Name: optimization of crystal growth for neutron macromolecular crystallography
Uploaded: 2021-03-13T14:00:00
Duration: 12 min 29 s
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MBS bestätigt die Unterstützung durch den LABEX VALO GRAL im Rahmen des Vertrags 2015. NJ würdigt das International Doctoral Research Program (Irtelis) der CEA für das PhD Fellowship. Die Autoren würdigen die Finanzierung aus dem Forschungs- und Innovationsprogramm Horizont 2020 der Europäischen Union im Rahmen der Marie-Skodowska-Curie-Zuschussvereinbarung mit der Nummer 722687. Die Autoren sind auch Dr. Esko Oksanen (ESS, Lund) und Dr. Jean-Luc Ferrer (IBS, Grenoble) für hilfreiche Gespräche und Einblicke dankbar. Die IBS erkennt die Integration in das Interdisziplinäre Forschungsinstitut von Grenoble (IRIG, CEA) an.

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	<li>Blakeley, M. P., Langan, P., Niimura, N., Podjarny, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutron+crystallography:+opportunities,+challenges,+and+limitations.">Neutron crystallography: opportunities, challenges, and limitations.</a> Current Opinion in Structural Biology. 18 (5), 593-600 (2008).</li><li>Snell, E. H., Van Der Woerd, M. J., Damon, M., Judge, R. A., Myles, D. A. A., Meilleur, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimizing+crystal+volume+for+neutron+diffraction:+D-xylose+isomerase.">Optimizing crystal volume for neutron diffraction: D-xylose isomerase.</a> European Biophysics Journal. 35 (7), 621-632 (2006).</li><li>Ng, J. D., Baird, J. K., Coates, L., Garcia-Ruiz, J. M., Hodge, T. 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P., Veesler, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+temperature+to+crystallize+proteins:+A+mini-review.">Using temperature to crystallize proteins: A mini-review.</a> Crystal Growth and Design. 8 (12), 4215-4219 (2008).</li><li>Budayova-Spano, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+preliminary+neutron+diffraction+study+of+rasburicase,+a+recombinant+urate+oxidase+enzyme,+complexed+with+8-azaxanthin.">A preliminary neutron diffraction study of rasburicase, a recombinant urate oxidase enzyme, complexed with 8-azaxanthin.</a> Acta Crystallographica Section F: Structural Biology and Crystallization Communications. 62 (3), 306-309 (2006).</li><li>Junius, N., Vahdatahar, E., Oksanen, E., Ferrer, J. L., Budayova-Spano, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+crystallization+of+biological+macromolecules+using+dialysis+combined+with+temperature+control.">Optimization of crystallization of biological macromolecules using dialysis combined with temperature control.</a> Journal of Applied Crystallography. 53 (3), (2020).</li><li>Grimsley, G. R., Pace, C. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spectrophotometric+Determination+of+Protein+Concentration.">Spectrophotometric Determination of Protein Concentration.</a> Current Protocols in Protein Science. 33 (1), 1-9 (2003).</li><li>McPherson, A., Gavira, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Introduction+to+protein+crystallization.">Introduction to protein crystallization.</a> Acta Crystallographica Section F:Structural Biology Communications. 70 (1), 2-20 (2014).</li><li>McPherson, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Introduction+to+protein+crystallization.">Introduction to protein crystallization.</a> Methods. 34 (3), 254-265 (2004).</li></ol>

Die Autoren haben nichts zu verraten.

Verschiedene physikalische, chemische und biologische Variablen beeinflussen die Proteinkristallisation, indem sie die Proteinlöslichkeit beeinflussen21. Unter diesen Variablen werden hier Temperatur und chemische Zusammensetzung der Kristallisationslösung in Kombination mit Dialysetechnik verwendet, um große hochwertige Kristalle von Biomakromolekülen für Neutronenbeugungsstudien zu verbessern und zu züchten. Durch die Verwendung von Kenntnissen von Phasendiagrammen wird die Kristallisation vorhersehbarer. Obwohl auch das Screening unterschiedlicher Kristallisationsbedingungen in einem seriellen Ansatz möglich ist, besteht das Hauptziel der Verwendung der vorgestellten rationalen Ansätze darin, die Kinetik der Kristallkernbildung und des Wachstums zu trennen und zu kontrollieren.
Ähnlich wie bei allen Kristallisationsstudien erhöhen hochwertige reine und homogene Proteinproben und staubfreie Kristallisationslösungen die Erfolgsrate des Experiments. Filtration und Zentrifugation von Lösungen sind wesentliche Schritte in den beschriebenen Protokollen. Die Kenntnis der physikalisch-chemischen Eigenschaften der untersuchten Proteine wie das Molekulargewicht (zur Wahl der geeigneten Dialysemembran), der isoelektrische Punkt und die Proteinlöslichkeit sind entscheidend für die Entwicklung eines optimalen Kristallwachstumsexperiments. Außerdem muss die Proteinstabilität bei unterschiedlichen Temperaturen oder mit unterschiedlichen Chemikalien berücksichtigt werden, um Probenverlust zu verhindern und die Erfolgswahrscheinlichkeit zu erhöhen. Unter Berücksichtigung des Temperaturbereichs von OptiCrys (233.0–353.0 ± 0.1 K) kann mit ihm ein breites Spektrum an Proteinen kristallisiert werden. Aber es lohnt sich zu betonen, dass Proteine, die in erster Linie thermostabil sind, wie Proteine aus thermophilen Quellen, am meisten von temperaturgeregelten großvolumigen Kristallwachstumsexperimenten profitieren würden, die von diesem Instrument angeboten werden.
Mit einer niedervolumigen Dialysekammer (bei Verwendung von OptiCrys) oder Mikrodialyseknöpfen und Demonsierung mehrerer Temperaturen und Kristallisationsbedingungen (z. B. Raster mit Niederschlagskonzentration oder pH) ist es möglich, Informationen über die Position der Grenze der metastabilen Zone (kinetisches Gleichgewicht zwischen Keimbildung und metastabilen Zonen) zu erhalten. Dies ist von unschätzbarem Wert, wenn ein erfolgreiches Kristallwachstumsexperiment speziell für neue Proteinkandidaten in der Kristallisation entwickelt wird. Ohne diese Informationen können Experimente aus einem Bereich des Phasendiagramms mit hoher Übersättigung beginnen, zu weit von der Grenze der metastabilen Zone entfernt, um die Kristallkernbildung leicht zu kontrollieren. Obwohl bei Proteinen mit reduzierter Thermostabilität die Auflösung des Proteinausfällungs versucht werden kann, z. B. durch Erhöhung der Temperatur bei direkter Löslichkeit, kann die Beibehaltung der Probe bei hoher Temperatur für einen längeren Zeitraum die Proteinfällung irreversibel machen. Daher besteht die beste Strategie darin, eine Ausgangsbedingung mit geringerer Übersättigung in der Nähe der Grenze der Metastabilität zu verwenden, wo die Keimbildung kontrolliert und Proteinfällungen vermieden werden können. Entsprechend verringert das Kristallisations-Prescreening die Wahrscheinlichkeit, dass ein Protein in der Dialysekammer ausfällt, und erhöht die Erfolgsrate des Experiments.
Nach dem Entwerfen eines Experiments ist die Vorbereitung von Dialysekammern (OptiCrys) oder Mikrodialyseknöpfen ein weiterer wichtiger Schritt. Die Verhinderung der Bildung von Luftblasen in der Dialysekammer/Knopf erhöht die Chance auf eine erfolgreiche Kristallisation, insbesondere wenn kleine Volumina verwendet werden. Das Vorhandensein von Luftblasen in der Dialysekammer kann auch die Kinetik des Kristallisationsprozesses verändern und die Reproduzierbarkeit des Experiments verringern (weil die Protein-/Lösungskontaktfläche modifiziert wurde). Nicht nur Protein, sondern auch Kristallisationslösung kann den Erfolg des Experiments beeinflussen. Die Verwendung neuer 50 ml Rohre für das Pumpsystem jedes Mal, wenn man ein neues Experiment starten will und Waschen Vonrohre nach jedem Experiment verringert die Chance der Kontamination und vermeidet die Bildung von Salzkristallen im Gerät.
Die Verwendung von Mikrodialyse-Tasten ist eine Alternative, wenn OptiCrys nicht verfügbar ist. Die oben genannten Strategien zur Optimierung der Kristallisation und zur Überwachung des Kristallwachstums müssen manuell durchgeführt werden. Typischerweise erfordert dies, dass man sich außerhalb eines thermoregulierten Inkubators befindet, was problematisch sein kann, wenn die Temperaturregulierung ein kritischer Schritt in der beschriebenen Methodik ist. Dies erleichtert nicht die Veränderung der chemischen Zusammensetzung der Kristallisationslösungen oder die Überwachung des Kristallwachstums durch Bildgebung, so dass der Kristallwachstumsprozess nicht in Echtzeit gesteuert werden kann.
Die Kenntnis des Phasendiagramms ist die Grundlage für die Verwendung der Kristallisationsbank OptiCrys, um systematisch große, hochwertige Kristalle automatisiert anzubauen. Die Kontrolle physikalisch-chemischer Parameter wie Temperatur, Niederschlagskonzentration und pH-Wert während der Kristallisation verschiebt das Protein-Lösungs-Gleichgewicht in einer genau definierten kinetischen Bahn über das Phasendiagramm. Ergänzt wird dies durch den Einsatz einer Dialysemembran zur Einstellung des Massentransports und zur Schaffung eines kontrollierten Gradienten in der Kristallisationskammer, der die Größe und Qualität der Kristalle beeinflusst. Daher ist die Verwendung sowohl thermodynamischer Daten als auch kinetischer Bahnen unerlässlich, um den Kristallisationsprozess zu steuern, um hochwertige Kristalle zu züchten. Dank OptiCrys können systematische Phasendiagramme in einem multidimensionalen Raum mit einem seriellen Ansatz mit deutlich weniger Material als bisher untersucht werden. Um diese Methodik zu demonstrieren, stellen wir hier eine Fallstudie mit einem Modellprotein, Huhn Ei-weiß Lysozym. Durch die Verwendung und Beherrschung des hier vorgestellten Protokolls kann man es für echte Proteinsysteme5,14,17,18anpassen.

