Name: optimization of crystal growth for neutron macromolecular crystallography
Uploaded: 2021-03-13T14:00:00
Duration: 12 min 29 s
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MBS reconnaît le soutien du LABEX VALO GRAL dans le cadre du contrat 2015. NJ reconnaît le Programme international de recherche doctorale (Irtelis) du CEA pour la bourse de doctorat. Les auteurs reconnaissent le financement du Programme horizon 2020 de recherche et d’innovation de l’Union européenne dans le cadre de l’accord de subvention Marie Skłodowska-Curie numéro 722687. Les auteurs sont également reconnaissants au Dr Esko Oksanen (ESS, Lund) et au Dr Jean-Luc Ferrer (IBS, Grenoble) pour leurs conversations et leurs idées utiles. IBS reconnaît son intégration à l’Institut interdisciplinaire de recherche de Grenoble (IRIG, CEA).

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	<li>Blakeley, M. P., Langan, P., Niimura, N., Podjarny, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutron+crystallography:+opportunities,+challenges,+and+limitations.">Neutron crystallography: opportunities, challenges, and limitations.</a> Current Opinion in Structural Biology. 18 (5), 593-600 (2008).</li><li>Snell, E. H., Van Der Woerd, M. J., Damon, M., Judge, R. A., Myles, D. A. A., Meilleur, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimizing+crystal+volume+for+neutron+diffraction:+D-xylose+isomerase.">Optimizing crystal volume for neutron diffraction: D-xylose isomerase.</a> European Biophysics Journal. 35 (7), 621-632 (2006).</li><li>Ng, J. D., Baird, J. K., Coates, L., Garcia-Ruiz, J. M., Hodge, T. 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Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Différentes variables physiques, chimiques et biologiques influencent la cristallisation des protéines en affectant la solubilité protéique21. Parmi ces variables, la température et la composition chimique de la solution de cristallisation sont utilisées ici en combinaison avec la technique de dialyse pour améliorer et cultiver de grands cristaux de haute qualité de biomacromolecules pour les études de diffraction neutronique. En utilisant la connaissance des diagrammes de phase, la cristallisation est rendue plus prévisible. Bien que le criblage des différentes conditions de cristallisation dans une approche sérielle soit également possible, l’objectif principal d’utiliser les approches rationnelles présentées est de séparer et de contrôler la cinétique de la nucléation et de la croissance cristallines.
Comme toutes les études de cristallisation, des échantillons de protéines pures et homogènes de haute qualité et des solutions de cristallisation sans poussière augmentent le taux de réussite de l’expérience. La filtration et la centrifugation des solutions sont des étapes essentielles dans les protocoles décrits. Connaître les propriétés physicochimiques des protéines étudiées telles que le poids moléculaire (pour choisir la membrane de dialyse appropriée), le point isoélectrique, et la solubilité protéique sont cruciales pour la conception d’une expérience optimale de croissance cristalline. En outre, il faut tenir compte de la stabilité des protéines à des températures différentes ou avec différents produits chimiques pour prévenir la perte d’échantillons et augmenter les chances de succès. Compte tenu de la plage de température d’OptiCrys (233,0-353,0 ± 0,1 K), un large éventail de protéines peuvent être cristallisées à l’aide de celui-ci. Mais il convient de souligner que les protéines qui sont principalement thermo-stables, telles que les protéines provenant de sources thermophiles, bénéficieraient le plus dans les expériences de croissance des cristaux à grand volume contrôlées par la température offertes par cet instrument.
À l’aide d’une chambre de dialyse à faible volume (lors de l’utilisation des boutons OptiCrys) ou de microdialyse et du criblage de plusieurs températures et conditions de cristallisation (p. ex., grilles de concentration ou de pH précipités), il est possible d’obtenir des informations sur l’emplacement de la limite de la zone métastable (équilibre cinétique entre la nucléation et les zones métastables). Ceci est inestimable lors de la conception d’une expérience réussie de croissance du cristal en particulier pour les nouveaux candidats protéinés dans la cristallisation. Sans cette information, les expériences peuvent partir d’une zone du diagramme de phase avec une sursaturation élevée, trop loin de la limite de la zone métastable pour contrôler facilement la nucléation cristalline. Bien que la dissolution du précipité protéique puisse être tentée, par exemple en augmentant la température en cas de solubilité directe, pour les protéines dont la thermostabilité est réduite, le maintien de l’échantillon à haute température pendant une plus longue période peut rendre les précipitations protéiques irréversibles. Ainsi, la meilleure stratégie consiste à utiliser une condition initiale avec une sursaturation inférieure située près de la limite de la métastabilité, où la nucléation peut être contrôlée et les précipitations protéiques évitées. Dans cette lignée, le pré-dépistage de la cristallisation diminue les chances d’avoir un précipité protéique dans la chambre de dialyse et augmente le taux de réussite de l’expérience.
