Name: optimization of crystal growth for neutron macromolecular crystallography
Uploaded: 2021-03-13T14:00:00
Duration: 12 min 29 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Optimization of Crystal Growth for Neutron Macromolecular Crystallography at JoVE.com

MBS מאשרת את התמיכה של LABEX VALO GRAL במסגרת החוזה 2015. ניו ג'רזי מכירה בתוכנית הבינלאומית לחקר הדוקטורט (Irtelis) של CEA עבור מלגת הדוקטורט. המחברים מאשרים מימון מתוכנית המחקר והחדשנות Horizon 2020 של האיחוד האירופי במסגרת הסכם המענק מארי סקלודובסקי-קירי מספר 722687. המחברים גם אסירי תודה לד"ר אסקו אוקסנן (ESS, לונד) וד"ר ז'אן לוק פרר (IBS, גרנובל) על שיחות ותובנות מועילות. IBS מכיר בהשתלבות במכון המחקר הבינתחומי של גרנובל (IRIG, CEA).

<ol>
	<li>Blakeley, M. P., Langan, P., Niimura, N., Podjarny, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutron+crystallography:+opportunities,+challenges,+and+limitations.">Neutron crystallography: opportunities, challenges, and limitations.</a> Current Opinion in Structural Biology. 18 (5), 593-600 (2008).</li><li>Snell, E. H., Van Der Woerd, M. J., Damon, M., Judge, R. A., Myles, D. A. A., Meilleur, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimizing+crystal+volume+for+neutron+diffraction:+D-xylose+isomerase.">Optimizing crystal volume for neutron diffraction: D-xylose isomerase.</a> European Biophysics Journal. 35 (7), 621-632 (2006).</li><li>Ng, J. D., Baird, J. K., Coates, L., Garcia-Ruiz, J. M., Hodge, T. A., Huang, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large-volume+protein+crystal+growth+for+neutron+macromolecular+crystallography.">Large-volume protein crystal growth for neutron macromolecular crystallography.</a> Acta Crystallographica Section F:Structural Biology Communications. 71, 358-370 (2015).</li><li>O'Dell, W. B., Bodenheimer, A. M., Meilleur, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutron+protein+crystallography:+A+complementary+tool+for+locating+hydrogens+in+proteins.">Neutron protein crystallography: A complementary tool for locating hydrogens in proteins.</a> Archives of Biochemistry and Biophysics. 602, 48-60 (2016).</li><li>Oksanen, E., Blakeley, M. P., Bonnet&#233;, F., Dauvergne, M. T., Dauvergne, F., Budayova-Spano, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large+crystal+growth+by+thermal+control+allows+combined+X-ray+and+neutron+crystallographic+studies+to+elucidate+the+protonation+states+in+Aspergillus+flavus+urate+oxidase.">Large crystal growth by thermal control allows combined X-ray and neutron crystallographic studies to elucidate the protonation states in Aspergillus flavus urate oxidase.</a> Journal of the Royal Society Interface. 6, (2009).</li><li>Krauss, I. R., Merlino, A., Vergara, A., Sica, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+overview+of+biological+macromolecule+crystallization.">An overview of biological macromolecule crystallization.</a> International Journal of Molecular Sciences. 14 (6), 11643-11691 (2013).</li><li>Chayen, N. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+Studies+of+Protein+Crystallization+by+Vapour-Diffusion+and+Microbatch+Techniques.">Comparative Studies of Protein Crystallization by Vapour-Diffusion and Microbatch Techniques.</a> REVIEW Acta Cryst. , (1998).</li><li>Junius, N., Oksanen, E., Terrien, M., Berzin, C., Ferrer, J. L., Budayova-Spano, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+crystallization+apparatus+for+temperaturecontrolled+flow-cell+dialysis+with+real-time+visualization.">A crystallization apparatus for temperaturecontrolled flow-cell dialysis with real-time visualization.</a> Journal of Applied Crystallography. 49, 806-813 (2016).</li><li>Salemme, F. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+free+interface+diffusion+technique+for+the+crystallization+of+proteins+for+X-ray+crystallography.">A free interface diffusion technique for the crystallization of proteins for X-ray crystallography.</a> Archives of Biochemistry and Biophysics. 151 (2), 533-539 (1972).</li><li>Chayen, N. E., Saridakis, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+crystallization:+From+purified+protein+to+diffraction-quality+crystal.">Protein crystallization: From purified protein to diffraction-quality crystal.</a> Nature Methods. 5 (2), 147-153 (2008).</li><li>Ot&#225;lora, F., Gavira, J. A., Ng, J. D., Garc&#237;a-Ruiz, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Counterdiffusion+methods+applied+to+protein+crystallization.">Counterdiffusion methods applied to protein crystallization.</a> Progress in Biophysics and Molecular Biology. 101 (1-3), 26-37 (2009).</li><li>Garci&#225;-Ruiz, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Counterdiffusion+Methods+for+Macromolecular+Crystallization.">Counterdiffusion Methods for Macromolecular Crystallization.</a> Methods in Enzymology. 368, 130-154 (2003).</li><li>Budayova-Spano, M., Koruza, K., Fisher, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large+crystal+growth+for+neutron+protein+crystallography.">Large crystal growth for neutron protein crystallography.</a> Methods in Enzymology. 634, 21-46 (2020).</li><li>Budayova-Spano, M., Dauvergne, F., Audiffren, M., Bactivelane, T., Cusack, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+methodology+and+an+instrument+for+the+temperature-controlled+optimization+of+crystal+growth.">A methodology and an instrument for the temperature-controlled optimization of crystal growth.</a> Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography. 63 (3), 339-347 (2007).</li><li>Asherie, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+crystallization+and+phase+diagrams.">Protein crystallization and phase diagrams.</a> Methods. 34 (3), 266-272 (2004).</li><li>Astier, J. P., Veesler, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+temperature+to+crystallize+proteins:+A+mini-review.">Using temperature to crystallize proteins: A mini-review.</a> Crystal Growth and Design. 8 (12), 4215-4219 (2008).</li><li>Budayova-Spano, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+preliminary+neutron+diffraction+study+of+rasburicase,+a+recombinant+urate+oxidase+enzyme,+complexed+with+8-azaxanthin.">A preliminary neutron diffraction study of rasburicase, a recombinant urate oxidase enzyme, complexed with 8-azaxanthin.</a> Acta Crystallographica Section F: Structural Biology and Crystallization Communications. 62 (3), 306-309 (2006).</li><li>Junius, N., Vahdatahar, E., Oksanen, E., Ferrer, J. L., Budayova-Spano, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+crystallization+of+biological+macromolecules+using+dialysis+combined+with+temperature+control.">Optimization of crystallization of biological macromolecules using dialysis combined with temperature control.</a> Journal of Applied Crystallography. 53 (3), (2020).</li><li>Grimsley, G. R., Pace, C. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spectrophotometric+Determination+of+Protein+Concentration.">Spectrophotometric Determination of Protein Concentration.</a> Current Protocols in Protein Science. 33 (1), 1-9 (2003).</li><li>McPherson, A., Gavira, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Introduction+to+protein+crystallization.">Introduction to protein crystallization.</a> Acta Crystallographica Section F:Structural Biology Communications. 70 (1), 2-20 (2014).</li><li>McPherson, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Introduction+to+protein+crystallization.">Introduction to protein crystallization.</a> Methods. 34 (3), 254-265 (2004).</li></ol>