Das Verständnis der Struktur-Funktions-Beziehung von Proteinen und des Mechanismus physiologischer Pfade beruht oft darauf, die Positionen von Wasserstoffatomen (H) zu kennen und zu wissen, wie die Ladung innerhalb eines Proteins1,2übertragen wird. Da Wasserstoffatome Röntgenstrahlen schwach streuen, können ihre Positionen nur mit sehr hochauflösenden Röntgenbeugungsdaten (>1)3,4bestimmt werden. Umgekehrt kann die Neutronenkristallographie verwendet werden, um eine genaue Position von Wasserstoffatomen in biologischen Makromolekülen zu erhalten, da Wasserstoff- und Deuteriumatome(H2, Isotop von Wasserstoff) Streulängen von ungefähr gleicher Größe wie Sauerstoff, Stickstoff und Kohlenstoff5haben. Der Neutronenfluss aus verfügbaren Neutronenquellen ist jedoch schwächer als der von Röntgenstrahlen, so dass dies oft für2,3kompensiert werden muss. Dies kann durch den Austausch von H mitH2 und/oder die Erhöhung des Kristallvolumens erreicht werden, um die inkohärente Streuung von Wasserstoffen zu reduzieren und das Signal-Rausch-Verhältnis von Beugungsbildern zu erhöhen.
Es gibt verschiedene Kristallisationsansätze (das entsprechende schematische Phasendiagramm ist in Abbildung 1dargestellt), um große und hochwertige Kristalle sowohl für die Röntgen- als auch für die Neutronen-Bio-Makromolekularkristallographie6zu erhalten. Bei der Dampfdiffusion wird ein Tröpfchen, das aus einer Mischung aus einem Protein und einer Kristallisationslösung hergestellt wird, im Laufe der Zeit durch Verdunstung von Wasser oder anderen flüchtigen Arten gegen ein Reservoir ausgeglichen, das eine höhere Konzentration des Niederschlags derselben Kristallisationslösung enthält. Die Erhöhung der Proteinkonzentration und des Niederschlags im Tröpfchen führt zu der Für-spontane Keimbildung erforderlichen Übersättigung, gefolgt von Kristallwachstum an diesen Kernen6,7. Obwohl die Dampfdiffusion die am häufigsten verwendete Technik für den Anbau von Kristallen4ist, kann der Kristallisationsprozess nicht präzise gesteuert werden8. Bei der freien Grenzflächendiffusionsmethode diffundiert die Kristallisationslösung in eine konzentrierte Proteinlösung und lenkt das System sehr langsam in Richtung Übersättigung. Diese Methode kann als Batch-Methode mit einer langsamen Mischrate6,9,10,11,12betrachtet werden. Bei der Chargenmethode wird das Protein schnell mit einer Kristallisationslösung vermischt, die zu einer schnellen Übersättigung und damit zu einer gleichmäßigen Keimbildung mit vielen Kristallen3,7führt. Diese Methode macht etwa ein Drittel aller Strukturen aus, die derzeit in der Protein Data Bank deponiert sind. Die Dialysemethode wird auch für den Anbau hochwertiger und gut diffrierender Proteinkristalle eingesetzt. Bei der Dialysemethode diffundieren Moleküle von Niederschlagsmitteln aus einem Reservoir durch eine halbdurchlässige Membran in eine separate Kammer mit der Proteinlösung. Die Kinetik des Gleichgewichts hängt von verschiedenen Faktoren ab, wie Temperatur, Membranporengröße und Volumen und Konzentration von Proteinproben und Kristallisationsmitteln6.
Kristallisationsphasendiagramme können verwendet werden, um verschiedene Zustände eines Proteins als Funktion der verschiedenen physikalischen oder chemischen Variablen3zu beschreiben. Wie in Abbildung 1dargestellt, kann jede Kristallisationstechnik so visualisiert werden, dass sie eine andere kinetische Flugbahn verwendet, um die Kern- und metastabilen Zonen eines solchen Diagramms6,10,13zu erreichen. Dies liefert Informationen über die Proteinlöslichkeit und die Proteinkonzentration, bei der ein thermodynamisches Gleichgewicht zwischen Kristall und Lösung beobachtet wird, wodurch die optimalen Bedingungen für Keimbildung und Wachstum gefunden werden3,14. In einem zweidimensionalen Phasendiagramm wird die Proteinkonzentration als Funktion einer Variablen dargestellt und die anderen Variablen werden konstantgehalten 15. In einem solchen Phasendiagramm, wenn die Proteinkonzentration unterhalb der Löslichkeitskurve liegt, befindet sich die Lösung in der untergesättigten Region und es tritt kein Keimbildung oder Kristallwachstum auf. Oberhalb dieser Kurve befindet sich die Übersättigungszone, in der die Proteinkonzentration höher ist als die Löslichkeitsgrenze3,14. Dies wird weiter in drei Regionen unterteilt: die metastabile Zone, die spontane Keimungszone und die Niederschlagszone. In der metastabilen Zone reicht eine Übersättigung nicht aus, um innerhalb einer angemessenen Zeit eine Keimbildung zu ermöglichen, aber das Wachstum von Samenkristallen kann stattfinden. Aggregation und Niederschlag werden in der Niederschlagszone bevorzugt, wo die Übersättigung zu hoch ist14,15.
Wenn eine ausreichende Übersättigung für eine spontane Keimbildung erreicht ist, erscheinen die ersten Kerne10. Das Wachstum von Kristallen führt zu einer Verringerung der Proteinkonzentration, bis die Löslichkeitsgrenze erreicht ist. Solange die Übersättigung in der Nähe der Löslichkeitskurve bleibt, wird sich die Größe der Kristalle nicht wesentlich ändern. Es hat sich jedoch gezeigt, dass Schwankungen der Temperatur und chemischen Zusammensetzung der Kristallisationslösung (z. B. die Konzentration des Niederschlags) die Proteinlöslichkeit beeinflussen und zur Einleitung eines weiterenKristallwachstums8,13,16führen können.
Da die Dialyse für ein hochwertiges Kristallwachstum von Vorteil ist, wurde die in Abbildung 2dargestellte OptiCrys Kristallisationsbank in unserem Labor entwickelt und entwickelt, um die Kristallisation vollautomatisch zu steuern8. Zu diesem Zweck wurde mit LabVIEW eine Software geschrieben, die die Steuerung und Überwachung der Temperatur einer fließenden Reservoir-Dialyse-Einrichtung in Kontakt mit Peltier-Elementen über eine elektronische Steuerung und einen Kühler ermöglicht. Dieselbe Software reguliert auch automatisch die chemische Zusammensetzung der Kristallisationslösung (z.B. den Austausch von Kristallisationsmitteln) mit einem Mehrkanal-Fluidsystem. Zusätzlich werden eine Digitalkamera und ein invertiertes Mikroskop verwendet, um den Kristallisationsprozess zu visualisieren und aufzuzeichnen. Für den Anbau von Kristallen für unterschiedliche Zwecke stehen zwei Kristallisationskammern mit 15 L- und 250-L-Volumen zur Verfügung. Da der Kristallisationsprozess reversibel ist, ist ein Screening auf verschiedene Bedingungen mit nur wenigen Mikrolitern der Proteinlösung möglich, solange die Probe nicht beschädigt ist8. Daher minimiert die Verwendung dieser Methode die Menge des verwendeten Proteinmaterials.
Aus früheren Arbeiten8ist es offensichtlich, dass während des Kristallwachstumsprozesses in situ Beobachtungen in regelmäßigen Zeitabständen durchgeführt werden müssen. Diese können je nach Beobachtungsereignis (Niederschlag, Keimbildung oder Kristallwachstum) von wenigen Sekunden bis zu mehreren Tagen reichen.