Après avoir conçu une expérience, la préparation de chambres de dialyse (OptiCrys) ou de boutons de microdialyse est une autre étape importante. La prévention de la formation de bulles d’air dans la chambre/bouton de dialyse augmente les chances de cristallisation réussie, surtout lorsque de petits volumes sont utilisés. La présence de bulles d’air dans la chambre de dialyse peut également modifier la cinétique du processus de cristallisation et réduire la reproductibilité de l’expérience (parce que la surface de contact protéine/solution a été modifiée). Non seulement la protéine, mais aussi la solution de cristallisation peut affecter le succès de l’expérience. L’utilisation de nouveaux tubes de 50 mL pour le système de pompage chaque fois que l’on veut commencer une nouvelle expérience et le lavage des tubes après chaque expérience diminue les risques de contamination et évite la création de cristaux de sel dans l’appareil.
L’utilisation de boutons de microdialyse est une alternative lorsque OptiCrys n’est pas disponible. Les stratégies d’optimisation de la cristallisation et de suivi de la croissance du cristal mentionnées ci-dessus doivent être menées manuellement. En règle générale, cela nécessite d’être en dehors d’un incubateur thermoréguléré, ce qui peut être problématique lorsque la régulation de la température est une étape critique dans la méthodologie décrite. Cela ne facilite pas la modification de la composition chimique des solutions de cristallisation, ni la surveillance de la croissance du cristal par imagerie, de sorte que le processus de croissance du cristal ne peut pas être contrôlé en temps réel.
La connaissance du diagramme de phase est à la base de l’utilisation du banc de cristallisation, OptiCrys, pour cultiver systématiquement de gros cristaux de haute qualité de manière automatisée. Le contrôle des paramètres physicochimiques tels que la température, la concentration des précipités et le pH pendant la cristallisation déplace l’équilibre protéine-solution dans une trajectoire cinétique bien définie à travers le diagramme de phase. Ceci est complété par l’utilisation d’une membrane de dialyse pour ajuster le transport de masse et créer un gradient contrôlé dans la chambre de cristallisation qui affecte la taille et la qualité des cristaux. Par conséquent, l’utilisation de données thermodynamiques et de trajectoires cinétiques est essentielle pour contrôler le processus de cristallisation afin de cultiver des cristaux de haute qualité. Grâce à OptiCrys, les diagrammes de phase systématiques dans un espace multidimensionnel peuvent être étudiés avec une approche sérielle en utilisant beaucoup moins de matériaux qu’auparavant. Pour démontrer cette méthodologie, nous fournissons ici une étude de cas avec une protéine modèle, le lysozyme blanc d’œuf de poulet. En utilisant et en maîtrisant le protocole présenté ici, on peut l’adapter à de vrais systèmesprotéiques 5,14,17,18.

Comprendre la relation structure-fonction des protéines et le mécanisme des voies physiologiques repose souvent sur la connaissance des positions des atomes d’hydrogène (H) et sur la façon dont la charge est transférée dans uneprotéine 1,2. Puisque les atomes d’hydrogène dispersent faiblement les rayons X, leurs positions ne peuvent être déterminées qu’avec des données de diffraction des rayons X à très haute résolution (>1 Å)3,4. Inversement, la cristallographie neutronique peut être utilisée pour obtenir une position précise des atomes d’hydrogène dans les macromolécules biologiques, car les atomes d’hydrogène et de deutérium (H2,isotope de l’hydrogène) ont des longueurs de diffusion d’une magnitude à peu près égale à l’oxygène, à l’azote et aucarbone 5. Cependant, le flux neutronique provenant des sources de neutrons disponibles est plus faible que celui des faisceaux de rayons X, de sorte que cela doit souventêtre compensé pour 2,3. Ceci peut être réalisé en échangeant H avec H2 et/ou en augmentant le volume des cristaux pour réduire la diffusion incohérente des hydrogènes et augmenter le rapport signal-bruit des images de diffraction.