למחברים אין מה לחשוף.

משתנים פיזיקליים, כימיים וביולוגיים שונים משפיעים על התגבשות החלבון על ידי השפעה על מסיסות החלבון21. בין משתנים אלה, טמפרטורה והרכב כימי של פתרון התגבשות משמשים כאן בשילוב עם טכניקת דיאליזה כדי לשפר ולגדל גבישים גדולים באיכות גבוהה של biomacromolecules למחקרי עקיפה נויטרונים. על ידי שימוש בידע של דיאגרמות פאזה, התגבשות נעשית צפויה יותר. למרות סינון של תנאי התגבשות שונים בגישה סדרתית אפשרית גם, המטרה העיקרית של שימוש בגישות רציונליות המוצגות היא להפריד ולשלוט בקינטיקה של התגרענות גביש וצמיחה.
בדומה לכל מחקרי ההתגבשות, דגימות חלבון טהורות והומוגניות באיכות גבוהה ופתרונות התגבשות נטולי אבק מגדילים את שיעור ההצלחה של הניסוי. סינון וצנטריפוגה של פתרונות הם צעדים חיוניים בפרוטוקולים המתוארים. הכרת התכונות הפיזיוכימיות של החלבונים שנחקרו כגון המשקל המולקולרי (לבחירת קרום הדיאליזה המתאים), הנקודה האיזואלקטרית ומסיסות החלבון חיוניים לתכנון ניסוי צמיחת גביש אופטימלי. כמו כן, יש לשקול את יציבות החלבון בטמפרטורות שונות או עם כימיקלים שונים כדי למנוע אובדן מדגם ולהגדיל את הסבירות להצלחה. בהתחשב בטווח הטמפרטורות של OptiCrys (233.0–353.0 ± 0.1 K), ניתן לגבש מגוון רחב של חלבונים באמצעותו. אבל כדאי להדגיש כי חלבונים כי הם בעיקר תרמו יציב, כגון חלבונים ממקורות תרמופיליים, יועיל ביותר בטמפרטורה מבוקרת ניסויים צמיחת גביש בנפח גדול המוצעים על ידי מכשיר זה.
באמצעות תא דיאליזה בנפח נמוך (בעת שימוש בלחצני OptiCrys) או מיקרו-דיאליזה וסינון מספר טמפרטורות ותנאי התגבשות (למשל, רשתות של ריכוז משקעים או pH), ניתן לקבל מידע על מיקום הגבול של האזור metastable (שיווי משקל קינטי בין גרעינים ואזורים metastable). זה לא יסולא בפז בעת עיצוב ניסוי מוצלח צמיחת גביש במיוחד עבור מועמדים חדשים חלבון התגבשות. ללא מידע זה ניסויים יכולים להתחיל מאזור של דיאגרמת פאזה עם רוויה גבוהה, רחוק מדי מהגבול של האזור metastable לשלוט בקלות התגרענות גביש. למרות פירוק של משקע החלבון ניתן לנסות, למשל על ידי הגדלת הטמפרטורה במקרה של מסיסות ישירה, עבור חלבונים עם תרמוביות מופחתת, שמירה על המדגם בטמפרטורה גבוהה במשך תקופה ארוכה יותר של זמן עשוי להפוך את משקע החלבון בלתי הפיך. לכן, האסטרטגיה הטובה ביותר מורכבת משימוש במצב ראשוני עם רוויית-על נמוכה יותר הממוקמת בסמוך לגבול המטא-יציבות, שם ניתן לשלוט בגרעין ולהימנע ממשקעי חלבון. בקנה אחד עם זה, התגבשות prescreening מקטין את הסיכוי שיש משקע חלבון בתא הדיאליזה ומגביר את שיעור ההצלחה של הניסוי.
לאחר תכנון ניסוי, הכנת תאי דיאליזה (OptiCrys) או כפתורי מיקרו-דיאליזה היא צעד חשוב נוסף. מניעת היווצרות בועת אוויר בתא/כפתור הדיאליזה מגדילה את הסיכוי להתגבשות מוצלחת במיוחד כאשר משתמשים בנפחים קטנים. נוכחותן של בועות אוויר בתא הדיאליזה עשויה גם לשנות את הקינטיקה של תהליך ההתגבשות ולהפחית את השחזור של הניסוי (מכיוון שמשטח המגע של החלבון/פתרון שונה). לא רק חלבון אלא גם פתרון התגבשות יכול להשפיע על ההצלחה של הניסוי. שימוש בצינורות חדשים של 50 מ"ל למערכת השאיבה בכל פעם שרוצים להתחיל ניסוי חדש וצינורות כביסה לאחר כל ניסוי מקטין את הסיכוי לזיהום ומונע יצירת גבישי מלח במנגנון.
השימוש בלחצני מיקרו-דיאליזה הוא חלופה כאשר OptiCrys אינו זמין. האסטרטגיות לאופטימיזציה של התגבשות וניטור צמיחת הגביש שהוזכרו לעיל, חייבות להתבצע באופן ידני. בדרך כלל זה מחייב להיות מחוץ לחממה תרמורגולטית, אשר יכול להיות בעייתי כאשר ויסות הטמפרטורה הוא צעד קריטי במתודולוגיה המתוארת. זה לא מקל על שינוי ההרכב הכימי של פתרונות התגבשות, או ניטור צמיחת גביש על ידי הדמיה, ולכן תהליך צמיחת הגביש לא ניתן לשלוט בזמן אמת.
הידע של תרשים הפאזה הוא הבסיס לשימוש בספסל ההתגבשות, OptiCrys, כדי לגדל באופן שיטתי גבישים גדולים ואיכותיים באופן אוטומטי. שליטה בפרמטרים פיזיוכימיים כמו טמפרטורה, ריכוז משקעים ו- pH במהלך התגבשות מעבירה את שיווי המשקל של תמיסת החלבון במסלול קינטי מוגדר היטב לאורך דיאגרמת הפאזה. זה משלים את השימוש בקרום דיאליזה כדי להתאים הובלת המונים וליצור שיפוע מבוקר בתא התגבשות המשפיע על הגודל והאיכות של הגבישים. לכן, שימוש הן בנתונים תרמודינמיים והן במסלולים קינטיים חיוני כדי לשלוט בתהליך ההתגבשות על מנת לגדל גבישים באיכות גבוהה. הודות OptiCrys, דיאגרמות שלב שיטתי במרחב רב ממדי ניתן ללמוד עם גישה סדרתית באמצעות חומר פחות באופן משמעותי מבעבר. כדי להדגים מתודולוגיה זו, אנו מספקים כאן מקרה מבחן עם חלבון מודל, ליזוזים לבנים ביצה עוף. על ידי שימוש ושליטה בפרוטוקול המוצג כאן ניתן להתאים אותו למערכות חלבון אמיתיות5,14,17,18.