Die Optimierung des Kristallwachstums mit OptiCrys basiert auf temperaturumfällten Konzentrationsphasendiagrammen. Bei Proteinen mit Löslichkeit als direkte Temperaturfunktion ist es möglich, das Aussalzungsregime18zu nutzen. Hier verringert die Erhöhung der Ionenstärke der Lösung, die mit protein-gefällten Phasendiagrammen visualisiert werden kann, die Löslichkeit des Proteins. Ebenso können Proteine mit inverser Löslichkeit das Einsalzungsregime18nutzen. Die Keimbildung findet in der Keimungszone, in der Nähe der metastabilen Zone statt, und das Kristallwachstum findet dann in der metastabilen Zone des Phasendiagramms statt, bis die Proteinkonzentration die Löslichkeitsgrenze erreicht. Wie in Abbildung 3Adargestellt, kann bei konstanter chemischer Zusammensetzung die Temperatur verringert werden, um die Kristallisationslösung in der metastabilen Zone zu halten, um eine neue Keimbildung zu verhindern. Kristalle wachsen, bis das zweite Kristall/Lösungsgleichgewicht erreicht ist und danach keine weitere Zunahme der Kristallgröße beobachtet wird. Die Temperatur wird mehrmals verringert, bis die Kristalle die gewünschte Größe erreichen. In Abbildung 3B, bei konstanter Temperatur, hält die Erhöhung der Niederschlagskonzentration die Lösung in der metastabilen Zone. Dieser Prozess kann dann mehrmals wiederholt werden, um große Kristalle zu erhalten. Die Änderung der Temperatur und die Manipulation der KristallisationslösungBedingungen, durch die Kontrolle der Übersättigungsniveaus, sind zwei leistungsstarke Werkzeuge für die Trennung von Keimbildung und Wachstum von Kristallen, die präzise und automatisch von OptiCrys5,8,14gesteuert werden.
Beispiele für Proteinkristalle, die durch temperaturgesteuerte oder temperatur- und niederschlagsgesteuerte kristallisation angebaut werden, sowie relativen Beugungsdaten sind in der Literatur und im PDB verfügbar. Darunter sind menschliche γ-Crystallin E, PA-IIL-Lectin, Hefe anorganische Pyrophosphatase, Urateoxidase, menschliche Kohlensäureanhydrase II, YchB-Kinase, und Lactat-Dehydrogenase5,14,17,18.
Obwohl OptiCrys von NatX-ray kommerzialisiert wurde, gibt es viele Laboratorien, die keinen Zugang zu diesem Instrument oder zu dem seriellen Ansatz haben, den es bietet. Die Alternative zu dieser Technik ist die Verwendung handelsüblicher Kunststoff-Mikrodialyseknöpfe mit unterschiedlichen Volumina. Mit diesen können Temperatur und chemische Zusammensetzung manuell eingestellt und variiert werden. Die Inspektion von Mikrodialyseknöpfen kann nicht vor Ort durchgeführt werden und muss stattdessen manuell mit einem optischen Mikroskop durchgeführt werden. Die Temperaturregelung kann erreicht werden, indem die Probe in einem vibrationsfreien, temperaturgeregelten Inkubator gehalten wird. Es ist wichtig, die Temperatur konstant zu halten, um sicherzustellen, dass Kristallisationsexperimente reproduzierbar sind. Erhebliche Temperaturschwankungen können auch zu Beschädigungen oder Zerstörungen von Kristallen führen5.
Hier stellen wir ein detailliertes Protokoll zur Beschreibung der Probenvorbereitung und des Einsatzes von Steuerungssoftware für das Wachstum großer, hochwertiger Kristalle bereit, die für die Neutronenproteinkristallographie geeignet sind. Dieses Schritt-für-Schritt-Verfahren wurde entwickelt, um das Kristallisationsphasendiagramm zu nutzen, um eine Startposition und einen kinetischen Pfad auszuwählen, um die Größe und die Qualität der erzeugten Kristalle zu steuern. Darüber hinaus wird ein detailliertes Protokoll für den Anbau von Kristallen mit Mikrodialyseknöpfen vorgestellt, das die gleiche Begründung verwendet, um große, hochwertige Kristalle zu erhalten.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>200 &#181;l Dialysis Button</td>
			<td>Hampton Research</td>
			<td>HR3-330</td>
			<td>Dialysis button</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24 well plates</td>
			<td>Jena Bioscience</td>
			<td>CPL-132</td>
			<td>Crystallization plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Switch</td>
			<td>FLUIGENT</td>
			<td>2SW001</td>
			<td>Switch</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>30 &#956;l Dialysis Button</td>
			<td>Hampton Research</td>
			<td>HR3-324</td>
			<td>Dialysis button</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL Corning Centrifuge tubes</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>CLS430828-500EA</td>
			<td>Centrifuge tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S2889</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chicken Egg White Lysozyme</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L6876</td>
			<td>Lyophilized protein powder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dialysis Membrane Discs 6-8 kDa MWCO</td>
			<td>Spectrum</td>
			<td>132478</td>
			<td>Dialysis membrane</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dialysis Membrane Tubing 6-8 kDa MWCO</td>
			<td>Spectrum</td>
			<td>132650T</td>
			<td>Dialysis membrane</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>Minispin</td>
			<td>Bench-top centrifuge</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow Unit</td>
			<td>FLUIGENT</td>
			<td>FLU-XL</td>
			<td>Flow meter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flowboard</td>
			<td>FLUIGENT</td>
			<td>FLB</td>
			<td>Flowboard</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microfluidic Flow Control System EZ</td>
			<td>FLUIGENT</td>
			<td>EZ-01000002</td>
			<td>Pressure/vacuum controller</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MilliporeSigma 0.22 &#181;m syringe Filters</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>GSWP04700</td>
			<td>0.22 &#956;m pore size filter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M-Switch</td>
			<td>FLUIGENT</td>
			<td>MSW002</td>
			<td>Rotary valve</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opticrys</td>
			<td>NatX-ray</td>
			<td>PRT008</td>
			<td>Crystallization bench</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Siliconized circle cover slides</td>
			<td>Hampton Research</td>
			<td>HR3-231</td>
			<td>Glass slides</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride &#8805; 99%</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>746398</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Switchboard</td>
			<td>FLUIGENT</td>
			<td>SWB002</td>
			<td>Switchboard</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermoregulated incubator</td>
			<td>Memmert</td>
			<td>IPP30</td>
			<td>Thermoregulated incubator</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