Il existe diverses approches de cristallisation (le diagramme de phase schématique correspondant est indiqué à la figure 1)pour l’obtention de cristaux de grande et de haute qualité pour la cristallographie biomoléculaire aux rayons X et aux neutrons6. Dans la diffusion de vapeur, une gouttelette préparée à partir d’un mélange d’une protéine et d’une solution de cristallisation est équilibrée au fil du temps, par évaporation de l’eau ou d’autres espèces volatiles, contre un réservoir contenant une concentration plus élevée de précipitation de la même solution de cristallisation. L’augmentation de la concentration de protéines et de précipitation dans la gouttelette conduit à la sursaturation nécessaire à la nucléation spontanée suivie d’une croissance cristalline à ces noyaux6,7. Bien que la diffusion de vapeur soit la technique la plus fréquemment utilisée pour la croissance descristaux 4,le processus de cristallisation ne peut pas être contrôléavec précision 8. Dans la méthode de diffusion de l’interface libre, la solution de cristallisation se diffuse en une solution protéique concentrée, orientant très lentement le système vers la sursaturation. Cette méthode peut être considérée comme une méthode de lot avec un taux de mélangelent 6,9,10,11,12. Dans la méthode de lot, la protéine est rapidement mélangée avec une solution de cristallisation menant à la sursaturation rapide et à son tour nucléation uniformeavec beaucoup de cristaux 3,7. Cette méthode représente environ un tiers de toutes les structures actuellement déposées dans la Banque de données sur les protéines. La méthode de dialyse est également utilisée pour la culture de cristaux protéiques de haute qualité et bien réfractaires. Dans la méthode de dialyse, les molécules de précipitation diffusent à partir d’un réservoir à travers une membrane semi-perméable dans une chambre séparée avec la solution protéique. La cinétique de l’équilibrage dépend de divers facteurs, tels que la température, la taille des pores membranaires et le volume et la concentration d’échantillons de protéines et d’agents de cristallisation6.
Les diagrammes de phase de cristallisation peuvent être utilisés pour décrire différents états d’une protéine en fonction de différentes variables physiques ouchimiques 3. Comme l’illustre la figure 1, chaque technique de cristallisation peut être visualisée comme utilisant une trajectoire cinétique différente pour atteindre la nucléation et les zones métastables d’un teldiagramme 6,10,13. Ceci fournit l’information au sujet de la solubilité de protéine et de la concentration de protéine à laquelle un équilibre thermodynamique entre le cristal et la solution est observé, trouvant de ce fait les conditions optimales pour la nucléationet la croissance 3,14. Dans un diagramme de phase bidimensionnel, la concentration en protéines est tracée en fonction d’une variable et les autres variables sont maintenues constantes15. Dans un tel diagramme de phase, lorsque la concentration de protéines est inférieure à la courbe de solubilité, la solution se trouve dans la région sous-saturée et aucune nucléation ou croissance cristalline ne se produit. Au-dessus de cette courbe se trouve la zone de sursaturation où la concentration en protéines est supérieure à la limite de solubilité3,14. Celui-ci est ensuite divisé en trois régions : la zone métastable, la zone de nucléation spontanée et la zone de précipitations. Dans la zone métastable, la sursaturation n’est pas suffisante pour que la nucléation se produise dans un délai raisonnable, mais la croissance des cristaux ensemencés peut avoir lieu. L’agrégation et les précipitations sont favorisées dans la zone de précipitations, où la sursaturationest trop élevée 14,15.
