het eiwit toe te voegen aan de kamer van de dialyseknop, (B) ontstaat er een koepelvorm aan de bovenkant van de kamer. (C) Er wordt een applicator gebruikt om de O-ring over te brengen naar de groef van de dialyseknop om het dialysemembraan op zijn plaats te bevestigen. (D) De dialyseknop is klaar voor onderdompeling in de reservoiroplossing. (E) Kristallisatieoplossing gaat door het semipermeabele membraan en kristallen beginnen zich in de kamer te vormen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61685/61685fig05large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61685/61685fig06.jpg"> Figuur 6: Schematische weergave van de temperatuurgestuurde vloeiende dialyseopstelling. (A) Het eiwitmonster wordt aan de dialysekamer toegevoegd. (B) Het dialysemembraan wordt met een O-ring met behulp van een applicator op de overchamber bevestigd. (C) De overchamber wordt gedraaid en bevestigd aan de bovenkant van de dialysekamer. Witte pijlen geven aan waar schroeven op de overchamber worden geplaatst. (D) De reservoirkamer wordt met de klok mee gedraaid (E) en bovenop de overchamber bevestigd. (F) De reservoirkamer is bedekt met een luchtdichte dop met connectoren naar een pompsysteem en (G) de stroomcel wordt in de messing steun geplaatst. Deze figuur is aangepast van Junius et al. 8<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61685/61685fig06large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61685/61685fig07.jpg"> Figuur 7: Bereiding en injectie van de kristallisatieoplossing in het reservoir door het vloeistofsysteem (A). Buizen met zout en water zijn aangesloten op de druk-/vacuümregelaar (B) en op de draaiklep (C). Door gebruik te maken van de druk creëert de druk/vacuümregelaar een constante doorstroming van de vloeistoffen van de buizen naar de draaiklep. Elke vloeistof die door de debietmeter (D) gaat en de schakelaar wordt in de mengbuis (F) geïnjecteerd. Zodra alle vloeistoffen aan de mengbuis zijn toegevoegd, injecteert de schakelaar door enkele wijzigingen de uiteindelijke oplossing van de mengbuis in het reservoir (G). De vloeistof stroomt door het systeem in de richting van de pijlen in het diagram gemarkeerd in oplopende volgorde (van 1 tot 6). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61685/61685fig07large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61685/61685fig8v2.jpg"> Figuur 8: Onderhoudsweergave van de toezichtsoftware. Deze weergave wordt gebruikt om verschillende parameters te regelen, zoals temperatuur, licht, kristallisatieoplossing en zoom. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61685/61685fig8v2large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 9" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61685/61685fig09.jpg"> Figuur 9: Het fasediagram als functie van de temperatuur (geselecteerde afbeeldingen moeten in oplopende volgorde worden bijgehouden). Een enkel groot lysozymkristal wordt verkregen door de temperatuur systematisch te veranderen van 295 K naar 275 K. Bij elke stap wordt de kristalgroei gestopt bij het bereiken van de oplosbaarheidscurve. Het verlagen van de temperatuur door de oplossing in de uitzaaibare zone te houden, herstart de kristalgroei. De afbeeldingen hebben verschillende vergrotingsniveaus. Deze figuur is aangepast van Junius et al. 8,18<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61685/61685fig09large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 10" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61685/61685fig10.jpg"> Figuur 10: Optimalisatie van kristalgroei bij constante chemische samenstelling met behulp van temperatuurregeling (geselecteerde afbeeldingen moeten in oplopende volgorde worden bijgehouden). Het starten van het nucleatieproces in de nucleatiezone bij 291 K, ver van de uitzaaibare zone, resulteert in de vorming van talrijke kristallen. Het verhogen van de temperatuur tot 313 K lost vervolgens de kristallen op totdat er geen zichtbare kernen in de dialysekamer te zien zijn. Ten slotte herstart het verlagen van de temperatuur tot 295 K het nucleatieproces voor de tweede keer, wat leidt tot een beperkt aantal grotere kristallen. Deze figuur is aangepast van Junius et al. 8,18<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61685/61685fig10large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 11" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61685/61685fig11.jpg"> Figuur 11: Optimalisatie van kristalgroei bij constante temperatuur met behulp van variaties in neerslagconcentratie (geselecteerde beelden moeten in oplopende volgorde worden bijgehouden). Het verlagen van de neerslagconcentratie van 0,9 M naar 0 M lost de kristallen op die tijdens de eerste nucleatiegebeurtenis zijn verkregen. Het kristallisatieproces wordt opnieuw gestart door de injectie van hetzelfde neerslag, maar bij een lagere ionische sterkte, 0,75 M, wat leidt tot de vorming van een paar grotere kristallen. Deze figuur is aangepast van Junius et al. 8,18<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61685/61685fig11large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Optimization of Crystal Growth for Neutron Macromolecular Crystallography at JoVE.com