optimization of crystal growth for neutron macromolecular crystallography

Der Einsatz der Neutronenmakromolekularen Kristallographie (NMX) expandiert rasant, wobei die meisten Strukturen in den letzten zehn Jahren ermittelt wurden, dank der Entwicklung neuer NMX-Strahllinien und der erhöhten Verfügbarkeit von Software zur Strukturverfeinerung. Die derzeit für NMX verfügbaren Neutronenquellen sind jedoch deutlich schwächer als die äquivalenten Quellen für die Röntgenkristallographie. Trotz Der Fortschritte in diesem Bereich werden immer deutlich größere Kristalle für Neutronenbeugungsstudien benötigt, insbesondere bei der Tendenz, immer größere Makromoleküle und Komplexe zu untersuchen. Weitere Verbesserungen der Methoden und Instrumente für den Anbau größerer Kristalle sind daher notwendig, um den Einsatz von NMX zu erweitern.
In dieser Arbeit stellen wir rationale Strategien und eine in unserem Labor entwickelte Kristallwachstumsbank (OptiCrys) vor, die Echtzeitbeobachtung durch eine mikroskopisch montierte Videokamera mit einer präzisen automatisierten Steuerung von Kristallisationslösungen (z. B. Niederschlagskonzentration, pH-Wert, Additiv, Temperatur) kombiniert. Wir zeigen dann, wie diese Temperatur- und chemische Zusammensetzung die Suche nach optimalen Kristallisationsbedingungen mit modelllöslichen Proteinen erleichtert. Eine gründliche Kenntnis des Kristallisationsphasendiagramms ist entscheidend für die Auswahl der Ausgangsposition und des kinetischen Pfades für jedes Kristallisationsexperiment. Wir zeigen, wie ein rationaler Ansatz die Größe und Anzahl der erzeugten Kristalle steuern kann, basierend auf dem Wissen über mehrdimensionale Phasendiagramme.