Lorsque la sursaturation suffisante pour la nucléation spontanée est atteinte, les premiers noyaux apparaîtront10. La croissance des cristaux conduit à une réduction de la concentration en protéines jusqu’à ce que la limite de solubilité soit atteinte. Tant que la sursaturation restera à proximité de la courbe de solubilité, il n’y aura pas de changement significatif dans la taille des cristaux. Cependant, il a été démontré que les variations de la température et de la composition chimique de la solution de cristallisation (par exemple, la concentration de précipitation) affecteront la solubilité protéique et peuvent conduire à l’initiation d’une croissancecristalline supplémentaire 8,13,16.
Comme la dialyse est avantageuse pour une croissance cristalline de bonne qualité, le banc de cristallisation OptiCrys illustré dans la figure 2, a été conçu et développé dans notre laboratoire pour contrôler la cristallisation d’une manièreentièrement automatisée 8. À cette fin, un logiciel a été écrit avec LabVIEW qui permet le contrôle et la surveillance de la température d’une installation de dialyse réservoir qui coule en contact avec les éléments Peltier, via un contrôleur électronique et un refroidisseur. Le même logiciel régule également automatiquement la composition chimique de la solution de cristallisation (par exemple l’échange d’agents de cristallisation) à l’aide d’un système fluidique multicanal. En outre, un appareil photo numérique et un microscope inversé sont utilisés pour visualiser et enregistrer le processus de cristallisation. Deux chambres de cristallisation de 15 μL et 250 volumes de μL sont disponibles pour la culture de cristaux à des fins différentes. Comme le processus de cristallisation est réversible, le criblage pour différentes conditions est possible avec seulement quelques microlitres de la solution protéique tant que l’échantillon n’est pasendommagé 8. Par conséquent, l’utilisation de cette méthode minimise la quantité de protéines utilisées.
D’après lestravaux antérieurs 8, il est évident que pendant le processus de croissance du cristal, des observations in situ doivent être effectuées à intervalles réguliers. Ceux-ci peuvent varier de quelques secondes à plusieurs jours, selon l’événement en observation (précipitations, nucléation ou croissance cristalline).
L’optimisation de la croissance du cristal avec OptiCrys est basée sur des diagrammes de phase de concentration de précipitation de température. Dans le cas des protéines dont la solubilité est une fonction directe de la température, il est possible d’utiliser le régime de salage18. C’est là que l’augmentation de la force ionique de la solution, qui peut être visualisée à l’aide de diagrammes de phase protéique-précipitant, diminue la solubilité de la protéine. De même, les protéines avec la solubilité inverse peuvent faire usage du régime de salage-dans18. La nucléation se produit dans la zone de nucléation, à proximité de la zone métastable, et la croissance du cristal a alors lieu dans la zone métastable du diagramme de phase jusqu’à ce que la concentration protéique atteigne la limite de solubilité. Comme le montre la figure 3A, avec une température de composition chimique constante peut être diminuée pour maintenir la solution de cristallisation dans la zone métastable pour empêcher la nouvelle nucléation. Les cristaux poussent jusqu’à ce que le deuxième équilibre cristal/solution soit atteint et après cela, aucune autre augmentation de la taille des cristaux n’est observée. La température est diminuée plusieurs fois jusqu’à ce que les cristaux atteignent la taille désirée. Dans la figure 3B,à température constante, l’augmentation de la concentration de précipitation maintient la solution dans la zone métastable. Ce processus peut ensuite être répété plusieurs fois pour obtenir de gros cristaux. Changer la température et manipuler les conditions de la solution de cristallisation, en contrôlant les niveaux de sursaturation, sont deux outils puissants pour séparer la nucléation et la croissance des cristaux qui sont contrôlés précisément et automatiquement par OptiCrys5,8,14.
Des exemples de cristaux protéiques cultivés par cristallisation contrôlée par la température, ou à température et précipitation contrôlée par concentration, ainsi que des données relatives de diffraction obtenues sont disponibles dans la littérature et la PDB. Parmi eux se trouvent la γ-crystalline E humaine, la lectine PA-IIL, la pyrophosphatase inorganique de levure, l’oxidase urate, l’anhydrase carbonique humaine II, la kinase YchB et la déshydrogénase lactate5,14,17,18.