הבנת הקשר המבני-פונקציה של חלבונים ואת המנגנון של מסלולים פיזיולוגיים לעתים קרובות מסתמך על לדעת את העמדות של אטומי מימן (H) וכיצד תשלום מועבר בתוך חלבון1,2. מאז אטומי מימן לפזר קרני רנטגן חלש, עמדותיהם ניתן לקבוע רק עם נתוני עקיפת רנטגן ברזולוציה גבוהה מאוד (>1 Å)3,4. לעומת זאת, ניתן להשתמש בקריסטלוגרפיה של נויטרונים כדי להשיג מיקום מדויק של אטומי מימן במקרומולקולות ביולוגיות כמימן ודיטריום (H2, איזוטופ של מימן) אטומי פיזור בסדר גודל שווה בערך כמו חמצן, חנקן ופחמן5. עם זאת, שטף נויטרונים ממקורות נויטרונים זמינים חלש יותר מזה של קרני רנטגן, ולכן זה חייב להיות מתוגמל לעתים קרובות עבור2,3. זה יכול להיות מושגת על ידי החלפת H עם H2 ו / או הגדלת נפח הגבישים כדי להפחית את פיזור לא קוהרנטי של מימן ולהגדיל את יחס אות לרעש של תמונות עקיפה.
ישנן גישות התגבשות שונות (דיאגרמת הפאזה הסכימטית המתאימה מוצגת באיור 1) להשגת גבישים גדולים ואיכותיים הן עבור רנטגן והן עבור גבישים ביו-מקרומולקולריים נויטרונים6. ב דיפוזיה אדים, טיפה שהוכנה מתערובת של חלבון ותמיסת התגבשות משתווה לאורך זמן, באמצעות אידוי של מים או מינים נדיפים אחרים, כנגד מאגר המכיל ריכוז גבוה יותר של משקעים של אותו פתרון התגבשות. העלייה בריכוז החלבון והמשקעים בטיפה מובילה לתרופה הנדרשת לגרעין ספונטני ואחריו צמיחת גביש בגרעינים אלה6,7. למרות דיפוזיה אדים היא הטכניקה הנפוצה ביותר לגידול גבישים 4 ,תהליךהתגבשות לא ניתן לשלוט במדויק8. בשיטת דיפוזיה ממשק חינם, פתרון התגבשות מתפזר לתוך פתרון חלבון מרוכז, לאט מאוד מכוון את המערכת לכיוון רוויה. שיטה זו יכולה להיחשב כשיטת אצווה עם קצב ערבוב איטי6,9,10,11,12. בשיטת האצווה, החלבון מעורבב במהירות עם פתרון התגבשות המוביל רוויה מהירה בתורו התגרענות אחידה עם גבישים רבים3,7. שיטה זו מהווה כשליש מכלל המבנים המופקדים כיום בבנק נתוני החלבון. שיטת הדיאליזה משמשת גם לגידול גבישי חלבון איכותיים ומפזרים היטב. בשיטת הדיאליזה, מולקולות של משקעים מפוזרות ממאגר דרך קרום חדיר למחצה לתא נפרד עם תמיסת החלבון. הקינטיקה של שיווי משקל תלויה בגורמים שונים, כגון טמפרטורה, גודל נקבוביות קרום, ואת נפח וריכוז של דגימות חלבון וסוכני התגבשות6.
דיאגרמות שלב התגבשות ניתן להשתמש כדי לתאר מצבים שונים של חלבון כפונקציה של משתנה פיזי או כימישונה 3. כפי שמודגם באיור 1, ניתן לדמיין כל טכניקת התגבשות כשימוש במסלול קינטי שונה כדי להגיע לאזורי התגרענות והמטא-נתונים שלדיאגרמה 6,10,13. זה מספק מידע על מסיסות חלבון וריכוז החלבון שבו שיווי משקל תרמודינמי בין גביש ותמיסה הוא ציין, ובכך למצוא את התנאים האופטימליים עבור התגרענות וצמיחה3,14. בדיאגרמת פאזה דו מימדית, ריכוז החלבון מותווה כפונקציה של משתנה אחד והמשתנים האחרים נשמריםקבועים 15. בתרשים פאזה כזה, כאשר ריכוז החלבון נמצא מתחת לעקומת המסיסות, הפתרון נמצא באזור התת-רווי ולא מתרחשת גרעין או צמיחת גביש. מעל עקומה זו נמצא אזור רוויה-העל שבו ריכוז החלבון גבוה ממגבלת המסיסות3,14. זה מחולק עוד יותר לשלושה אזורים: האזור metastable, אזור הגרעין הספונטני, ואת אזור המשקעים. באזור metastable, רוויה אינה מספיקה עבור התגרענות להתרחש בתוך זמן סביר אבל צמיחה של גבישים זרע יכול להתרחש. צבירה ומשקעים מועדפים באזור המשקעים, שבו רוויה גבוהה מדי14,15.
כאשר מספיק רוויה לגרעין ספונטני מושגת, הגרעינים הראשונים יופיעו10. צמיחת הגבישים מובילה לירידה בריכוז החלבון עד להגבלת המסיסות. כל עוד רוויה-על נשארת בקרבת עקומת המסיסות, לא יהיה שינוי משמעותי בגודל הגבישים. עם זאת, הוכח כי וריאציות בטמפרטורה ובהרכב הכימי של פתרון התגבשות (לדוגמה, ריכוז המשקעים) ישפיעו על מסיסות החלבון ועלולות להוביל ליזום צמיחת גביש נוספת8,13,16.
מכיוון שהדיאליזה מועילה לצמיחת קריסטל באיכות טובה, ספסל התגבשות OptiCrys המאויר באיור 2, תוכנן ופותח במעבדה שלנו כדי לשלוט בהתגבשות באופן אוטומטי לחלוטין8. לשם כך נכתבה תוכנה עם LabVIEW המאפשרת בקרה וניטור של הטמפרטורה של מערך דיאליזה של מאגר זורם במגע עם אלמנטים פלטייה, באמצעות בקר אלקטרוני וצ'ילר. אותה תוכנה גם מסדירה באופן אוטומטי את ההרכב הכימי של פתרון התגבשות (למשל חילופי סוכני התגבשות) באמצעות מערכת נוזלית רב ערוצית. בנוסף, מצלמה דיגיטלית ומיקרוסקופ הפוך משמשים כדי לדמיין ולתעד את תהליך ההתגבשות. שני תאי התגבשות עם 15 μL ו 250 נפחי μL זמינים לגידול גבישים למטרות שונות. כמו תהליך התגבשות הוא הפיך, הקרנה עבור תנאים שונים אפשרי עם רק כמה microliters של פתרון החלבון כל עוד המדגם אינו פגום8. כתוצאה מכך, שימוש בשיטה זו ממזער את כמות חומר החלבון המשמש.
מעבודהקודמת 8, ברור כי במהלך תהליך צמיחת הגביש, תצפיות situ צריך להתבצע במרווחי זמן קבועים. אלה יכולים לנוע בין כמה שניות למספר ימים, בהתאם לאירוע תחת השגחה (משקעים, התגרען או צמיחת גביש).
האופטימיזציה של צמיחת גביש עם OptiCrys מבוססת על דיאגרמות שלב ריכוז משקעים בטמפרטורה. במקרה של חלבונים עם מסיסות כתפקוד ישיר של הטמפרטורה, ניתן לעשות שימוש במשטר המלחה החוצה18. זה המקום שבו הגדלת הכוח היוני של הפתרון, אשר ניתן לדמיין באמצעות דיאגרמות שלב משקעים חלבון, מקטין את המסיסות של החלבון. כמו כן, חלבונים עם מסיסות הפוכה יכולים לעשות שימוש במשטרהמלחה 18. התגרענות מתרחשת באזור התגרענות, בקרבת האזור metastable, וצמיחת גביש ואז מתרחשת באזור metastable של דיאגרמת השלב עד ריכוז החלבון מגיע לגבול המסיסות. כפי שמוצג באיור 3A, ניתן להקטין את טמפרטורת ההרכב הכימי המתמדת כדי לשמור על פתרון ההתגבשות באזור המטה-שולחן כדי למנוע התגרענות חדשה. גבישים לגדול עד שיווי המשקל הגביש השני / פתרון מושגת ולאחר מכן, אין עלייה נוספת בגודל של גבישים נצפתה. הטמפרטורה יורדת מספר פעמים עד שהקריסטלים מגיעים לגודל הרצוי. באיור 3B, בטמפרטורה קבועה, הגדלת ריכוז המשקעים שומרת על הפתרון באזור המטא-שולחן. לאחר מכן ניתן לחזור על תהליך זה מספר פעמים כדי להשיג גבישים גדולים. שינוי הטמפרטורה ומניפולציה של תנאי פתרון התגבשות, על ידי שליטה על רמות רוויה, הם שני כלים רביעוצמהלהפרדת התגרענות וצמיחה של גבישים הנשלטים באופן מדויק וא אוטומטי על ידי OptiCrys 5,8,14.