In den Abschnitten 2.3 und 2.4 werden drei Beispiele für optimiertes Kristallwachstum vorgestellt, die den Einsatz des Instruments und ein experimentelles Design für den Anbau großer Kristalle zeigen. Für diese Demonstration haben wir Lysozym als Modellprotein verwendet, obwohl Kristallwachstumsexperimente mit vielen anderen Proteinsystemen mit dieser Methode erfolgreich durchgeführt wurden (siehe oben). Durch die Verwendung und Beherrschung des hier vorgestellten Protokolls kann man es für andere Proteinkandidaten anpassen.
In Abschnitt 2.3 haben wir gezeigt, dass etablierte rationale Kristallisationsstrategien beim Anbau von Kristallen mit ausreichenden Streuvolumen für die Neutronenproteinkristallographie von Vorteil sein können. Hier zeigen wir, dass die vorgeschlagenen rationalen Optimierungsstrategien auch die Erzeugung einer einheitlichen Population von Kristallen jeder spezifischen Größe ermöglichen, die für nachgelagerte Strukturbestimmungsansätze erforderlich ist.
Diese beiden Experimente sollen die Bedeutung von Phasendiagrammen bei der Steuerung von Kristallkernbildung und Wachstum hervorheben. Hier bei der Überwachung des qualitativen Phasendiagramms wird die Temperatur- und chemische Zusammensetzung von Kristallisationslösungen in Kombination mit der Überwachung des Kristallisationsprozesses in Echtzeit gesteuert. Mit dieser Methode können Keimbildung und Kristallwachstum auf reversible Weise rational optimiert werden. Die Verwendung eines solchen seriellen Ansatzes reduziert auch die Menge an Protein und die Zeit, die benötigt wird, um die Größe und Qualität der Kristalle zu kontrollieren.
Bei der Dialysemethode wird eine Proteinlösung durch eine halbdurchlässige Membran6 (Abbildung 5) von einer Kristallisationslösung getrennt. Diese Dialysemembran ermöglicht es kleinen Molekülen wie Additiven, Puffern und Ionen, die Membran zu passieren, nicht aber Makromoleküle wie Proteine6,20. Mit dieser Funktion kann die Kristallisationslösung im Laufe des Experiments6modifiziert werden. Der Austausch der Lösung kann manuell erfolgen, z.B. in Mikrodialyse-Tasten, oder automatisiert mit einem dafür entwickelten Instrument OptiCrys8.
In den ersten Experimenten wurden Mikrodialyseknöpfe zur Kristallisation von Hühnerei-weiß-Lysozym verwendet. Mikrodialyseknöpfe wurden in Kristallisationslösungen mit unterschiedlichen Salzkonzentrationen eingetaucht. In diesem einfachen Kristallisationsgitterexperiment ist die einzige Variable die Niederschlagskonzentration, während die Temperatur konstant gehalten wird (293 K). Wie in Abbildung 4dargestellt, führen leichte Schwankungen der Salzkonzentration zu einer Veränderung der Größe und Anzahl der beobachteten Kristalle, was eine Untersuchung des Kristallisationsphasendiagramms ermöglicht. In Abbildung 4, Panel 1, enthält die Kristallisationslösung 0,7 M NaCl und eine begrenzte Anzahl größerer Kristalle sind in den Tasten erschienen. Durch die Erhöhung der Salzkonzentration von 0,7 auf 1,2 M steigt die Übersättigung und die Lösung in der Keimzone bewegt sich von der metastabilen Zone weg(Abbildung 4,Panels 1 bis 6). Infolgedessen nimmt die Anzahl der Kristalle zu und ihre Größe nimmt ab.
Im ersten Experiment mit einem vollautomatischen Instrument zur temperaturgesteuerten Dialysekristallisation, OptiCrys (Abbildung 9), wurde das Kristallwachstumsexperiment auf ein großes Kristallwachstum zugeschnitten. Das Experiment wurde bei einer Anfangstemperatur von 295 K mit einer Kristallisationslösung mit 0,75 M NaCl und 0,1 M Naacetatpuffer pH 4 gestartet. Unter diesen experimentellen Bedingungen erreichte die Kristallisationslösung die Keimungszone in der Nähe der metastabilen Zone des Phasendiagramms(Abbildung 9, Pfeil 1). Infolgedessen wurden in der ersten Phase des Experiments nur wenige Kerne erzeugt. Um ausgewählte Kristalle weiter anzubauen (siehe Abbildung 9), wurde der Workflow zur Kristallwachstumsoptimierung durch unterschiedliche Temperatur in die metastabile Zone getrieben, sobald das Kristalllösungsgleichgewicht erreicht war.
Jedes Mal, wenn das Gleichgewicht zwischen Kristall und Lösung erreicht wurde, wurde die Temperatur zuerst auf 291 K, dann auf 288 K und schließlich auf 275 K gesenkt, um die Kristallisationslösung in der metastabilen Zone zu halten. Das Ergebnis dieses Experiments ist ein einziger großer Kristall, der sowohl für makromolekulare Röntgen- als auch für Neutronenkristallographie geeignet ist.
Für die meisten Proteine wurde das genaue quantitative Phasendiagramm (oder nur ein qualitatives Diagramm) noch nicht erreicht, da es an experimentellen Geräten fehlt, die in der Lage sind, die Proteinkonzentration (oder nur die Beobachtung/Detektion des Kristallisationsprozesses in Echtzeit) während der Kristallisationsexperimente18genau zu messen bzw. zu erkennen/zu erkennen. Daher ist es oft nicht möglich, das Experiment so zu gestalten, dass die Kristallisation im optimalen Bereich des Phasendiagramms, in der Nähe der metastabilen Zone beginnt.
Daher muss eine Kristallisationsoptimierungsstudie durchgeführt werden, bevor das Experiment durchgeführt wird, das dem Wachstum eines großvolumigen Kristalls gewidmet ist. In dieser Studie sind Temperaturschwankungen (bei konstanter chemischer Zusammensetzung) einerseits und Variationen der chemischen Zusammensetzung (bei konstanter Temperatur) andererseits erforderlich, um die metastabile Zone zu identifizieren und die optimalen Bedingungen für den Beginn eines großen Kristallwachstumsexperiments abzustecken.
Zu diesem Zweck werden zwei weitere Experimente vorgestellt, die auf die Reversibilität der temperaturgesteuerten Dialysekristallisationsexperimente mit OptiCrys für Keimbildung, Kristallwachstum, Auflösung und Wiederwachstum zugeschnitten sind. Der Workflow zur Kristallwachstumsoptimierung wurde so gesteuert, dass eine gleichmäßige Population von weniger, größeren Lysozymkristallen unter Verwendung von Temperaturschwankungen oder Niederschlagskonzentrationen angebaut wurde.
Im zweiten Experiment mit OptiCrys wurde die chemische Zusammensetzung der Kristallisationslösung während des gesamten Experiments konstant gehalten (0,9 M NaCl in 0,1 M CH3COONa pH 4) mit variabler Temperatur. Die Anfangstemperatur wurde auf 291 K eingestellt. Die Ergebnisse dieses Experiments sind in Abbildung 10zusammengefasst. Aufgrund der hohen Übersättigung tauchte eine große Anzahl kleiner Kristalle in der Kristallisationskammer auf(Abbildung 10, Panels 1 und 2). Gemäß dem Konzept der direkten Proteinlöslichkeit wurden durch allmähliche Erhöhung der Temperatur auf 313 K alle Kristalle aufgelöst(Abbildung 10, Panels 3, 4 und 5). Schließlich wurde durch Die Senkung der Temperatur auf 295 K die zweite Keimbildung in der Nähe der metastabilen Zone eingeleitet und ermöglichte die kontrollierte Bildung einer geringeren Anzahl von Kernen. Weiteres Kristallwachstum führte zur gleichmäßigen Erzeugung einer Population größerer Kristalle(Abbildung 10, Tafel 7).