Bien qu’OptiCrys ait été commercialisé par NatX-ray, il existe de nombreux laboratoires qui n’ont pas accès à cet instrument ou à l’approche sérielle qu’il offre. L’alternative à cette technique est d’utiliser des boutons de microdialyse plastique disponibles dans le commerce avec différents volumes. En utilisant ceux-ci, la température et la composition chimique peuvent être ajustées et variées manuellement. L’inspection des boutons de microdialyse ne peut se faire in situ et doit plutôt se faire manuellement au microscope optique. Le contrôle de la température peut être réalisé en gardant l’échantillon dans un incubateur à température contrôlée sans vibrations. Il est essentiel de maintenir la température constante pour s’assurer que les expériences de cristallisation sont reproductibles. Des variations significatives de température peuvent également entraîner des dommages ou la destruction des cristaux5.
Nous fournissons ici un protocole détaillé décrivant la préparation des échantillons et l’utilisation d’un logiciel de contrôle pour la croissance de gros cristaux de haute qualité adaptés à la cristallographie des protéines neutroniques. Cette procédure étape par étape a été conçue pour tirer parti du diagramme de phase de cristallisation afin de sélectionner une position de départ et un chemin cinétique pour contrôler la taille et la qualité des cristaux générés. En outre, un protocole détaillé pour la culture des cristaux avec des boutons de microdialyse est présenté qui utilise la même justification pour obtenir de grands cristaux de haute qualité.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>200 &#181;l Dialysis Button</td>
			<td>Hampton Research</td>
			<td>HR3-330</td>
			<td>Dialysis button</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24 well plates</td>
			<td>Jena Bioscience</td>
			<td>CPL-132</td>
			<td>Crystallization plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Switch</td>
			<td>FLUIGENT</td>
			<td>2SW001</td>
			<td>Switch</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>30 &#956;l Dialysis Button</td>
			<td>Hampton Research</td>
			<td>HR3-324</td>
			<td>Dialysis button</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL Corning Centrifuge tubes</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>CLS430828-500EA</td>
			<td>Centrifuge tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S2889</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chicken Egg White Lysozyme</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L6876</td>
			<td>Lyophilized protein powder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dialysis Membrane Discs 6-8 kDa MWCO</td>
			<td>Spectrum</td>
			<td>132478</td>
			<td>Dialysis membrane</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dialysis Membrane Tubing 6-8 kDa MWCO</td>
			<td>Spectrum</td>
			<td>132650T</td>
			<td>Dialysis membrane</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>Minispin</td>
			<td>Bench-top centrifuge</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow Unit</td>
			<td>FLUIGENT</td>
			<td>FLU-XL</td>
			<td>Flow meter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flowboard</td>
			<td>FLUIGENT</td>
			<td>FLB</td>
			<td>Flowboard</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microfluidic Flow Control System EZ</td>
			<td>FLUIGENT</td>
			<td>EZ-01000002</td>
			<td>Pressure/vacuum controller</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MilliporeSigma 0.22 &#181;m syringe Filters</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>GSWP04700</td>
			<td>0.22 &#956;m pore size filter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M-Switch</td>
			<td>FLUIGENT</td>
			<td>MSW002</td>
			<td>Rotary valve</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opticrys</td>
			<td>NatX-ray</td>
			<td>PRT008</td>
			<td>Crystallization bench</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Siliconized circle cover slides</td>
			<td>Hampton Research</td>
			<td>HR3-231</td>
			<td>Glass slides</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride &#8805; 99%</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>746398</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Switchboard</td>
			<td>FLUIGENT</td>
			<td>SWB002</td>
			<td>Switchboard</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermoregulated incubator</td>
			<td>Memmert</td>
			<td>IPP30</td>
			<td>Thermoregulated incubator</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

optimization of crystal growth for neutron macromolecular crystallography

L’utilisation de la cristallographie macromoléculaire neutronique (NMX) se développe rapidement avec la plupart des structures déterminées au cours de la dernière décennie grâce à la construction de nouvelles lignes de faisceauX NMX et à la disponibilité accrue de logiciels de raffinement de la structure. Cependant, les sources de neutrons actuellement disponibles pour NMX sont significativement plus faibles que les sources équivalentes pour la cristallographie aux rayons X. Malgré les progrès réalisés dans ce domaine, des cristaux beaucoup plus gros seront toujours nécessaires pour les études de diffraction neutronique, en particulier avec la tendance à étudier des macromolécules et des complexes de plus en plus grands. D’autres améliorations des méthodes et de l’instrumentation adaptées à la croissance de cristaux plus gros sont donc nécessaires à l’expansion de l’utilisation de NMX.