Optimization of Crystal Growth for Neutron Macromolecular Crystallography

Structurele studies van biomacromolecules door kristallografie vereisen hoogwaardige kristallen. Hier demonstreren we een protocol dat kan worden gebruikt door OptiCrys (een volledig geautomatiseerd instrument ontwikkeld in ons lab) en / of microdialyseknoppen voor het kweken van grote hoogwaardige kristallen op basis van kennis van het kristallisatiefasediagram.

Optimalisatie van kristalgroei voor neutronenmacromoleculaire kristallografie

The use of neutron macromolecular crystallography (NMX) is expanding rapidly with most structures determined in the last decade thanks to new NMX ...

Er zijn verschillende kristallisatiebenaderingen voor het verkrijgen van grote en hoogwaardige kristallen voor zowel röntgen- als neutronenkristallografie. Een van deze benaderingen is het gebruik van de dialysemethode. Bij deze techniek wordt de eiwitoplossing gescheiden van een neerslagoplossing door een semi-doorlatend membraan.De precipitante moleculen verspreiden zich over het membraan in de eiwitkamer. Wanneer de juiste oververzadiging voor een spontane nucleatie is bereikt, verschijnen de eerste kernen. Hier zullen we een protocol demonstreren dat kan worden gebruikt door OptiCrys, een volledig geautomatiseerd instrument dat in ons lab is ontwikkeld en dat gebruikmaakt van temperatuurgecontroleerde dialysekristallisatie, en onze microdialyseknoppen voor het kweken van grote kristallen van hoge kwaliteit voor natuurlijke macromoleculaire kristallografie op basis van kennis van het kristallisatiefasediagram.Voor een microdialyseknop met bepaalde microlitervolumepipet 35 microliter lysozymoplossing in de dialysekamer. Dit extra volume creëert een licht koepelvorm bovenop de dialysekamer en voorkomt luchtbelvorming. Neem een applicator en plaats het elastiek of de ring aan het uiteinde ervan.Plaats het membraan op de kamer en bevestig het door het elastiek of de ring van de applicator over te brengen naar de groef van de dialyseknop. Breng de knop over naar de put met de kristallisatieoplossing. Bedek de put met een glazen afdekstrook of een stuk tape.Bewaar het monster op 293 Kelvin in een trillingsvrije thermische regelaar incubator. Wetende dat de dialysekristallisatie voordelen biedt vanuit het oogpunt van kristalgroei, is de kristallisatiebank zogenaamde OptiCrys in ons laboratorium ontworpen en ontwikkeld om een volledig geautomatiseerde gecombineerde controle van temperatuur en chemische samenstelling van het biomoleculaire kristallisatie-experiment te bieden. De optimalisatie van de kristalgroei door OptiCrys is gebaseerd op de temperatuurprecipitante concentratiefasediagrammen.Nucleatie vindt plaats in de nucleatiezone in de buurt van de uitzaaibare zone en kristalgroei vindt vervolgens plaats in de uitzaaibare zone na fasediagram, totdat de eiwitconcentratie de oplosbaarheidscurve bereikt die het thermodynamische evenwicht tussen oplossing en kristallen vertegenwoordigt. Door de temperatuur te verlagen in het geval van het eiwit met directe oplosbaarheid of door de neerslagconcentratie te verhogen in geval van uitsnauwing, blijft de kristallisatieoplossing in de uitzaaibare zone en treedt er geen nucleatie op. Kristallen groeien tot het tweede kristaloplossingsevenwicht bereikt en daarna wordt geen verdere toename van de grootte van kristallen waargenomen.Het verlagen van de temperatuur of het verhogen van de neerslagconcentratie wordt meerdere keren herhaald totdat de kristallen de gewenste grootte bereiken. Voeg de eiwitoplossing toe aan de dialysekamer van de temperatuurgecontroleerde stroomopstelling, bedek de overkamer met het dialysemembraan en bevestig het membraan met het elastiek of de ring. Draai de overkamer om en leg deze bovenop de dialysekamer.Druk erop zachtjes en langzaam om alle lucht te verwijderen die tussen twee stukken is opgesloten, bevestig