Wie in Abbildung 11dargestellt, kann eine Variation der chemischen Zusammensetzung der Kristallisationslösung bei einer konstanten Temperatur von 291 K ebenfalls verwendet werden, um eine gleichmäßige Population größerer Kristalle zu erhalten. Ähnlich wie beim vorherigen Experiment betrug die Ausgangsbedingung 0,9 M NaCl in 0,1 M CH3COONa pH 4. Die NaCl-Konzentration wurde dann schrittweise von 0,9 M auf Null gesenkt, um die Kristalle aufzulösen(Abbildung 11, Panels 4 und 5). Zu diesem Zeitpunkt wurde NaCl vollständig durch eine Pufferlösung von 0,1 M CH3COONa pH 4 ersetzt. Durch die Reduzierung der Salzkonzentration bleibt die Lösung in der untergesättigten Zone des Phasendiagramms, was zur Auflösung der Kristalle führt. Anschließend wurde eine neue Kristallisationslösung mit geringerer Ionenfestigkeit bei 0,75 M NaCl in 0,1 M CH3COONa pH 4 in die Reservoirkammer injiziert. Bei dieser niederschlagsarmen Konzentration tauchten nach 90 Minuten die ersten Kerne auf(Abbildung 11, Tafel 6). Die Anzahl der erzeugten Kristalle war niedriger und die Kristalle erreichen ein größeres Volumen(Abbildung 11, Panel 7) als zuvor.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61685/61685fig1v3.jpg"> Abbildung 1: Schematisches Phasendiagramm. Kinetische Bahnen für drei Kristallisationstechniken werden in einem Aussalzungsregime dargestellt. Jede Methode erreicht Nukleation und Kristallisation unterschiedlich, visualisiert durch einen anderen kinetischen Weg durch das Phasendiagramm, um die Nukleation und metastabile Zonen zu erreichen. Die Löslichkeitskurve trennt Untersättigungs- und Übersättigungsbereiche. Die Supersättigung ist in drei Zonen unterteilt: metastabil, Keimbildung und Niederschlag. In der Keimungszone tritt eine spontane Keimbildung auf, während in der metastabilen Zone Kristallwachstum stattfindet. Diese Abbildung ist von Junius et al. 8<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61685/61685fig1v3large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61685/61685fig02.jpg"> Abbildung 2: Schematische Darstellung der Kristallisationsbank (OptiCrys). Die LED-Lichtquelle befindet sich auf der temperaturgesteuerten Dialyse-Durchflusszelle. Ein invertiertes Mikroskop und die Digitalkamera werden oben rechts im Bild mit dem roten Pfeil angezeigt. Der rote Kreis stellt die Lage der Kühlerschläuche dar. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61685/61685fig02large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61685/61685fig03.jpg"> Abbildung 3: Schematisches zweidimensionales Proteinkristallisationsphasendiagramm in Abhängigkeit von Temperatur (A) und Niederschlagskonzentration (B). (A) Bei einem Protein mit direkter Löslichkeit hält die Temperaturabsenkung die Kristallisationslösung in der metastabilen Zone. Temperaturschwankungen können mehrmals wiederholt werden, um den Kristallwachstumsprozess zu steuern, bis Kristalle mit dem gewünschten Volumen erhalten sind. (B) Eine Änderung der Konzentration der Niederschlagslösung kann auch verwendet werden, um die Kristallisationslösung in der metastabilen Zone für den Anbau von Kristallen zu halten. Diese Abbildung ist von Junius et al. 8<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61685/61685fig03large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61685/61685fig04.jpg"> Abbildung 4: Kristalle von Lysozym, die mit der Dialysemethode gewonnen wurden. Dieses Experiment wurde bei einer konstanten Temperatur von 293 K in 0,1 M Natriumacetatpuffer pH 4 durchgeführt. Die Erhöhung der NaCl-Konzentration von 0,7 M auf 1,2 M erhöht die Keimbildung und führt zu einer größeren Anzahl von Kristallen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61685/61685fig04large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61685/61685fig05.jpg"> Abbildung 5: Überblick über den Proteinkristallisationsprozess durch die Dialysemethode. (A) Durch Zugabe des Proteins in die Kammer des Dialyseknopfes (B) wird eine Kuppelform auf der Oberseite der Kammer erzeugt. (C) Ein Applikator wird verwendet, um den O-Ring auf die Nut des Dialyseknopfes zu übertragen, um die Dialysemembran an Ort und Stelle zu fixieren. (D) Der Dialyseknopf ist zum Eintauchen in die Reservoirlösung bereit. (E) Die Kristallisationslösung durchläuft die halbdurchlässige Membran und Kristalle beginnen sich innerhalb der Kammer zu bilden. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61685/61685fig05large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61685/61685fig06.jpg"> Abbildung 6: Schematische Ansicht des temperaturgesteuerten fließenden Dialyse-Setups. (A) Die Proteinprobe wird der Dialysekammer zugesetzt. (B) Die Dialysemembran wird mit einem Applikator mit einem O-Ring auf den Überraum fixiert. (C) Der Überkammerraum wird gedreht und an der Oberseite der Dialysekammer befestigt. Weiße Pfeile zeigen an, wo Schrauben auf der Überkammer platziert werden. (D) Die Reservoirkammer wird im Uhrzeigersinn (E) gedreht und auf der Oberseite des Überkammers befestigt. (F) Die Reservoirkammer wird durch eine luftdichte Kappe mit Anschlüssen an ein Pumpsystem abgedeckt und (G) die Durchflusszelle in den Messingträger gelegt. Diese Abbildung ist von Junius et al. 8<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61685/61685fig06large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61685/61685fig07.jpg"> Abbildung 7: Vorbereitung und Injektion der Kristallisationslösung im Reservoir durch das Fluidsystem (A). Salz- und Wasserenthaltende Rohre sind mit dem Druck-/Vakuumregler (B) und dem Drehventil (C) verbunden. Durch den Einsatz des Drucks erzeugt der Druck-/Vakuumregler einen konstanten Flüssigkeitsfluss von den Rohren zum Drehventil. Jede Flüssigkeit, die durch den Durchflussmesser (D) und den Schalter fließt, wird in das Mischrohr (F) injiziert. Sobald alle Flüssigkeiten dem Mischrohr zugesetzt wurden, injiziert der Schalter durch einige Modifikationen die aus dem Mischrohr in das Reservoir (G). Die Flüssigkeit fließt durch das System in Richtung der Pfeile im Diagramm, das in aufsteigender Reihenfolge markiert ist (von 1 bis 6). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61685/61685fig07large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61685/61685fig8v2.jpg"> Abbildung 8: Wartungsansicht der Überwachungssoftware. Diese Ansicht wird verwendet, um verschiedene Parameter wie Temperatur, Licht, Kristallisationslösung und Zoom zu steuern. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61685/61685fig8v2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 9" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61685/61685fig09.jpg"> Abbildung 9: Das Phasendiagramm als Funktion der Temperatur (ausgewählte Bilder sind in aufsteigender Reihenfolge zu verfolgen). Ein einziger großer Lysozymkristall wird durch systematische Temperaturänderung von 295 K auf 275 K gewonnen. Bei jedem Schritt wird das Kristallwachstum gestoppt, wenn die Löslichkeitskurve erreicht wird. Die Reduzierung der Temperatur durch Beibehaltung der Lösung in der metastabilen Zone startet das Kristallwachstum neu. Die Bilder haben unterschiedliche Vergrößerungsstufen. Diese Abbildung ist von Junius et al. 8,18<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61685/61685fig09large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 10" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61685/61685fig10.jpg"> Abbildung 10: Optimierung des Kristallwachstums bei konstanter chemischer Zusammensetzung mittels Temperaturregelung (ausgewählte Bilder sind in aufsteigender Reihenfolge nachzuverfolgen). Der Beginn des Keimbildungsprozesses in der Keimungszone bei 291 K, weit weg von der metastabilen Zone, führt zur Bildung zahlreicher Kristalle. Durch die Erhöhung der Temperatur auf 313 K werden die Kristalle aufgelöst, bis in der Dialysekammer keine sichtbaren Kerne zu sehen sind. Schließlich wird die Temperatur auf 295 K zum zweiten Mal wieder aufgenommen, was zu einer begrenzten Anzahl größerer Kristalle führt. Diese Abbildung ist von Junius et al. 8,18<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61685/61685fig10large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 11" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61685/61685fig11.jpg"> Abbildung 11: Optimierung des Kristallwachstums bei konstanter Temperatur unter Verwendung von Schwankungen der Niederschlagskonzentration (ausgewählte Bilder sind in aufsteigender Reihenfolge zu verfolgen). Durch die Verringerung der Niederschlagskonzentration von 0,9 M auf 0 M werden die Kristalle aufgelöst, die während des ersten Keimereignisses erhalten wurden. Der Kristallisationsprozess wird durch die Injektion des gleichen Niederschlags, aber bei geringerer Ionenstärke, 0,75 M, neu gestartet, was zur Bildung einiger größerer Kristalle führt. Diese Abbildung ist von Junius et al. 8,18<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61685/61685fig11large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>