Dans ce travail, nous introduisons des stratégies rationnelles et un banc de croissance cristalline (OptiCrys) développé dans notre laboratoire qui combine l’observation en temps réel à l’aide d’une caméra vidéo montée au microscope avec un contrôle automatisé précis des solutions de cristallisation (p. ex., concentration de précipités, pH, additif, température). Nous démontrons ensuite comment ce contrôle de la température et de la composition chimique facilite la recherche de conditions de cristallisation optimales à l’aide de protéines solubles modèles. Une connaissance approfondie du diagramme de phase de cristallisation est cruciale pour choisir la position de départ et le chemin cinétique pour toute expérience de cristallisation. Nous montrons comment une approche rationnelle peut contrôler la taille et le nombre de cristaux générés en fonction de la connaissance des diagrammes de phase multidimensionnels.

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Optimization of Crystal Growth for Neutron Macromolecular Crystallography

Les études structurelles des biomacromolecules par cristallographie nécessitent des cristaux de haute qualité. Ici, nous démontrons un protocole qui peut être utilisé par OptiCrys (un instrument entièrement automatisé développé dans notre laboratoire) et / ou boutons de microdialyse pour la croissance de gros cristaux de haute qualité basée sur la connaissance du diagramme de phase de cristallisation.

Optimisation de la croissance cristalline pour la cristallographie macromoléculaire neutronique

The use of neutron macromolecular crystallography (NMX) is expanding rapidly with most structures determined in the last decade thanks to new NMX ...

Il existe différentes approches de cristallisation pour l’obtention de cristaux de grande et de haute qualité pour la cristallographie aux rayons X et aux neutrons. L’une de ces approches consiste à utiliser la méthode de dialyse. Dans cette technique, la solution protéique est séparée d’une solution précipitée par une membrane semi-perméable.Les molécules précipitantes se diffusent à travers la membrane dans la chambre protéique. Lorsque la supersaturation correcte pour une nucléation spontanée est atteinte, les premiers noyaux apparaîtront. Ici, nous allons démontrer un protocole qui peut être utilisé par OptiCrys un instrument entièrement automatisé développé dans notre laboratoire qui utilise la cristallisation de dialyse à température contrôlée, et nos boutons de micro dialyse pour la croissance de gros cristaux de haute qualité pour la cristallographie macromoléculaire naturelle basée sur la connaissance du diagramme de phase de cristallisation.Pour un bouton de micro dialyse avec certains tuyaux de volume microliter 35 microlitres de solution lysozyme dans la chambre de dialyse. Ce volume supplémentaire crée une forme légèrement dôme sur le dessus de la chambre de dialyse et empêche la formation de bulles d’air. Prenez un applicateur et placez l’élastique ou l’anneau à l’extrémité de celui-ci.Placez la membrane sur le dessus de la chambre et fixez-la en transférant l’élastique ou l’anneau de l’applicateur à la rainure du bouton de dialyse. Transférez le bouton au puits contenant la solution de cristallisation. Couvrir le puits d’un slip de couverture en verre ou d’un morceau de ruban adhésif.Gardez l’échantillon à 293 Kelvin dans un incubateur de régulateur thermique sans vibrations. Sachant que la cristallisation de la dialyse offre des avantages du point de vue de la croissance du cristal, le banc de cristallisation dit OptiCrys a été conçu et développé dans notre laboratoire pour offrir un contrôle combiné entièrement automatisé de la température et de la composition chimique de l’expérience de cristallisation biomoléculaire. L’optimisation de la croissance du cristal par OptiCrys est basée sur les diagrammes de phase de concentration des précipités de température.La nucléation se produit dans la zone de nucléation à proximité de la zone métastable et la croissance du cristal se produit ensuite dans la zone métastable après diagramme de phase, jusqu’à ce que la concentration de protéines atteigne la courbe de solubilité représentant l’équilibre thermodynamique entre la solution et les cristaux. En diminuant la température en cas de protéine avec solubilité directe ou en augmentant la concentration de précipitation en cas de salage atteignant, la solution de cristallisation reste dans la zone métastable et aucune nucléation ne