דוגמאות של גבישי חלבון הגדלים על ידי התגבשות מבוקרת טמפרטורה, או טמפרטורה ומשקעים מבוקר ריכוז, כמו גם נתוני עקיפה יחסית המתקבלים זמינים בספרות וב- PDB. ביניהם הם אדם γ גבישי E, PA-IIL לקטין, שמרים פירופוספטאז אנאורגניים, אורט אוקסידאז, אנהידראז פחמני אנושי II, YchB קינאז, לקטט דהידרוגנאז5,14,17,18.
למרות OptiCrys היה ממוסחר על ידי NatX-ray, ישנן מעבדות רבות שאין להם גישה למכשיר זה או לגישה הסדרתית שהיא מציעה. החלופה לטכניקה זו היא להשתמש בכפתורי מיקרו-דיאליזה פלסטיים זמינים מסחרית עם נפחים שונים. באמצעות אלה, טמפרטורה והרכב כימי ניתן להתאים ומגוון באופן ידני. בדיקה של כפתורי מיקרודיאליזה לא יכולה להיעשות באתרו ובמקום זאת יש לעשות זאת באופן ידני עם מיקרוסקופ אופטי. בקרת טמפרטורה יכולה להיות מושגת על ידי שמירה על המדגם באינקובטור מבוקר טמפרטורה ללא רטט. זה חיוני כדי לשמור על הטמפרטורה קבועה כדי להבטיח כי ניסויים התגבשות הם לשחזור. שינוי משמעותי בטמפרטורה עלול גם להוביל לנזק או הרס של גבישים5.
כאן אנו מספקים פרוטוקול מפורט המתאר הכנת מדגם ושימוש בתוכנת בקרה לצמיחה של גבישים גדולים ואיכותיים המתאימים לקריסטלוגרפיה של חלבון נויטרונים. הליך שלב אחר שלב זה נועד לנצל את דיאגרמת שלב ההתגבשות על מנת לבחור מיקום התחלתי ונתיב קינטי כדי לשלוט בגודל ובאיכות הגבישים הנוצרים. בנוסף, מוצג פרוטוקול מפורט לגידול גבישים עם כפתורי מיקרו-דיאליזה המשתמש באותו רציונל להשגת גבישים גדולים ואיכותיים.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>200 &#181;l Dialysis Button</td>
			<td>Hampton Research</td>
			<td>HR3-330</td>
			<td>Dialysis button</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24 well plates</td>
			<td>Jena Bioscience</td>
			<td>CPL-132</td>
			<td>Crystallization plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Switch</td>
			<td>FLUIGENT</td>
			<td>2SW001</td>
			<td>Switch</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>30 &#956;l Dialysis Button</td>
			<td>Hampton Research</td>
			<td>HR3-324</td>
			<td>Dialysis button</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL Corning Centrifuge tubes</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>CLS430828-500EA</td>
			<td>Centrifuge tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S2889</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chicken Egg White Lysozyme</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L6876</td>
			<td>Lyophilized protein powder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dialysis Membrane Discs 6-8 kDa MWCO</td>
			<td>Spectrum</td>
			<td>132478</td>
			<td>Dialysis membrane</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dialysis Membrane Tubing 6-8 kDa MWCO</td>
			<td>Spectrum</td>
			<td>132650T</td>
			<td>Dialysis membrane</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>Minispin</td>
			<td>Bench-top centrifuge</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow Unit</td>
			<td>FLUIGENT</td>
			<td>FLU-XL</td>
			<td>Flow meter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flowboard</td>
			<td>FLUIGENT</td>
			<td>FLB</td>
			<td>Flowboard</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microfluidic Flow Control System EZ</td>
			<td>FLUIGENT</td>
			<td>EZ-01000002</td>
			<td>Pressure/vacuum controller</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MilliporeSigma 0.22 &#181;m syringe Filters</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>GSWP04700</td>
			<td>0.22 &#956;m pore size filter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M-Switch</td>
			<td>FLUIGENT</td>
			<td>MSW002</td>
			<td>Rotary valve</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opticrys</td>
			<td>NatX-ray</td>
			<td>PRT008</td>
			<td>Crystallization bench</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Siliconized circle cover slides</td>
			<td>Hampton Research</td>
			<td>HR3-231</td>
			<td>Glass slides</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride &#8805; 99%</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>746398</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Switchboard</td>
			<td>FLUIGENT</td>
			<td>SWB002</td>
			<td>Switchboard</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermoregulated incubator</td>
			<td>Memmert</td>
			<td>IPP30</td>
			<td>Thermoregulated incubator</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