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Optimization of Crystal Growth for Neutron Macromolecular Crystallography

Strukturstudien von Biomakromolekülen durch Kristallographie erfordern hochwertige Kristalle. Hier zeigen wir ein Protokoll, das von OptiCrys (ein vollautomatisiertes Instrument, das in unserem Labor entwickelt wurde) und/oder Mikrodialysetasten für den Anbau großer hochwertiger Kristalle verwendet werden kann, basierend auf dem Wissen über das Kristallisationsphasendiagramm.

Optimierung des Kristallwachstums für die Neutronenmakromolekulare Kristallographie

The use of neutron macromolecular crystallography (NMX) is expanding rapidly with most structures determined in the last decade thanks to new NMX ...

Es gibt verschiedene Kristallisationsansätze zur Gewinnung von großen und hochwertigen Kristallen sowohl für die Röntgen- als auch für die Neutronenkristallographie. Einer dieser Ansätze ist die Verwendung der Dialysemethode. Bei dieser Technik wird die Proteinlösung durch eine halbdurchlässige Membran von einer Niederschlagslösung getrennt.Die Niederschlagsmoleküle diffundieren über die Membran in die Proteinkammer. Wenn die richtige Übersättigung für eine spontane Keimbildung erreicht ist, erscheinen die ersten Kerne. Hier zeigen wir ein Protokoll, das von OptiCrys ein vollautomatisiertes Instrument verwendet werden kann, das in unserem Labor entwickelt wurde und die temperaturgesteuerte Dialysekristallisation verwendet, und unsere Mikrodialysetasten für den Anbau großer hochwertiger Kristalle für die natürliche makromolekulare Kristallographie basierend auf dem Wissen über das Kristallisationsphasendiagramm.Für einen Mikrodialyseknopf mit bestimmter Mikroliter-Volumenpipette 35 Mikroliter Lysozymlösung in die Dialysekammer. Dieses zusätzliche Volumen erzeugt eine leicht kuppelförmige Form auf der Oberseite der Dialysekammer und verhindert die Bildung von Luftblasen. Nehmen Sie einen Applikator und legen Sie das Elastik oder den Ring an der Äußersten Stelle.Legen Sie die Membran auf die Kammer und fixieren Sie sie, indem Sie den Elastik oder Ring vom Applikator auf die Nut des Dialyseknopfes übertragen. Übertragen Sie die Taste auf den Brunnen, der die Kristallisationslösung enthält. Bedecken Sie den Brunnen mit einem Glasdeckel oder einem Stück Klebeband.Bewahren Sie die Probe bei 293 Kelvin in einem vibrationsfreien Thermoregler-Inkubator auf. In dem Wissen, dass die Dialysekristallisation Vorteile aus der Sicht des Kristallwachstums bietet, wurde die Kristallisationsbank, sogenannte OptiCrys, in unserem Labor entwickelt, um eine vollautomatische kombinierte Regelung der Temperatur und chemischen Zusammensetzung des biomolekularen Kristallisationsexperiments zu bieten. Die Optimierung des Kristallwachstums durch OptiCrys basiert auf den temperaturumfällten Konzentrationsphasendiagrammen.Die Keimbildung erfolgt in der Keimungszone in der Nähe der metastabilen Zone und das Kristallwachstum findet dann in der metastabilen Zone nach dem Phasendiagramm statt, bis die Proteinkonzentration die Löslichkeitskurve erreicht, die das thermodynamische Gleichgewicht zwischen Lösung und Kristallen darstellt. Durch die Senkung der Temperatur im Falle des Proteins mit direkter Löslichkeit oder durch Erhöhung der Niederschlagskonzentration im Falle des Aussalzens bleibt die Kristallisationslösung in der metastabilen Zone und es tritt keine Keimbildung auf. Kristalle wachsen, bis das Gleichgewicht der zweiten Kristalllösung erreicht ist und danach wird keine weitere Zunahme der Größe der Kristalle beobachtet.Die Temperatursenkung oder Erhöhung der Niederschlagskonzentration wird mehrmals wiederholt, bis die Kristalle die gewünschte Größe erreichen. Fügen Sie die Proteinlösung in die Dialysekammer des temperaturgeregelten Fließens ein, decken Sie die Überkammer mit der Dialysemembran ab und fixieren Sie die Membran mit dem Elastik oder Ring. Drehen Sie die Überkammer um und legen Sie sie auf die Dialysekammer.Drücken Sie es sanft und langsam, um die gesamte Luft zwischen zwei Stücken eingeschlossen zu entfernen, fixieren Sie das Reservoir in seiner Position, indem Sie es sanft auf die Überkammer schrauben. Fügen Sie die Kristallisationslösung in die Reservoirkammer ein und decken Sie sie mit der luftdichten Kappe ab. Übertragen Sie diese Baugruppe und in die Brustunterstützung der Kristallisationsbank OptiCrys Crystal Wachstum ist eine Überwachungssoftware der Kristallisation stube OptiCrys.Es enthält vier verschiedene grafische Schnittstellen oder Ansichten. Die Home-Ansicht enthält Schaltflächen, um zu den anderen Ansichten zu navigieren. Der Zweck der Setup-Schnittstelle besteht darin, ein Experimentszenario zu definieren, das automatisch in der Testansicht ausgeführt werden kann.Die letzte Ansicht ist die Wartungsansicht. Um ein Experiment neu zu starten, muss die Wartungsansicht geöffnet sein, in der alle wesentlichen Parameter für den reibungslosen Ablauf der Kristallisationsexperimente gefunden werden. Erhöhen Sie die Leuchtkraft aus dem Lichtabschnitt, Licht kann von Null, kein Licht auf 100 maximale Helligkeit erhöhen.Zur Steuerung und Überwachung der Temperatur wird der Temperaturreglerverwendet. Klicken Sie auf die Schaltfläche, um sie einzuschalten. Stellen Sie die Temperatur auf dem Sollwertabschnitt ein, und drücken Sie die Eingabetaste.Unterhalb dieser Schaltfläche befinden sich zwei Diagramme. Die rote zeigt das Finale, die Auftragstemperatur und das gelbe Diagramm die aktuelle Temperatur. Durch das Mischen einer Stammlösung wird eine Injektion der Kristallisationslösung in die Reservoirkammer durch Palm-Sektion gesteuert.Fügen Sie die Konzentration der Stammlösung in der ersten Stufe hinzu. Dann finden Sie die endgültige Konzentration jeder neuen Grouper-Lösung und fügen Sie sie dem endgültigen Konzentrationsabschnitt hinzu. Nach dem Drücken der Berechnungstaste, finden Sie heraus, Volumen der Lagerlösung wird berechnet werden und wird in der Volumenplatte vor jedem Konzentrationspanel hinzufügen.Drücken Sie die Startvorbereitungstaste und warten Sie, bis die neue Premier-Lösung fertig ist. Um die Kristallisationslösung auszutauschen, klicken Sie auf die Schaltfläche Lösungseingabe. Um den Vorgang zu beenden, drücken Sie die Taste Verteilung anhalten.Auf der rechten Seite des Mikroskop-Abschnitts, Es gibt mehrere Panels für die Aufzeichnung wichtiger Informationen aus jedem Kristallwachstumsexperiment. Fügen Sie in diesem Abschnitt den entsprechenden Proteinnamen, das Molekulargewicht und den Kristallisationszustand hinzu. Definieren Sie einen Namen für Ihre Experimente, indem Sie ihn einfach in den Ordnernamen eingeben.Wählen Sie im Abschnitt nb images die Anzahl der Bilder aus, die während des Experiments aufgenommen werden sollen. Fügen Sie die Nummer der Bilder und aus dem Panel auf der rechten Seite, wählen Sie die Timer-Skala. Klicken Sie auf die Ordnerschaltfläche, um den Ordner zu öffnen.In diesem Ordner befindet sich eine Textdatei mit allen Informationen, die Sie zuvor für Ihr Experiment definiert haben. Bilder, die für jede weitere Behandlung bereit sind, werden ebenfalls in diesem Ordner gespeichert. Zoomen Sie das Mikroskop kann auch automatisch variiert werden.