se produit. Les cristaux poussent jusqu’à ce que le deuxième équilibre de solution cristalline atteigne et après cela, aucune autre augmentation de la taille des cristaux n’est observée.La diminution de la température ou l’augmentation de la concentration de précipitation sont répétées plusieurs fois jusqu’à ce que les cristaux atteignent la taille désirée. Ajouter la solution protéique à la chambre de dialyse de la température contrôlée qui coule, couvrir la chambre avec la membrane de dialyse et fixer la membrane avec l’élastique ou l’anneau. Retournez la chambre et placez-la sur la chambre de dialyse.Appuyez doucement et lentement pour enlever tout l’air emprisonné entre deux morceaux, fixer le réservoir en sa position en le vissant doucement sur le dessus de la chambre au-dessus. Ajouter la solution de cristallisation à la chambre du réservoir et la couvrir par le bouchon hermétique. Transférer cet assemblage et l’insérer dans le support mammaire du banc de cristallisation OptiCrys Crystal growth est un logiciel de supervision du Banc de Cristallisation OptiCrys.Il comprend quatre interfaces graphiques ou vues différentes. La vue d’accueil contient des boutons pour naviguer vers les autres vues. Le but de l’interface de configuration est de définir un scénario d’expérience qui peut être exécuté automatiquement dans la vue de test.La dernière vue est la vue maintenance. Pour redémarrer une expérience, la vue maintenance doit être ouverte où se trouvent tous les paramètres essentiels pour le bon déroulement des expériences de cristallisation. Augmenter la luminosité de la section lumière, la lumière peut augmenter de zéro, pas de lumière à 100 luminosité maximale.Pour le contrôle et la surveillance de la température, la section régulateur de température est utilisée. Cliquez sur le bouton pour l’allumer. Réglez la température sur la section de point défini et appuyez sur entrez.Sous ce bouton, il y a deux graphiques. Le rouge montre la finale, la température de commande et le graphique jaune montre la température actuelle. Mélangeant une solution de stock, une injection de la solution de cristallisation à la chambre du réservoir est contrôlée par la section Palm.Ajouter la concentration de la solution de stock dans la première étape. Ensuite, trouvez la concentration finale de chaque nouvelle solution de groupeur et ajoutez-les à la section de concentration finale. Après avoir appuyé sur le bouton calculer, découvrez le volume de la solution stock sera calculé et ajoutera dans le panneau de volume en face de chaque panneau de concentration.Appuyez sur le bouton de préparation du lancement et attendez que la nouvelle solution premier ministre soit prête. Pour échanger la solution de cristallisation, cliquez sur le bouton Entrée de la solution. Pour arrêter le processus, appuyez sur le bouton Stop Distribution.Sur le côté droit de la section microscope, Il existe plusieurs panneaux pour enregistrer des informations importantes de chaque expérience de croissance cristalline. Ajoutez le nom correspondant de protéines, le poids moléculaire et l’état de cristallisation dans cette section. Définissez un nom pour vos expériences en le tapant simplement sur le nom du dossier.À partir de la section images nb, sélectionnez le nombre d’images qui doivent être prises pendant l’expérience. Ajoutez le nombre d’images et à partir du panneau sur la droite, choisissez l’échelle de la mise à jour. Cliquez sur le bouton dossier pour ouvrir le dossier.Dans ce dossier, il y a un fichier texte contenant toutes les informations que vous avez précédemment définies pour votre expérience. Les images prêtes pour tout autre traitement sont également enregistrées dans ce dossier. Le zoom arrière sur le microscope peut également être modifié automatiquement.Modifie votre zoom en utilisant le bouton plus et moins sur le dessus de la section microscope pour augmenter ou diminuer le grossissement respectivement. Il existe trois façons différentes de mesurer la taille du cristal. Pour mesurer la longueur ou la largeur, utilisez le vecteur de largeur.Selon la forme cristalline, les outils spécifiques de la partie gauche de la section microscope peuvent être choisis. Comme un rectangulaire ou un polygone. Les valeurs apparaîtront dans la section mesure.Dans la première série d’expériences, les boutons de microdialyse ont été immergés dans les solutions de cristallisation avec différentes concentrations de sel. Dans cette simple expérience de grille