het reservoir in zijn positie door het voorzichtig bovenop de overkamer te schroeven. Voeg de kristallisatieoplossing toe aan de reservoirkamer en bedek deze met de luchtdichte dop. Breng deze assemblage over en plaats deze in de borststeun van de kristallisatiebank OptiCrys Kristalgroei is een supervisiesoftware van de Kristallisatiebank OptiCrys.Het bevat vier verschillende grafische interfaces of weergaven. De thuisweergave bevat knoppen om naar de andere weergaven te navigeren. Het doel van de installatie-interface is om een experiment scenario te definiëren dat automatisch kan worden uitgevoerd in de testweergave.De laatste weergave is de onderhoudsweergave. Als u een experiment opnieuw wilt starten, moet de onderhoudsweergave open zijn waar alle essentiële parameters voor het vloeiend uitvoeren van de kristallisatie-experimenten worden gevonden. Verhoog de helderheid van het lichtgedeelte, het licht kan toenemen van nul, geen licht tot 100 maximale helderheid.Voor het regelen en bewaken van de temperatuur wordt de sectie temperatuurregelaar gebruikt. Klik op de knop om deze in te schakelen. Stel de temperatuur in op het ingestelde puntgedeelte en druk op enter.Onder deze knop staan twee grafieken. De rode toont de finale, de ordertemperatuur en de gele grafiek toont de huidige temperatuur. Door het mengen van een voorraadoplossing wordt een injectie van de kristallisatieoplossing in de reservoirkamer geregeld door de palmsectie.Voeg de concentratie van de voorraadoplossing toe in de eerste fase. Zoek vervolgens de uiteindelijke concentratie van elke nieuwe groeperoplossing en voeg deze toe aan het uiteindelijke concentratiegedeelte. Nadat u op de knop Berekenen hebt gedrukt, wordt het volume van de voorraadoplossing berekend en wordt het volumepaneel voor elk concentratiepaneel toegevoegd.Druk op de startvoorbereidingsknop en wacht tot de nieuwe premier-oplossing klaar is. Voor het uitwisselen van de kristallisatieoplossing klikt u op de knop Oplossingsinvoer. Druk op de knop Distributie stoppen om het proces te stoppen.Aan de rechterkant van de microscoopsectie zijn er verschillende panelen voor het vastleggen van belangrijke informatie van elk kristalgroeiexperiment. Voeg in deze sectie de bijbehorende eiwitnaam, het molecuulgewicht en de kristallisatievoorwaarde toe. Definieer een naam voor uw experimenten door deze eenvoudigweg op de mapnaam te typen.Selecteer in de sectie NB-afbeeldingen het aantal afbeeldingen dat tijdens het experiment moet worden gemaakt. Voeg het nummer van de afbeeldingen toe en kies in het paneel aan de rechterkant de timerschaal. Klik op de mapknop om de map te openen.In deze map bevindt zich een tekstbestand met alle informatie die u eerder voor uw experiment hebt gedefinieerd. Afbeeldingen die klaar zijn voor verdere behandeling worden ook in deze map opgeslagen. Afzoomen op de microscoop kan ook automatisch worden gevarieerd.Hiermee wijzigt u uw zoom met behulp van de plus- en minknop boven op het microscoopgedeelte om respectievelijk de vergroting te vergroten of te verlagen. Er zijn drie verschillende manieren om de kristalgrootte te meten. Gebruik voor het meten van de lengte of breedte de breedtevector.Afhankelijk van de kristalvorm kunnen de specifieke gereedschappen uit het linkerdeel van het microscoopgedeelte worden gekozen. Zoals een rechthoekige of veelhoek. De waarden worden weergegeven in de metingssectie.In de eerste reeks experimenten werden microdialyseknoppen ondergedompeld in de kristallisatieoplossingen met verschillende zoutconcentraties. In dit eenvoudige kristallisatierasterexperiment is de enige variabele de neerslagconcentratie. terwijl de temperatuur constant wordt gehouden.Kleine variaties in de zoutconcentratie maken het mogelijk om het kristallisatiefasediagram te onderzoeken door de zoutconcentratie te verhogen van 0,7 naar 1,2 molaire oververzadigingsverhogingen en de