Ändert den Zoom, indem Sie die Plus- und Minustaste oben im Mikroskopbereich verwenden, um die Vergrößerung zu erhöhen bzw. zu verringern. Es gibt drei verschiedene Möglichkeiten, die Kristallgröße zu messen. Verwenden Sie zum Messen der Länge oder Breite den Breitenvektor.Je nach Kristallform können die spezifischen Werkzeuge aus dem linken Teil des Mikroskopteils ausgewählt werden. Z. B. ein rechteckiges oder Polygon. Die Werte werden im Measureabschnitt angezeigt.In den ersten Experimenten wurden Mikrodialyseknöpfe in die Kristallisationslösungen mit unterschiedlichen Salzkonzentrationen eingetaucht. In diesem einfachen Kristallisationsgitterexperiment ist die einzige Variable die Niederschlagskonzentration. während die Temperatur konstant gehalten wird.Leichte Schwankungen der Salzkonzentration ermöglichen die Untersuchung des Kristallisationsphasendiagramms durch Erhöhung der Salzkonzentration von 0,7 auf 1,2 molare Übersättigung und die Lösung in der Keimationszone bewegt sich von der metastabilen Zone weg. Folglich wird eine Variation in Größe und Anzahl der Kristalle beobachtet, wobei die Anzahl der Kristalle zunimmt und ihre Größe abnimmt. Im ersten Experiment mit OptiCrys unter der gegebenen experimentellen Bedingung befindet sich die Kristallisationslösung in der Kernzone in der Nähe der metastabilen Zone des Kristallisationsphasendiagramms, sobald das Gleichgewicht in der Dialysekammer erreicht ist.Infolgedessen werden in der ersten Phase des Experiments nur wenige Kerne erzeugt. Um das Wachstum von Kristallen in der metastabilen Zone zu halten und den Kristallwachstumsprozess zu steuern, wurde die Temperatur in unterschiedlichen Zeitintervallen verändert. Jedes Mal, wenn das Gleichgewicht der Kristalllösung abgeschlossen war, wurde die Temperatur variiert.Daher sank die Temperatur auf 291 Kelvin, 288 Kelvin und schließlich 275 Kelvin, um das Wachstum des ausgewählten Kristalls in der metastabilen Zone aufrechtzuerhalten. Das Ergebnis dieses Experiments ist ein einziger großer Kristall mit dem Volumen, das für die natürliche makromolekulare Kristallographie erforderlich ist. Die nächsten beiden Experimente zeigen die Reversibilität der temperaturgesteuerten Dialyseexperimente für Keimbildung, Kristallwachstum, Auflösung und Nachwachsen.Im zweiten Experiment mit OptiCrys wurde die chemische Zusammensetzung der Kristallisationslösung durch das Experiment konstant gehalten und die Temperatur variiert. Die Anfangstemperatur wurde auf 291 Kelvin eingestellt. Aufgrund der hohen Übersättigung tauchte eine große Anzahl kleiner Kristalle in der Kristallisationskammer auf.In Übereinstimmung mit dem Konzept der direkten Proteinlöslichkeit sollten sich durch allmähliche Erhöhung der Temperatur auf 313 Kelvin alle Kristalle auflösen. Schließlich, durch die Senkung der Temperatur auf 295 Kelvin, die zweite Keimbildung in der Nähe der metastabilen Zone initiiert und erlaubt, den Keimbildungsprozess zu kontrollieren, was zur Bildung einer geringeren Anzahl von Kernen. Weiteres Kristallwachstum ermöglichte die Erzeugung der einheitlichen Population größerer Kristalle.In diesem Experiment führt die Veränderung der chemischen Zusammensetzung der Kristallisationslösung bei konstanter Temperatur zu einer gleichmäßigen Population größerer Kristalle. Der Kristallisationszustand war ähnlich wie beim vorherigen Experiment. Die Auflösung der Kristalle wurde erreicht, indem die NaCl-Konzentration schrittweise von 0,9 Mol auf Null gesenkt wurde.Durch die Reduzierung der Salzkonzentration bleibt die Lösung in der untergesättigten Zone des Phasendiagramms, was zur Auflösung der Kristalle führt. Dann wurde die neue Kristallisationslösung mit geringerer Ionenstärke als bisher in die Reservoirkammer injiziert. Bei dieser Niederschlagskonzentration erscheint die geringere Anzahl von Kristallen und die Kristalle erreichen ein größeres Volumen als zuvor.Hier stellten wir ein detailliertes Protokoll zur Verfügung, das die Probenvorbereitung beschreibt und die Steuerungssoftware für den Anbau von großen und hochwertigen Kristallen für die natürliche makromolekulare Kristallographie mit einem vollautomatischen Instrument, das in unserem Labor entwickelt wurde, anpasst. Dieses Schritt-für-Schritt-Verfahren wurde entwickelt und profitiert von den Kenntnissen des Kristallisationsphasendiagramms, um Keimbildung und Kristallwachstum zu trennen. Darüber hinaus wird ein Protokoll für den Anbau von Kristallen mit Mikrozytosemustern auch mit Makrozytose-Tasten als Alternative präsentiert, wenn OptiCrys nicht verfügbar ist.Zusätzlich zu den Strategien, die ich für OptiCrys erwähnt, die chemische Zusammensetzung der Kristallisationslösung und Temperatur zu ändern und Bilder zu machen, sollte manuell durchgeführt werden. Die Verwendung der thermisch geregelten Schwingung für den Inkubator, um die Temperatur konstant zu halten, ist erforderlich, was ein entscheidender Schritt in der demonstrierten Methodik ist.

Research

JoVE Journal

Biology

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Using the three-dimensional structure of biological macromolecules to infer how they function is one of the most important fields of modern biology. The ...

Forschung

Biologie

Isolation and Biophysical Study of Fruit Cuticles

Isolierung und biophysikalische Untersuchung der Cuticula

The cuticle, a hydrophobic protective layer on the aerial parts of terrestrial plants, functions as a versatile defensive barrier to various biotic and ...

Harvesting and Cryo-cooling Crystals of Membrane Proteins Grown in Lipidic Mesophases for Structure Determination by Macromolecular Crystallography

Ernte-und Cryo-Kühlung Kristalle von Membranproteinen in Lipidische Mesophasen zur Strukturaufklärung von Makromolekulare Kristallographie Grown

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Optimierung und Nutzung von<em&gt; Agrobacterium</em&gt; Transient-vermittelte Proteinproduktion in<em&gt; Nicotiana</em

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Medium-throughput Screening Assays for Assessment of Effects on Ca2+-Signaling and Acrosome Reaction in Human Sperm

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