optimization of crystal growth for neutron macromolecular crystallography

השימוש בקריסטלוגרפיה מקרומולקולרית נויטרונית (NMX) מתרחב במהירות עם רוב המבנים שנקבעו בעשור האחרון הודות לקורות NMX חדשות שנבנו וזמינות מוגברת של תוכנה לעידון מבנים. עם זאת, מקורות הנויטרונים הזמינים כיום עבור NMX חלשים משמעותית ממקורות מקבילים עבור קריסטלוגרפיה של קרני רנטגן. למרות ההתקדמות בתחום זה, גבישים גדולים משמעותית תמיד יידרשו למחקרי עקיפת נויטרונים, במיוחד עם הנטייה ללמוד מקרומולקולות ומורכבויות גדולות יותר ויותר. שיפורים נוספים בשיטות ומכשור המתאימים לגידול גבישים גדולים יותר נחוצים אפוא לשימוש ב- NMX כדי להתרחב.
בעבודה זו, אנו מציגים אסטרטגיות רציונליות וספסל צמיחת קריסטל (OptiCrys) שפותח במעבדה שלנו המשלב תצפית בזמן אמת באמצעות מצלמת וידאו המותקנת על מיקרוסקופ עם שליטה אוטומטית מדויקת בפתרונות התגבשות (למשל, ריכוז משקעים, pH, תוסף, טמפרטורה). לאחר מכן אנו מדגימים כיצד שליטה זו בטמפרטורה ובהרכב הכימי מקלה על החיפוש אחר תנאי התגבשות אופטימליים באמצעות חלבונים מסיסים במודל. ידע מעמיק בדיאגרמת שלב ההתגבשות חיוני לבחירת מיקום ההתחלה והנתיב הקינטי לכל ניסוי התגבשות. אנו מראים כיצד גישה רציונלית יכולה לשלוט בגודל ובמספר הגבישים הנוצרים בהתבסס על ידע בדיאגרמות פאזה רב-ממדיות.

Watch this Scientific Journal Video about Optimization of Crystal Growth for Neutron Macromolecular Crystallography at JoVE.com

Optimization of Crystal Growth for Neutron Macromolecular Crystallography

מחקרים מבניים של ביומקרומולקולים על ידי קריסטלוגרפיה דורשים גבישים באיכות גבוהה. כאן אנו מדגימים פרוטוקול שיכול לשמש את OptiCrys (מכשיר אוטומטי לחלוטין שפותח במעבדה שלנו) ו/או כפתורי מיקרו-דיאליזה לגידול גבישים גדולים ואיכותיים המבוססים על ידע בדיאגרמת שלב ההתגבשות.

אופטימיזציה של צמיחת קריסטל עבור קריסטלוגרפיה מקרומולקולרית נויטרון

The use of neutron macromolecular crystallography (NMX) is expanding rapidly with most structures determined in the last decade thanks to new NMX ...