oplossing in de nucleatiezone beweegt zich weg van de uitzaaibare zone. Bijgevolg wordt een variatie in grootte en aantal kristallen waargenomen waarbij het aantal kristallen toeneemt en hun grootte afneemt. In het eerste experiment met OptiCrys onder de gegeven experimentele toestand, zodra het evenwicht in de dialysekamer is bereikt, bevindt de kristallisatieoplossing zich in de nucleatiezone in de buurt van de uitzaaibare zone van het kristallisatiefasediagram.Als gevolg hiervan worden slechts enkele kernen gegenereerd tijdens de eerste fase van het experiment. Om de groei van kristallen in de uitzaaibare zone te houden en het kristalgroeiproces te beheersen, werd de temperatuur met verschillende tijdsintervallen gewijzigd. Elke keer dat het kristaloplossingsevenwicht was voltooid, was de temperatuur gevarieerd.Daarom daalde de temperatuur tot 291 Kelvin, 288 Kelvin en uiteindelijk 275 Kelvin om de groei van geselecteerd kristal in de uitzaaibare zone te behouden. Het resultaat van dit experiment is een enkel groot kristal, met het volume dat nodig is voor natuurlijke macromoleculaire kristallografie. De volgende twee experimenten tonen de omkeerbaarheid aan van de temperatuurgecontroleerde dialyse-experimenten voor nucleatie, kristalgroei, ontbinding en hergroei.In het tweede experiment met OptiCrys werd de chemische samenstelling van de kristallisatieoplossing constant gehouden door het experiment en varieerde de temperatuur. De begintemperatuur werd ingesteld op 291 Kelvin. Vanwege de hoge oververzadiging verscheen een groot aantal kleine kristallen in de kristallisatiekamer.In overeenstemming met het concept van directe eiwit oplosbaarheid, door geleidelijk de temperatuur te verhogen tot 313 Kelvin moesten alle kristallen worden opgelost. Ten slotte, door de temperatuur te verlagen tot 295 Kelvin, begon de tweede nucleatie in de buurt van de uitzaaibare zone en liet het nucleatieproces controleren, wat resulteerde in het vormen van een lager aantal kernen. Verdere kristalgroei maakte het mogelijk om de uniforme populatie van grotere kristallen te genereren.In dit experiment leidt het veranderen van de chemische samenstelling van de kristallisatieoplossing bij constante temperatuur tot het verkrijgen van een uniforme populatie grotere kristallen. De kristallisatietoestand was vergelijkbaar met het vorige experiment. Het oplossen van de kristallen werd bereikt door de NaCl-concentratie geleidelijk te verlagen van 0,9 molaar naar nul.Het verlagen van de zoutconcentratie houdt de oplossing in de onderverzadigde zone van het fasediagram, wat leidt tot de ontbinding van de kristallen. Vervolgens werd de nieuwe kristallisatieoplossing met een lagere ionische sterkte dan voorheen in de reservoirkamer geïnjecteerd. Bij deze neerslagconcentratie verschijnt het lagere aantal kristallen en bereiken de kristallen een groter volume dan voorheen.Hier hebben we een gedetailleerd protocol verstrekt dat de monstervoorbereiding beschrijft en de besturingssoftware aanpast voor het kweken van grote en hoogwaardige kristallen voor natuurlijke macromoleculaire kristallografie met behulp van een volledig geautomatiseerd instrument dat in ons lab is ontwikkeld. Deze stapsgewijze procedure is ontworpen en profiteert van de kennis van het kristallisatiefasediagram om nucleatie en kristalgroei te scheiden. Bovendien wordt een protocol voor het kweken van kristallen met microcytosepatronen ook gepresenteerd met behulp van macrocytoseknoppen als alternatief wanneer OptiCrys niet beschikbaar is.Naast de strategieën die ik noemde voor OptiCrys het veranderen van de chemische samenstelling van de kristallisatie-oplossing en temperatuur en het nemen van foto's moet handmatig worden gedaan. Het gebruik van de thermische gereguleerde trilling voor de incubator om de temperatuur constant te houden is vereist, wat een kritieke stap is in de aangetoonde methodologie.