de cristallisation, la seule variable est la concentration précipitée. tandis que la température est maintenue constante.De légères variations de la concentration de sel permettent d’étudier le diagramme de phase de cristallisation en augmentant la concentration de sel de 0,7 à 1,2 augmentation de la sursaturation molaire et la solution dans la zone de nucléation s’éloigne de la zone métastable. Par conséquent, une variation de taille et de nombre de cristaux est observée avec l’augmentation du nombre de cristaux et la diminution de leur taille. Dans la première expérience avec OptiCrys dans l’état expérimental donné, une fois que l’équilibre dans la chambre de dialyse atteint, la solution de cristallisation est dans la zone de nucléation à proximité de la zone métastable du diagramme de phase de cristallisation.Par conséquent, seuls quelques noyaux sont générés au cours de la première phase de l’expérience. Afin de maintenir la croissance des cristaux dans la zone métastable et de contrôler le processus de croissance du cristal, la température a été modifiée à différents intervalles de temps. Chaque fois que l’équilibre de la solution cristalline était terminé, la température était variée.Par conséquent, la température a diminué à 291 Kelvin, 288 Kelvin et enfin 275 Kelvin pour maintenir la croissance du cristal sélectionné dans la zone métastable. Le résultat de cette expérience est un seul gros cristal, avec le volume requis pour la cristallographie macromoléculaire naturelle. Les deux expériences suivant démontrent la réversibilité des expériences de dialyse à température contrôlée pour la nucléation, la croissance des cristaux, la dissolution et la repousse.Dans la deuxième expérience avec OptiCrys, la composition chimique de la solution de cristallisation a été maintenue constante tout au long de l’expérience et la température a varié. La température initiale a été fixée à 291 Kelvin. En raison de la sursaturation élevée, un grand nombre de petits cristaux sont apparus dans la chambre de cristallisation.Conformément au concept de solubilité protéique directe, en augmentant progressivement la température à 313 Kelvin tous les cristaux devaient se dissoudre. Enfin, en abaissant la température à 295 Kelvin, la deuxième nucléation a commencé à proximité de la zone métastable et a permis de contrôler le processus de nucléation entraînant la formation d’un nombre inférieur de noyaux. Une nouvelle croissance cristalline a permis de générer la population uniforme de cristaux plus gros.Dans cette expérience, changer la composition chimique de la solution de cristallisation à température constante conduit à obtenir une population uniforme de cristaux plus gros. La condition de cristallisation était semblable à l’expérience précédente. La dissolution des cristaux a été réalisée en abaissant progressivement la concentration de NaCl de 0,9 molaire à zéro.La réduction de la concentration de sel maintient la solution dans la zone sous-saturée du diagramme de phase qui conduit à la dissolution des cristaux. Ensuite, la nouvelle solution de cristallisation avec une résistance ionique inférieure à celle précédemment a été injectée dans la chambre du réservoir. À cette concentration précipitée, le nombre de cristaux apparaît plus faiblement et les cristaux atteignent un volume plus important qu’auparavant.Ici, nous avons fourni un protocole détaillé décrivant la préparation de l’échantillon et l’ajustement du logiciel de contrôle pour la culture de cristaux de grande et haute qualité pour la cristallographie macromoléculaire naturelle à l’aide d’un instrument entièrement automatisé développé dans notre laboratoire. Cette procédure étape par étape a été conçue et bénéficie de la connaissance du diagramme de phase de cristallisation afin de séparer la nucléation et la croissance cristalline. En outre, un protocole pour la croissance des cristaux avec des modèles de microcytose est également présenté en utilisant des boutons de macrocytose comme une alternative lorsque OptiCrys n’est pas disponible.En plus des stratégies que j’ai mentionnées pour OptiCrys changer la composition chimique de la solution de cristallisation et la température et de prendre des images doit être fait manuellement. L’utilisation de la vibration thermique régulée pour l’incubateur pour maintenir la température constante est nécessaire, ce qui est une étape critique dans la méthodologie démontrée.

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