ישנן גישות התגבשות שונות להשגת גבישים גדולים ואיכותיים הן עבור רנטגן והן עבור קריסטלוגרפיה נויטרונית. אחת הגישות הללו היא שימוש בשיטת דיאליזה. בטכניקה זו, פתרון החלבון מופרד מתמיסת משקעים על ידי קרום חדיר למחצה.מולקולות המשקעים מפוזרות על פני הממברנה לתוך תא החלבון. כאשר תושג רוויית-העל הנכונה לגרעין ספונטני, הגרעינים הראשונים יופיעו. כאן, אנו נדגים פרוטוקול שיכול לשמש את OptiCrys מכשיר אוטומטי לחלוטין שפותח במעבדה שלנו המשתמש בהתגבשות דיאליזה מבוקרת טמפרטורה, וכפתורי הדיאליזה המיקרו שלנו לגידול גבישים גדולים ואיכותיים לקריסטלוגרפיה מקרומולקולרית טבעית המבוססת על ידע בתרשים שלב התגבשות.עבור כפתור מיקרו דיאליזה עם פיפט נפח microliter מסוימים 35 microliters של פתרון lysozyme לתוך תא הדיאליזה. נפח נוסף זה יוצר צורת כיפה קלה על גבי תא הדיאליזה ומונע היווצרות בועת אוויר. קח מוליך ומניחים את האלסטי או הטבעת בקצה של זה.מניחים את הממברנה על גבי התא ולתקן אותו על ידי העברת אלסטי או טבעת מן המוליך לגרוב של כפתור הדיאליזה. מעבירים את הכפתור לבאר המכילה את פתרון ההתגבשות. מכסים את הבאר עם תלוש כיסוי זכוכית או חתיכת קלטת.שמור את הדגימה ב 293 קלווין באינקובטור ווסת תרמי ללא רטט. הידיעה כי התגבשות הדיאליזה מציעה יתרונות מנקודת המבט של צמיחת גביש ספסל התגבשות מה שנקרא OptiCrys תוכנן ופותח במעבדה שלנו להציע שליטה משולבת אוטומטית לחלוטין של טמפרטורה הרכב כימי של ניסוי התגבשות biomolecular. אופטימיזציה של צמיחת הגביש על ידי OptiCrys מבוסס על דיאגרמות שלב ריכוז משקע הטמפרטורה.התגרענות מתרחשת באזור התגרענות בקרבת האזור metastable וצמיחת גביש ואז מתרחשים באזור metastable לאחר דיאגרמת שלב, עד ריכוז החלבון מגיע עקומת המסיסות המייצג את שיווי המשקל התרמודינמי בין פתרון גבישים. על ידי הפחתת הטמפרטורה במקרה של החלבון עם מסיסות ישירה או על ידי הגדלת ריכוז המשקעים במקרה של מלח החוצה להגיע, פתרון התגבשות נשאר באזור metastable ולא מתרחשת גרעין. גבישים גדלים עד שיווי המשקל של תמיסת הגביש השנייה להשיג ואחרי זה, אין עלייה נוספת בגודל של גבישים נצפתה.הפחתת הטמפרטורה או הגדלת ריכוז המשקעים חוזרת על עצמה מספר פעמים עד שהקריסטלים מגיעים לגודל הרצוי. מוסיפים את תמיסת החלבון לתא הדיאליזה של הטמפרטורה מבוקרת זורם להגדיר, לכסות את תא מעל עם קרום הדיאליזה ולתקן את הממברנה עם אלסטי או טבעת. הופכים את תא ההשתלטות ומניחים אותו על תא הדיאליזה.לחץ עליו בעדינות ובאיטיות כדי להסיר את כל האוויר לכוד בין שתי חתיכות, לתקן את המאגר במיקום שלו על ידי בעדינות דופק אותו על גבי התא מעל. מוסיפים את תמיסת ההתגבשות לתא המאגר ומכסים אותה בכובע האטום. העבר הרכבה זו והכניס אותו לתוך התמיכה בשד של ספסל התגבשות OptiCrys קריסטל צמיחה היא תוכנת פיקוח של OptiCrys ספסל התגבשות.הוא כולל ארבעה ממשקים גרפיים שונים או תצוגות שונות. תצוגת הבית מכילה לחצנים לניווט לתצוגות האחרות. מטרת ממשק ההתקנה היא להגדיר תרחיש ניסוי שניתן להפעיל באופן אוטומטי בתצוגת הבדיקה.התצוגה האחרונה היא תצוגת התחזוקה. כדי להפעיל מחדש ניסוי, תצוגת התחזוקה חייבת להיות פתוחה במקום שבו נמצאים כל הפרמטרים החיוניים עבור החלקים הפועלים מניסויי ההתגבשות. הגדל את הזוהר ממקטע האור, האור יכול לגדול מאפס, ללא אור ל-100 בהירות מרבית.לשליטה וניטור הטמפרטורה, נעשה שימוש בסעיף וסת הטמפרטורה. לחץ על הכפתור כדי להפעיל אותו. קבעו את הטמפרטורה במקטע נקודת ההגדרה והקש Enter.מתחת ללחצן זה, ישנם שני גרפים. האדום מציג את הסופי, טמפרטורת הסדר והגרף הצהוב מציגים את הטמפרטורה הנוכחית. ערבוב פתרונות מלאי, הזרקה של פתרון התגבשות לתא המאגר נשלטת על ידי סעיף פאלם.הוסף את הריכוז של פתרון המניה בשלב הראשון. לאחר מכן למצוא את הריכוז הסופי של כל פתרון לוקוס חדש ולהוסיף אותם למקטע הריכוז הסופי. לאחר לחיצה על כפתור החישוב, לגלות נפח של פתרון מלאי יחושב יוסיף בלוח נפח מול כל לוח ריכוז.לחץ על כפתור ההכנה להפעלה והמתן עד שהפתרון הראשי החדש יהיה מוכן. להחלפת פתרון ההתגבשות, לחצו על כפתור הזנת הפתרון. כדי לעצור את התהליך, לחץ על לחצן הפסק הפצה.