Research

JoVE Journal

Biology

Protein Crystallization for X-ray Crystallography

Eiwitkristallisatie voor X-ray kristallografie

Using the three-dimensional structure of biological macromolecules to infer how they function is one of the most important fields of modern biology. The ...

Isolation and Biophysical Study of Fruit Cuticles

Isolatie en Biofysische Studie van Fruit nagelriemen

The cuticle, a hydrophobic protective layer on the aerial parts of terrestrial plants, functions as a versatile defensive barrier to various biotic and ...

Harvesting and Cryo-cooling Crystals of Membrane Proteins Grown in Lipidic Mesophases for Structure Determination by Macromolecular Crystallography

Oogst en Cryo-koeling kristallen van membraaneiwitten Grown in lipide mesofasen voor structuurbepaling door Macromoleculaire Kristallografie

An important route to understanding how proteins function at a mechanistic level is to have the structure of the target protein available, ideally at ...

In Vitro Analysis of PDZ-dependent CFTR Macromolecular Signaling Complexes

In Vitro Analysis of PDZ-dependent CFTR Macromolecular Signaling Complexes

In vitro analyse van PDZ-afhankelijke CFTR Macromoleculaire signaalcomplexen

Cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR), a chloride channel located primarily at the apical membranes of epithelial cells, plays a ...

Iterative Optimization of DNA Duplexes for Crystallization of SeqA-DNA Complexes

Iteratieve optimalisatie van DNA-duplexen voor kristallisatie van SeqA-DNA complexen

Escherichia coli SeqA is a negative regulator of DNA replication that prevents premature reinitiation events by sequestering hemimethylated GATC clusters ...

Optimization and Utilization of Agrobacterium-mediated Transient Protein Production in Nicotiana

Optimization and Utilization of Agrobacterium-mediated Transient Protein Production in Nicotiana

Optimalisatie en het gebruik van<em&gt; Agrobacterium</em&gt;-Gemedieerde Transient eiwitproductie in<em&gt; Nicotiana</em

Agrobacterium-mediated transient protein production in plants is a promising approach to produce vaccine antigens and therapeutic proteins within a short ...

Production of Human Norovirus Protruding Domains in E. coli for X-ray Crystallography

Production of Human Norovirus Protruding Domains in E. coli for X-ray Crystallography

De productie van de mens Norovirus uitstekende Domeinen in<em&gt; E. coli</em&gt; Voor röntgenkristallografie

The norovirus capsid is composed of a single major structural protein, termed VP1. VP1 is subdivided into a shell (S) domain and a protruding (P) domain. ...

Medium-throughput Screening Assays for Assessment of Effects on Ca2+-Signaling and Acrosome Reaction in Human Sperm

Medium-throughput Screening Assays for Assessment of Effects on Ca2+-Signaling and Acrosome Reaction in Human Sperm

Medium-throughput Screening tests voor de beoordeling van effecten op Ca2 +-signalering en Acrosoom reactie in het menselijk sperma

Ca2+-signaling is essential to normal sperm cell function and male fertility. Similarly, the acrosome reaction is vital for the ability of a human sperm ...