בצד ימין של סעיף המיקרוסקופ, ישנם מספר לוחות לתיעוד מידע חשוב מכל ניסוי צמיחת גביש. הוסף שם חלבונים מתאים, משקל מולקולרי ומצב התגבשות בסעיף זה. הגדר שם לניסויים שלך פשוט על-ידי הקלדתו בשם התיקיה.במקטע תמונות nb, בחר את מספר התמונות שיש לצלם במהלך הניסוי. הוסיפו את מספר התמונות ומהחלונית מימין, בחרו בסולם שעון העצר. לחץ על לחצן התיקיה כדי לפתוח את התיקיה.בתיקיה זו, קיים קובץ טקסט המכיל את כל המידע שהגדרת קודם לכן עבור הניסוי שלך. תמונות המוכנות לכל טיפול נוסף נשמרות גם בתיקייה זו. זום את המיקרוסקופ יכול גם להיות מגוון באופן אוטומטי.משנה את גודל התצוגה באמצעות לחצן הפלוס והמינוס בחלק העליון של מקטע המיקרוסקופ כדי להגדיל או להקטין את ההגדלה בהתאמה. ישנן שלוש דרכים שונות למדוד את גודל הגביש. למדידת האורך או הרוחב השתמשו בווקטור הרוחב.בהתאם לצורת הגביש, ניתן לבחור את הכלים הספציפיים מהחלק השמאלי של מקטע המיקרוסקופ. כגון מלבני או מצולע. הערכים יופיעו במקטע המידה.בסט הניסויים הראשון, כפתורי מיקרו-דיאליזה היו שקועים בפתרונות התגבשות עם ריכוזי מלח שונים. בניסוי רשת התגבשות פשוט זה, המשתנה היחיד הוא ריכוז משקעים. בעוד הטמפרטורה נשמרת קבועה.שינויים קלים בריכוז המלח מאפשרים לחקור את דיאגרמת שלב ההתגבשות על ידי הגדלת ריכוז המלח מ-0.7 ל-1.2 עליות רוויה טוחנות והפתרון באזור הגרעין מתרחק מהאזור המגושה. כתוצאה מכך, וריאציה בגודל ובמספר הגבישים נצפית כאשר מספר הגבישים גדל וגודלם הולך ופוחת. בניסוי הראשון עם OptiCrys במצב ניסיוני נתון, לאחר שיווי המשקל בתא הדיאליזה להגיע, פתרון התגבשות הוא באזור התגרענות בקרבת האזור metastable של תרשים שלב התגבשות.כתוצאה מכך, רק גרעינים בודדים נוצרים בשלב הראשון של הניסוי. על מנת לשמור על צמיחת גבישים באזור metastable ולשלוט בתהליך צמיחת הגביש, הטמפרטורה שונתה במרווחי זמן שונים. בכל פעם שיווי המשקל של תמיסת הגביש הושלם, הטמפרטורה הייתה מגוונת.לכן הטמפרטורה ירדה ל 291 קלווין, 288 קלווין ולבסוף 275 קלווין כדי לשמור על הצמיחה של גביש נבחר באזור metastable. התוצאה של ניסוי זה היא גביש אחד גדול, עם הנפח הנדרש עבור קריסטלוגרפיה מקרומולקולרית טבעית. שני הניסויים הבאים מדגימים את היפוך ניסויי הדיאליזה מבוקרי הטמפרטורה לגרעין, צמיחת גביש, פירוק וצמיחה מחדש.בניסוי השני עם OptiCrys ההרכב הכימי של פתרון ההתגבשות נשמר קבוע באמצעות הניסוי והטמפרטורה השתנתה. הטמפרטורה הראשונית נקבעה על 291 קלווין. בשל רוויית-על גבוהה, מספר רב של גבישים קטנים הופיעו בתא ההתגבשות.בהתאם למושג מסיסות חלבון ישירה, על ידי הגדלה הדרגתית של הטמפרטורה ל 313 קלווין כל הגבישים היו מומסים. לבסוף, על ידי הורדת הטמפרטורה ל 295 קלווין, הגרעין השני יזם בקרבת האזור metastable ואפשר לשלוט בתהליך הגרעין וכתוצאה מכך להרכיב מספר נמוך יותר של גרעינים. צמיחת גבישים נוספת אפשרה ליצור אוכלוסייה אחידה של גבישים גדולים יותר.בניסוי זה, שינוי ההרכב הכימי של פתרון ההתגבשות בטמפרטורה מתמדת מוביל להשגת אוכלוסייה אחידה של גבישים גדולים יותר. מצב ההתגבשות היה דומה לניסוי הקודם. המסת הגבישים הושגה על ידי הורדת ריכוז NaCl בהדרגה מ 0.9 טוחנת לאפס.הפחתת ריכוז המלח שומרת על הפתרון באזור התת-רווי של דיאגרמת הפאזה שמובילה לפירוק הגבישים. ואז פתרון התגבשות חדש עם חוזק יוני נמוך יותר מאשר בעבר הוזרק לתוך תא המאגר. בריכוז משקעים זה מופיע המספר הנמוך יותר של גבישים והקריסטלים מגיעים לנפח גדול יותר מבעבר.כאן סיפקנו פרוטוקול מפורט המתאר הכנת מדגם והתאמת תוכנת הבקרה לגידול גבישים גדולים ואיכותיים עבור קריסטלוגרפיה מקרומולקולרית טבעית באמצעות מכשיר אוטומטי לחלוטין שפותח במעבדה שלנו. הליך שלב אחר שלב זה תוכנן ונהנה מהידע של דיאגרמת שלב ההתגבשות על מנת להפריד בין התגרענות לצמיחת הגבישים. יתר על כן, פרוטוקול לגידול גבישים עם דפוסי microcytosis מוצג גם באמצעות לחצני מקרוציטוזיס כחלופה כאשר OptiCrys אינו זמין.בנוסף לאסטרטגיות שציינתי עבור OptiCrys שינוי ההרכב הכימי של פתרון התגבשות וטמפרטורה וצילום תמונות צריך להיעשות באופן ידני. שימוש ברטט התרמי המווסת עבור החממה כדי לשמור על הטמפרטורה קבועה נדרש, וזה צעד קריטי במתודולוגיה שהוכח.

Research

JoVE Journal

Biology

Protein Crystallization for X-ray Crystallography

חלבון התגבשות של קריסטלוגרפיה רנטגן

Using the three-dimensional structure of biological macromolecules to infer how they function is one of the most important fields of modern biology. The ...

Isolation and Biophysical Study of Fruit Cuticles

בידוד מחקר Biophysical של cuticles פירות

The cuticle, a hydrophobic protective layer on the aerial parts of terrestrial plants, functions as a versatile defensive barrier to various biotic and ...

Harvesting and Cryo-cooling Crystals of Membrane Proteins Grown in Lipidic Mesophases for Structure Determination by Macromolecular Crystallography

קצירה וCryo-קירור גבישים של חלבונים בממברנה גדלו בMesophases Lipidic לקביעת מבנה על ידי קריסטלוגרפיה Macromolecular

An important route to understanding how proteins function at a mechanistic level is to have the structure of the target protein available, ideally at ...

In Vitro Analysis of PDZ-dependent CFTR Macromolecular Signaling Complexes

In Vitro Analysis of PDZ-dependent CFTR Macromolecular Signaling Complexes

בניתוח מבחנה של PDZ תלויי macromolecular תסביכים CFTR לשידור אותות

Cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR), a chloride channel located primarily at the apical membranes of epithelial cells, plays a ...

Iterative Optimization of DNA Duplexes for Crystallization of SeqA-DNA Complexes

איטרטיבי אופטימיזציה של דופלקסים DNA להתגבשות של מכלולי SeqA-DNA

Escherichia coli SeqA is a negative regulator of DNA replication that prevents premature reinitiation events by sequestering hemimethylated GATC clusters ...

Optimization and Utilization of Agrobacterium-mediated Transient Protein Production in Nicotiana

Optimization and Utilization of Agrobacterium-mediated Transient Protein Production in Nicotiana

אופטימיזציה וניצול<em&gt; Agrobacterium</emייצור חלבון חלוף&gt; בתיווך ב<em&gt; Nicotiana</em

Agrobacterium-mediated transient protein production in plants is a promising approach to produce vaccine antigens and therapeutic proteins within a short ...

Production of Human Norovirus Protruding Domains in E. coli for X-ray Crystallography

Production of Human Norovirus Protruding Domains in E. coli for X-ray Crystallography

הפקה של דומיינים בולטים norovirus אדם<em&gt; E. coli</em&gt; עבור רנטגן קריסטלוגרפיה

The norovirus capsid is composed of a single major structural protein, termed VP1. VP1 is subdivided into a shell (S) domain and a protruding (P) domain. ...

Medium-throughput Screening Assays for Assessment of Effects on Ca2+-Signaling and Acrosome Reaction in Human Sperm

Medium-throughput Screening Assays for Assessment of Effects on Ca2+-Signaling and Acrosome Reaction in Human Sperm

הקרנת מבחני עבור הערכה של השפעות על Ca2 +תפוקה בינונית-איתות ותגובה Acrosome זרע אנושי

Ca2+-signaling is essential to normal sperm cell function and male fertility. Similarly, the acrosome reaction is vital for the ability of a human sperm ...